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摘要

在这里,我们提出了一个协议,利用基于液滴的微流体单细胞RNA测序技术,从分离的人类胰腺胰岛生成单个细胞的高质量、大规模转录组数据。

摘要

胰腺胰岛由具有独特激素表达模式的内分泌细胞组成。内分泌细胞在适应正常和病理状况时表现出功能差异。该协议的目标是利用基于液滴的微流体单细胞RNA测序技术,生成每种内分泌细胞类型的高质量、大规模转录组数据。这些数据可用于在正常或特定条件下建立每种内分泌细胞类型的基因表达特征。该过程需要仔细操作、精确测量和严格的质量控制。在此协议中,我们描述了人类胰腺胰岛分离、测序和数据分析的详细步骤。约20,000个人类单小岛细胞的代表性结果表明,该协议的成功应用。

引言

胰腺胰岛释放内分泌激素来调节血糖水平。五种内分泌细胞类型在功能上和形态上各不相同,它们参与于这一基本作用:β细胞产生胰高血糖素、β细胞胰岛素、β细胞生长激素、PP细胞胰腺多肽和β-细胞ghrelin1。基因表达分析是在正常或特定条件下对内分泌细胞进行表征的有用方法。从历史上看,整个小岛基因表达分析是使用微阵列和下一代RNA测序2,3,4,5,6,7生成,8.虽然整个小岛转录组有助于识别器官特异性转录本和疾病候选基因,但它未能揭示每个小岛细胞类型的分子异质性。激光捕获微分型(LCM)技术已应用于直接从胰岛9、10、11、12获得特定细胞类型,但低于目标细胞的纯度人口。为了克服这些限制,荧光活性细胞分类(FACS)被用来选择特定的内分泌细胞群,如β-和β细胞13,14,15,16,17,18.此外,Dorrell等人使用基于抗体的FACS分类方法将β细胞分为四个亚群19。FACS排序的小岛细胞也可以镀出用于单个细胞的RNA测序;然而,基于板的方法在可伸缩性20,21,22方面面临着挑战。

为了生成各内分泌细胞类型的高质量、大规模转录组数据,我们应用微流体技术应用于人类小岛细胞。微流体平台以高通量、高质量和可扩展的方式23、24、25、26、27从大量单个细胞生成转录组数据。除了揭示大量捕获的细胞类型的分子特性外,高度可扩展的微流体平台还能在提供足够的细胞时识别稀有细胞类型。因此,该平台应用于人类胰腺胰岛允许分析ghrelin分泌β细胞,这是一种罕见的内分泌细胞类型,由于其稀缺性28,其功能鲜为人知。近年来,我们和其他一些人发表了几项研究,报告使用该技术29、30、31、32,人类胰岛的大规模转录数据。 33.这些数据是公开的,有用的资源为小岛社区研究内分泌细胞异质性及其在疾病的影响。

在这里,我们描述了一种基于液滴的微流体单细胞RNA测序协议,它被用于生成大约20,000个人类小岛细胞的转录组数据,包括β-、β-、β--、PP、β细胞,以及较小比例的非内分泌细胞32.工作流从孤立的人类胰岛开始,并描述了胰岛细胞分离、单细胞捕获和数据分析的步骤。该协议要求使用新鲜分离的小岛,并可应用于人类和其他物种(如啮齿动物)的小岛。使用此工作流,可以在基线和其他条件下构建无偏和全面的小岛细胞图集。

