调整降解以实现特定和高效的蛋白质消耗

摘要

在这里,我们提出一个协议,使用β-est AID系统,有效和具体地耗尽酵母糖精中感兴趣的蛋白质。

摘要

植物辅助素结合受体 TIR1 可识别含有特定辅助诱导脱粒 (AID) 在辅助素存在时的蛋白质,针对它们进行降解。该系统在许多非植物真核生物中被利用,因此,一种带有AID图案的目标蛋白在添加辅助物后降解。TIR1表达式的级别至关重要;即使缺乏辅助蛋白,过度的表达也会导致AID标记的蛋白质降解,而低表达会导致缓慢耗竭。建立了β-雌二醇诱导AID系统,在β-雌二醇诱导启动子的控制下表达TIR1。在添加辅助剂之前,通过改变使用β-雌二醇的孵育时间,TIR1的含量是可调的。该协议描述了如何使用AID系统快速耗尽目标蛋白质。适当的β-雌二醇孵育时间取决于靶蛋白的丰度。因此,有效耗竭取决于最佳时序,这也最大限度地减少了与辅助剂无关的损耗。

引言

条件突变,如温度敏感突变体,是研究基本蛋白质的有力工具,允许在允许条件下细胞生长,但在不容许的条件下导致功能丧失。然而,细胞代谢可能严重干扰生长条件的变化,需要诱导缺陷,也可能产生偏离目标的影响。已经开发出几种方法,其中感兴趣的蛋白质有条件地隔离1,或者通过添加小分子控制^其表达2,3。该协议使用辅助蛋白和辅助诱导脱粒 (AID) 系统来有效耗尽目标蛋白质。

AID系统起源于植物,其中一种辅助蛋白(在本议定书中使用indole-3-醋酸(IAA),刺激Aux/IAA蛋白与TIR1的相互作用,TIR1是SCF U3泛性联苯复合^物4的成员。SCF复杂相互作用导致Aux/IAA家族蛋白多聚体化,导致其降解为蛋白酶体5,6。

该系统以前被改造用于酵母糖精^7,8通过表达来自酵母细胞的 Oriza sativa (osTIR) 的 TIR1 蛋白质, 在那里它能够与内源酵母相互作用SCF 复合体。感兴趣的蛋白质被标记从Aux/IAA蛋白IAA17的图案,以瞄准它的降解。IAA17 的功能截断后来被开发,如 AID®^8、9、10,包含来自阿拉伯拟南芥IAA17的 43 个氨基酸辅助素敏感主题,以及一个表位标记,以启用检测。

该系统最初适应在萌芽酵母7,8表达的osTIR1蛋白质从酵母GAL启动子。表达需要转向生长介质,以角质素作为唯一的碳源,不幸的是,这导致了二次转移,细胞代谢发生了广泛的^变化11。另一方面,据报道,TIR1的构成表达在缺乏辅助蛋白/IAA¹²的情况下,如果表达水平高,则可能导致目标蛋白降解,而低TIR1表达会导致低效耗竭。开发了一种名为β-est AID的改进AID系统,其中osTIR受一个可调节的诱导启动子控制,该启动子可调谐到靶蛋白,对细胞代谢的影响最小。为此,构建了一个人工转录因子(ATF),其中VP16病毒转录活化剂与雌激素受体和四个Zn手指DNA结合域(DBD)融合。当β-雌二醇(雌激素)存在时,ATF可以进入细胞核,并通过与启动子(Z4EVpr)13、12结合来诱导osTIR转录。