研究方案

1. 人类小岛分离

  1. 从15-80岁之间的男女尸体器官捐献者中分离出人类胰岛,没有预先存在的疾病,除非研究目的需要具有特定人口特征的捐赠者胰岛。
    1. 隔离后,将分离的小岛保存在组织培养设施中2-3天。通常需要超过 1 天的时间才能看到小岛损伤。
    2. 将小岛放入瓶子中,将其完全浸入胰岛介质中。通宵发货后,就把它运到实验室。
    3. 从胰岛供应商处获取已发货的小岛的胰岛等效数量 (IEQ)。
  2. 在小岛到达当天从装运中恢复胰岛。使用发动机罩执行此步骤,以尽量减少污染的可能性。
    1. 在冰箱中冷却完整的小岛介质(CMRL-1066,10%(v/v)FBS,1x Pen-链球菌,2 mM谷氨酰胺。
    2. 将胰岛从瓶子转移到 50 mL 锥形管。
    3. 将 10 mL 预冷却的完整胰岛介质添加到清空的瓶子中,以冲掉剩余的小岛。将介质转移到锥形管。
    4. 在 200 x g下将管离心 2 分钟以回收胰岛。用颗粒吸气上清液,留下约 1-2 mL 介质。
    5. 使用预冷却的完整胰岛介质重新挂起小岛。根据供应商提供的 IEQ,每 5000 IEQ 添加 12 mL 介质。
    6. 将小岛倒入介质中,放在10厘米未经处理的组织培养盘上。在37°C的组织培养箱中孵育过夜,在大气空气中孵化5%CO2。
  3. 分离小岛,如下所示。在隔夜孵育后执行此步骤。
    1. 预热前完成岛介质和细胞分离溶液。
    2. 在室温下制备含有0.04%BSA的1xPBS。
    3. 使用 P200 移液器计数和手动拾取 200-300 个小岛,并将小岛转移到包含 5 mL 预加热完整胰岛介质的 15 mL 锥形管中。
    4. 以200 x g离心收集胰岛2分钟。轻轻吸出上清液,而不会干扰底部的颗粒。
    5. 加入1.0 mL预加热细胞解散溶液,通过轻轻上下移液来破坏颗粒。在37°C下孵育小岛9-11分钟。每3分钟移液器上下缓慢移液10秒,将细胞分离成单个细胞。
    6. 一旦小岛细胞被很好地分离,溶液变得浑浊,加入9 mL完整的小岛介质,并通过30μm细胞滤网过滤到新的15 mL锥形管中。
    7. 用 2 mL 完整的胰岛介质清洗管和细胞滤网,以收集剩余的胰岛并添加到同一管中。
    8. 在400 x g下通过离心收集细胞5分钟。
    9. 轻轻吸出介质,将细胞颗粒重新悬浮在含有 0.04% BSA (PBS-BSA) 的 5 mL 1x PBS 中。
    10. 过滤通过新的30μm细胞过滤器到15 mL锥形管和离心机在400 x g5分钟收集细胞。
    11. 在200-300μL 1x PBS-BSA溶液中吸出上清液并重新悬浮细胞颗粒。
    12. 测量细胞浓度,并将体积调整到400-500细胞/μL的最终浓度。

2. 单细胞悬架质量控制

  1. 使用基于荧光的自动细胞计数器34确定细胞浓度。
    1. 将 10 μL 细胞与 0.5 μL AO/DAPI 混合。移液器彻底混合。将 10.5 μL 加载到幻灯片上,并运行细胞计数测定以确定计数和可行性。
    2. 根据需要根据细胞计数稀释和/或过滤细胞悬浮液。

3. 使用微流体芯片进行单细胞分治。遵循微流体芯片制造商35的协议。

  1. 将 3' 凝胶珠和逆转录 (RT) 试剂带入室温(>30 分钟)。如果需要,在 TE 缓冲区中重新组建 RT 引水器。
  2. 如表1所述,在低结合管中准备RT主混合物。
  3. 确定要为每个样本输入的单元格数。计算交付所需目标细胞数所需的细胞悬浮量 (X)。每个样品中添加的无核酸酶水的计算量为33.8-X μL。
  4. 对于要分区的每个样品,将33.8-XμL无核酸酶水加入0.2 mL PCR带管中。然后,将 66.2 μL 主混合物添加到每个条管中。此时不要将细胞添加到带管中。移液器轻轻混合。将准备好的带状管放在冰上。
  5. 将微流体芯片放入芯片盒中。将芯片外壳定向,确保油井(行标记 3)最接近执行实验的人员。
  6. 如果运行少于 8 个样本,请使用 50% 甘油按以下顺序填充未使用的通道:
    1. 为所有未使用的通道在第 1 排的井中加入 90 μL 的 50% 甘油。
    2. 为所有未使用的渠道在第 2 排的井中加入 40 μL 的 50% 甘油。
    3. 为所有未使用的渠道在第 3 排的井中加入 270 μL 的 50% 甘油。
  7. 将凝胶珠卡入涡中。涡旋以全速工作30s。多次敲击台面上的带子以收集珠子。确认不存在气泡。
  8. 将X μL细胞加入制备的带状管中。移液器混合5次。在不丢弃移液器尖端的情况下,将 90 μL 的电池混合物转移到芯片的第 1 排。
  9. 等待 30 s,然后将 40 μL 的凝胶珠加载到第 2 行。移液器非常缓慢,为这一步。向第 3 排的井中分配 270 μL 的分区油。
  10. 将芯片垫片钩到芯片支架的卡舌上。将组装的芯片支架放入单单元分区设备中,然后按下运行按钮。
  11. 运行完成后,立即拆下组装的芯片支架。
  12. 从支架上拆下芯片垫片,以 45° 角打开芯片盒,并将芯片中的 100 μL 乳液取出至蓝色塑料 96 孔板中。