在加入β-雌二^醇12后,osTIR表达通常可检测到约20分钟。然而,osTIR表达的最佳持续时间,以实现有效消耗带辅助蛋白的标记蛋白,同时在添加辅助蛋白之前避免耗竭,需要为每个目标蛋白进行经验测定。这种预孵育的大致时间可以从糖霉菌基因组数据库中的丰度值(SGD https://www.yeastgenome.org/)中估计。如图1所示,丰富的蛋白质Dcp1(2880至4189分子/细胞)需要40分钟的β-雌二醇预孵育,没有观察到与辅助素无关的消耗。较不丰富的蛋白质Prp2(172至211分子/细胞)在预孵育后仅20分钟就严重耗尽。建议在此初始估计时间之前或之后测试两个额外的预孵育时间(20 分钟是建议的最短时间)。最佳预孵育时间是靶蛋白在添加辅助蛋白之前没有耗尽的时间,一旦添加辅助蛋白,消耗是可以接受的,或者蛋白质水平接近可能达到的最低水平。因此,从图1b,对于预孵化30分钟的Prp22,在添加辅助后10分钟的水平没有下降多少。与40分钟的预孵育和15分钟的IAA相比,在几乎没有额外消耗的情况下,用超过10分钟的辅助剂孵育或超过30分钟的预孵育没有好处,特别是因为有证据表明非辅助性依赖在40分钟内耗尽。对于预孵育40分钟的Dcp1(在添加辅助剂之前蛋白质水平约为100%的最后一点),使用辅助蛋白消耗15至20分钟是可以接受的。建议尽量缩短耗竭时间,以减少对细胞代谢的二次^影响14。

本文演示如何使用β-est AID系统,通过优化osTIR表达β-雌醇孵育的时间,在添加辅助蛋白之前,在IAA添加时实现快速目标蛋白质消耗而不消耗。

研究方案

注:有关图形摘要,请参阅图2。

1. 应变准备

1. 使用ura3-应变,引入β-est AID系统(即编码β-雌二醇反应转录因子(ATF)和osTIR的基因),并标记目标蛋白的AID®(参见图3和表1,了解该过程的摘要)。
   1. 将¹⁵ pZTRK(G418 电阻标记)或 pZTRL(LEU2 标记)质粒(可从酵母遗传资源中心获得)转换为ura3-酵母菌株,或使用质粒作为模板生产用于基因组的 PCR 产品集成。
   2. PCR 使用来自 pZTRK 或 pZTRL 的质粒中的高保真聚合酶放大 ATF(在质粒图图上标记的 Z4EVATF)和 osTIR。使用引物与50至60碱基3'扩展与同源基因组区域,通过同源^重组16直接集成。有关两个组分的基因组集成,请参阅表 1了解引体和条件。
      注:菌株pZ4EV-NTR1的成分已经集成到基因组中(可从日本酵母遗传资源中心获得)。
   3. 确保使用 Longtine 过程¹⁷标记目标蛋白 ID+(参见图 3b和表 1)。
   4. 在没有β-雌二醇和IAA存在的情况下对菌株执行生长分析,以确定AID®标签是否影响生长,并预测在步骤1.5中使用的生长速度。

2. 消耗的一般程序

1. 计算收集所有样本所需的区域性;例如,OD₆₀₀的 0.8 的培养值为 10 mL,足以用于单个样本的蛋白质、RNA 和 DNA 提取,因此对于 6 个样本,至少需要 60 mL 培养。
2. 从隔夜培养,在 OD₆₀₀ 0.1 到 0.2 处建立足够的新培养,并在 30°C 下保持增长。建议使用丰富的培养基,如YPDA,但可以使用其他生长条件:

   酵母提取物	12 %
   蛋白胨	20克
   葡萄糖	20克
   亚胺硫酸盐	40毫克
   H2O 到	1 升

   
   注:高压灭菌或过滤器灭菌;过滤器灭菌是首选的肽/糖复合物,通过高压灭菌沉淀物在样品收集中使用的甲醇。
3. 准备接收样品。
   1. 将甲醇的预期样品量的30%至50%放入管中。例如,如果要采集 10 mL 样品,将 5 mL 甲醇放入 15 mL 猎鹰管中,并紧闭管。关闭后,将管子贴上标签,放在干冰上或-80°C冷却。
      警告:将甲醇在烟机罩中分配。
   2. 标记 1.5 mL 管,用于长期储存样品,并放入冰中冷却。
   3. 在冰上冷却足够的 H₂O(每个样品至少 1 mL)。
4. 预测文化的发展。收集样本的目标OD约为0.7至0.8,但孵育前步骤(用β-雌二醇诱导osTIR的孵育)需要更早开始,以便培养在样品时达到大约正确的OD收集。
   注:建议在实验中使用的条件中执行增长曲线,以便可以估计此起始 OD。
5. 一旦达到预孵育开始的目标OD,将样品(通常为10 mL)放入含有冷甲醇的预制备管中。短暂反转以混合并放回干冰中。
   注:如果方便的话,样品可以在大约5分钟后移动到水冰中。
6. 立即加入β-雌二醇,1μL/mL培养(最终浓度为10μM);在移液器中预测了β-雌二醇,以便减少收集样品和添加β-雌二醇之间的时间。通过剧烈旋转快速混合。
7. 继续像以前那样种植培养(步骤2.2),用β-雌二醇孵育(这是"预孵化"步骤),以达到最佳时间(用于确定最佳预孵育时间,见图1)。
8. 准备添加 IAA(辅助剂)。占用步骤 2.10 所需的 IAA 量(即每 mL 培养值 0.5 μL 的 IAA)。这使得步骤 2.20 更快。
9. 作为步骤 2.5 收集示例。
10. 立即将 IAA 0.5 μL/mL 的培养值添加到步骤 2.8 中准备的 750 μM 最终浓度中。通过剧烈旋转快速混合。
11. 根据您的实验设计,按照步骤 2.5 收集样品。要么是单个样品,在预期蛋白质将可靠地耗尽时,要么在一个耗尽的时间过程中有多个样品。例如,5 分钟间隔便于计时,并提供一系列蛋白质水平。如图1所示,优化策略将给出适当时间的指示。
12. 处理样品。
    1. 将样品放在冰上,如果尚未完成。确保没有样品冻结;如果有,轻轻温暖在手,不断反转,使温度不上升局部。
       注:这是最好的做手,因为样品的温度可以评估,它应该总是感到寒冷。放在冰上。这不是暂停点 - 一旦所有样本都是流动的,继续执行下一步。
    2. 收集所有样品且不再冷冻后,以 3,500 x g旋转 2 分钟(如果可能为 4°C)。
    3. 倒掉甲醇/中混料,放回冰上;如果所有液体都已去除,请不要担心。
    4. 将细胞颗粒悬浮在 1 mL 的冰冷 H₂O(从步骤 2.3.3)中,并转移到冰上标记的 1.5 mL 管(步骤 2.3.2 中准备)。
    5. 以 >15,000 x g的时间短暂旋转(例如,总时间 10 s),以重新颗粒细胞,放回冰上并去除液体。
    6. 通过吸入拆下 H₂O。细胞颗粒可储存在-20°C或-80°C进行长期储存。
13. 检查蛋白质已经耗尽的水平由西方斑点^分析18。
    注:对于大多数目的,可以从单个细胞颗粒中提取足够的^蛋白质19和/或核酸,尽管稀有的RNA物种可能需要更多的样本量。

结果

消耗的代表性示例如图1所示。图中提出的三个实验是Pp2、Prp22和Dcp1蛋白质消耗的优化实验。低丰度,乘以体Prp2和Prp22蛋白在40分钟预孵化后,用β-雌二醇先于20%后耗尽至20%以下,随后与辅助蛋白一起耗尽15分钟。较长的预孵育时间会导致更快的耗竭,但在添加辅助剂之前也表现出不良的蛋白质消耗。相比之下,较丰富的Dcp1在相同处理下仅耗尽至约30%,但60分钟的预孵化后,在相同辅助剂处理下,以添加辅助剂之前耗尽为代价,导致消耗至13%。使用β-雌二醇进行50分钟的预孵育和15分钟的辅助蛋白可能在较短的时间点内取得类似的结果,因此可能更为理想。

图1:通过调节β-雌二醇预孵育的持续时间,可以调整消耗率。西方^斑点18靶蛋白:(a和b)Prp22-AID_-6FLAG,(c和d)Prp2-AID_-6FLAG,以及(e和f)Dcp1-AID_-6HA,来自预孵化的β-雌二醇(β-est)培养物,为20、30、40或60分钟前,辅助^添加12。每条巷子里都装有等量的总蛋白质。Pgk1 被检测为可视加载控件,但面板e除外,其中 Pgk1 和 Dcp1 共同迁移。面板a、c和e中蛋白带的定量分别显示在b、d和f面板中。 作为损耗率的度量,计算每个曲线的线性截面(从初始值的 100% 到 30%)的斜率 (m)。最佳预孵育时间是蛋白质水平仍然接近非诱导水平的时间(100%)和随后的消耗速度很快。对于Dcp1( f), 60分钟的预孵育时间太长,因为蛋白质已经开始降解,在缺乏辅助蛋白,而20分钟太短,因为蛋白质不会明显耗尽在这段时间内。在预孵育40分钟后,15分钟使用辅助蛋白,因为蛋白质大约70%耗尽,虽然20分钟会导致进一步耗尽,但也可能导致二次效应。误差条表示两个生物复制的标准偏差。对于每个实验,将显示一个代表性的斑点。此图派生自以前的出版物⁹。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:图形摘要。在富培养基和所需温度下生长的足够培养基中加入β-雌二醇,以便开始预孵育。在加入IAA(辅助剂)开始耗尽之前,在所需的预孵育时间内继续增长。孵化前和耗尽时间取决于要耗尽的蛋白质,但预孵育时间通常在20-60分钟之间,消耗时间一般在10至20分钟之间。g 耗竭。这些样品在颗粒和储存前被快速固定在冷甲醇中。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:B-est 系统的应变生成。(a) 要使用 AID® 系统(pZTRL(LEU2) 或 pZTRK(卡纳霉素 (G418) 抗性)生成酵母菌株,应将质粒引入菌株,或者,ATF 和 osTIR 可插入到基因组中。PCR从3'端引物生成的片段的同源重组(参见图3b和表1)。(b) 靶蛋白的C端标记是通过PCR扩增的质粒pURA3-AID_-6FLAG(pURA3_AID_-6HA仅在标记中不同,可以以完全相同的方式处理),使用长汀引基锡S3-F和S2-R 与 3' 扩展同源到目标蛋白的 3' 端。前引基扩展应包括最后一个氨基酸科顿在框架与AID®标签的开头,并且不得包括停止科顿。反向引信扩展应为编码区域下游的区域。一旦插入基因组,失去URA3标记的细胞(通过在标记两端发现的相同区域之间的同源重组)可以通过5-FOA的生长来选择,即反选择URA3细胞。请点击此处查看此图的较大版本。