4. 单细胞cDNA扩增。遵循微流体芯片制造商35的协议。

  1. 反向转录。
    注:在清洁的PCR罩下执行此步骤,以防止未扩增的cDNA受到微生物和其他污染。
    1. 用铝箔密封在加热板密封器上密封 96 孔蓝色板。
    2. 在热循环器中运行逆转录反应,如下所示:53 °C,45 分钟 ~ 85 °C,保持 5 分钟 = 4 °C 保持。
      注:这是一个安全停止点。样品可在4°C下保存长达72小时。
  2. RT 后纯化
    1. 将核酸结合磁珠和核酸大小选择磁珠带到室温和涡流中重新悬浮。此时,在 65°C 下将样品清理缓冲液解冻 10 分钟。将所有其他试剂带到室温和涡流。
    2. 如表 2和表 3所示,准备缓冲区。
  3. 化学破坏乳液和纯化。
    1. 为此,请轻轻地从板上取下铝箔密封。
    2. 将125 μL的粉红色乳液分解试剂放入每个乳液中。等待 1 分钟,然后将整个体积转移到干净的 0.2 mL 带管。确保带管中有一层清晰和粉红色。
    3. 从带管底部取下 125 μL 的粉红色层,而不会干扰透明层。粉红色层的小体积(±15 μL)留在管中是正常的。
    4. 将表2的200 μL清理混合物加入带状管,在室温下孵育10分钟。
    5. 将带状管转移到磁性支架,使溶液清除。去除上清液并丢弃,然后用80%乙醇洗涤珠子两次。让珠子干燥 1 分钟。
    6. 从磁铁上取下带管,从表 3向磁珠添加 35.5 μL 的洗脱溶液。移液器以在溶液中重新悬浮珠子。在室温下孵育2分钟。
    7. 将带状管转移到磁性支架,使溶液清除。从带管中取出纯化的 cDNA 并将其分配以清洁 0.2 mL 条带管。
  4. 放大cDNA。
    1. 在下面的表4中准备扩增主混合物。
    2. 在每个样品中加入65μL的cDNA扩增主混合物。将带状管放入热循环器中并运行以下程序:98 °C 3 分钟 = 15 个循环 [98 °C 15 s ] 67 °C 20 秒 = 72 °C 1 分钟 * 72 °C 5 分钟 = 4 °C 保持
      注:这是一个安全停止点。样品可在 4°C 下保存长达 72 小时。
    3. 用0.6x核酸大小选择磁珠来纯化放大的cDNA。用80%乙醇洗涤两次,用40.5 μL洗净。
    4. 使用自动凝胶电泳和基于荧光的DNA定量测定36,37运行质量控制cDNA。
      注:这是一个安全停止点。样品可在4°C下无限期保存长达72小时或-20°C。

5. 测序库建设

  1. 标记和清理cDNA38。
    1. 在总体积的 20 μL 中将 cDNA 标准化为 50 纳克。在此步骤中,精确定量至关重要。
    2. 使表 5中的标记混合,在冰上对每 20 μL cDNA 样品进行等分 30 μL。将样品放入热循环仪并运行标记协议:55 °C 5 分钟 = 10 °C 保持。
    3. 使用列38执行标记的 cDNA 的清理。在每个样品中加入180μLDNA结合缓冲液。将 230 μL 传输到旋转列。
    4. 在 1300 x g下离心 2 分钟,然后丢弃流过。
    5. 用300μLDNA洗涤缓冲液洗涤两次。在 1300 x g下再离心 2 分钟,以确保去除乙醇。
    6. 通过在柱中加入31μL洗脱缓冲液,在室温下孵育2分钟,将洗脱标记成cDNA。
    7. 在1300 x g下离心2分钟,以回收纯化产物。
  2. 样本索引 PCR。
    1. 选择在多路复用排序运行期间不重叠的条形码。
    2. 制作样本索引 PCR 主组合,如表 6所示。
    3. 将60μL的样品指数PCR主混合物加入30μL的纯化样品。
    4. 在每个样品中添加 10 μL 的 20 μM、4 寡核样品索引(使用记录索引)。总反应体积现在是100μL。
    5. 将盖子设置为 105 °C,放入热循环器中。运行以下程序: 98 °C 45 s = 12-14 周期 [98 °C 20 s ] 54 °C 30 秒 = 72 °C 20 s= = 72 °C 1 分钟 = 4 °C 保持。
      注:这是一个安全停止点。样品可在4°C下保存长达72小时。
  3. 用双珠清理净化库。
    1. 将100 μL的核酸大小选择磁珠添加到样品中,并与移液器彻底混合。在室温下孵育5分钟。
    2. 转移到磁铁,让它站立,直到溶液清除。拆下并丢弃上清液。
    3. 用200 μL的80%乙醇洗涤两次。
    4. 将磁体上的磁珠干燥 2 分钟,从磁铁中取出,并将 50.5 μL EB 缓冲液添加到珠子颗粒中。移液器以在缓冲液中重新挂起珠子。
    5. 在室温下孵育2分钟,转移到磁铁上,让站立2分钟。将50μL的洗脱样品转移到干净的带管中。
    6. 将40μL核酸大小选择磁珠加入样品,并在室温下孵育5分钟。清除并丢弃上清液。
    7. 用125 μL的80%乙醇洗涤两次。
    8. 将磁体上的磁珠干燥 2 分钟,从磁铁中取出,并将 60.5 μL EB 缓冲液添加到珠子颗粒中。移液器以在缓冲液中重新挂起珠子。
    9. 在室温下孵育2分钟,转移到磁铁中,让它站立2分钟。将50μL的洗脱样品转移到干净的带管中。这是最后的库。
    10. 将样品在4°C下无限期保存长达72小时或-20°C。请注意,这是一个安全停止点。
  4. 使用自动凝胶电泳和基于荧光的DNA定量测定36,37对最终库进行量化和运行质量控制。在运行质量控制之前,稀释样品 1:10。