a. 引子序列
目标	位置	底漆	名字	序列			Tm (°C)
pZTRL	516	F	pZTRL_F	<-同源区->GCGACAGCATCACCACACTTCG			61.23
	7897	R	pZTR_R	CGCCGCCTCTCTGCAGA<-同源地区(RC)->			61.30
pZTRK	9154	F	pZTRK_F	<-同源地区->ACGTGAGCCATATATATATTGCGCCCCC			59.40
	5897	R	pZTR_R	CGCCGCCTCTCTGCAGA<-同源地区(RC)->			61.30
pURA3-AID_-6FLAG 或 pURA3_AID_6HA		F	S3-F	<-同源区->CGTACGCAGCGAC			59.21
		R	S2-R	同源地区(RC)->			52.76
pZRTL/K 用于放大 +-est AID 系统
pURA3-AID®-6FLAG/6HA 放大AID®和表位标记目标蛋白(龙汀程序)
<-同源区 ->			与要插入系统的侧翼区域的区域同源。该区域越长,修改成功的可能性就越大;建议使用 50 - 100 个底座。
<-同源区 (RC) - >			区域与要插入系统的侧翼区域同源,请记住使用反向补码。如上所述,这个区域越长越好。
Tm (°C)			使用 %GC 方法的 Tm 50 mM NaCl
b. PCR 混合
组件				体积 (μL)
模板				<10
NEB Phusion HF 缓冲器 (5x)*				100
正向底漆 100 μM				2.5
反向底漆 100 μM				2.5
dNTP 每个 10 mM				10
H2O				到 500
• 也可以使用 NEB Phusion GC 缓冲器 (5x),但不可取
制作这种混合物,分成10个管,每个50μl混合,并执行PCR作为表1 c。
通过在胶凝剂上运行来检查 PCR 的工作
将所有成功反应组合成一管和乙醇沉淀物
使用 PCR 生产的所有材料对酵母进行转化
c. PCR 条件
步						温度 (°C)	时间
初始变性						98	30 s
25-35 周期			变性			98	10 s
			退火			45~60	20 s
			扩展			72	30 s/kb
最终扩展						72	10分钟
保持						8
对于龙汀底漆集(S3-F 和 S2-R),在 45°C 时退火,pZTRL/K 底漆的发火温度为 60°C
对于龙汀 PCR 延长 3 分钟,对于 pZTRL/K 延长 3 分钟

表1:底漆序列、PCR混合物和PCR条件。

讨论

优化良好的方案可以产生目标蛋白的快速和高效消耗。确定使用β-雌二醇的近似预孵育时间很重要,因为这增加了耗竭的可重复性,但可以容忍预孵育时间的微小变化。另一方面,由于蛋白质水平下降非常迅速,在添加辅助剂后必须注意时间。

这种方法的一个优点是,通过不同的预孵育时间与β-雌二醇和IAA孵育时间的组合,可以实现调谐的消耗。例如,如果需要,通过减少预孵育时间,目标蛋白可以更缓慢地耗尽。

与 OsTIR 构成的系统系统相反,β-est AID 系统具有某些优势。例如,如果靶蛋白对生存至关重要,则 osTIR 的调节表达可以避免目标蛋白过早耗尽。此外,osTIR的表达可以调整,以适应目标蛋白的丰度和降解的易感性,并且消耗可以是快的,也可以是缓慢的。与拉帕霉素不同,两种小分子效应器β-雌二醇和辅助素,在这里使用的条件下不会干扰酵母代谢,不像在锚离^系统1中使用的雷帕霉素。

应该注意的是,标记一些蛋白质会破坏它们的功能,这是任何目标耗尽系统的问题。在这种情况下,当 C 端标记不起作用时,N 终端标记可能工作。此外,并非所有蛋白质都会被有效耗尽;例如,目标蛋白上的 AID 标记可能无法访问 osTIR 蛋白。因此,在AID标记后,在优化β-雌二醇预孵化和辅助素处理的时间之前,应测试每个靶蛋白对生长标记的任何影响,并确定消耗是否有效。

此 AID® 系统非常简单,可与任何不涉及进一步生长的后续实验程序兼容,例如蛋白质、DNA 或 RNA 分析或显微镜。此外,该系统与硫标签结合,以纯化新生的RNA²⁰时效果良好。

该系统提供了一种快速、具体和可重复的方法,在不影响酵母细胞代谢的情况下消耗蛋白质。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine sulphate	Formedium	DOC0230
Agar	Formedium	AGA03
Β-estradiol	Sigma Aldrich	E2758-1G	10 mM solution in ethanol. Store at -20 °C
DMSO	Alfa Aesar	42780	DMSO should be solid at 4 °C
Glucose	Fisher Scientific	G/0500/60
IAA 1H-Indole-3-acetic acid	Across Orgainics	122150100	Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 °C.
Methanol	Fisher Scientific	M/4000/PC17	CAUTION Toxic and flammable
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530
Peptone	Formedium	PEP03
SCSM single drop-out –ura	Formedium	DSCS101
Yeast Extract	Formedium	YEA03
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate	Formedium	CYN0410