6. 库序

  1. 将每个样本标准化,将每个样本测序到 2 纳克/μL,并将每个归一化样品的池 3 μL 归一个。
  2. 使用基于荧光的DNA定量测定37测量池浓度。
  3. 将池稀释至 0.25 纳克/μL。
  4. 使池的性质变性如下:12 μL 的稀释池样品 (0.25 纳克/μL) = 1 μL DNA 控制 (1 nM),2 μL EB 缓冲液 = 5 μL NaOH (0.4N)。让此孵育 5 分钟,然后加入 10 μL 的 200 mM Tris pH 8.0。
  5. 负载 4.05 μL 到 1345.95 μL HT1。将 1.3 mL 加载到音序器的盒中,并使用 26 周期(读取 1)+ 8 个周期(i7 索引) + 0 个周期(i5 Index) = 55 个周期(读取 2)的排序配方,按照制造商的准则39运行。

7. 读取对齐(补充文件 1)

  1. 运行单元游侠 (v2.0.0) 以去复用原始基础调用 (BCL) 文件,这些文件通过排序到 FASTQ 文件。将FASTQ文件与人类B37.3基因组组装和UCSC基因模型对齐,以获得表达定量。
  2. 校准质量控制。
    1. 生成对齐指标并检查 Q30 基础、有效条形码分数、单元格相关的读取分数、映射读取分数和在每个单元中检测到的读取。
    2. 检查条形码排名图,确保与单元相关的条形码和背景分离。

8. 数据分析(补充文件2)

  1. 细胞质量控制和预加工。
    1. 排除具有 < 500 检测到基因的细胞,< 3000 唯一分子标识符 (UMI) 的总数,> 0.2 活力评分,如前面所述32。根据组织和细胞类型调整截断。
    2. 拆下双子。
      1. 使用R评估双模态表达模式的五个内分泌激素基因(胰高血糖素-GCG,胰岛素-INS,生长激素素-SST,胰腺多肽-PPY和ghrelin-GHRL)的双模态表达模式包装mclust40.
      2. 去除表达多个激素基因的细胞,即在高表达模式下具有两个或两个以上激素基因。
    3. 使用R包Seurat41将基因表达按总UMI标准化,并在细胞水平上乘以10,000的比例因子。
    4. 去除在少于3个细胞中检测到的基因。
    5. 使用所有细胞的平均表达和分散检测可变基因。根据组织和细胞类型调整截断。
  2. 使用可变基因执行主要成分分析。具有选定数量的主要组件的群集单元。通过将一个细胞簇与其他细胞进行比较来推导出细胞簇富集基因。

结果

单细胞RNA测序工作流程包括三个步骤:将完整的人类胰岛分离成单个细胞悬浮液,使用基于液滴的技术捕获单个细胞,以及分析RNA-seq数据(图1)。首先,获得人类胰岛在一夜之间孵育。完整的胰岛在显微镜下被检查(图2A)。分离的斜岛细胞的完整性已经使用RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)得到验证。如图2B所示,分别使?...

讨论

近年来开发的单细胞技术为描述细胞类型和研究人类胰腺胰岛分子异质性提供了新的平台。我们采用了基于液滴的微流体单细胞分离和数据分析方案来研究人类胰岛。我们的协议成功地从超过20,000个单人类小岛细胞中生成了RNA测序数据,在序列质量和批次效应方面变化相对较小。

特别是,在该协议中,两个步骤对于高质量结果至关重要。分离人类胰岛时,需要谨慎。重要的是不要?...

披露声明

所有作者都是雷诺制药公司的雇员和股东。

致谢

没有

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Cell strainer
8-chamber slidesChemometec102673-680Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626for QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirtedVWR47744-112Emulsion plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRIsolated human islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854for QC
Solution 18Chemometec103011-420Cell counting assay reagent
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm)VWR10861-594for islet culture
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactionsVWR77001-152Library clean up columns

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