在彗星分析中使用冷冻组织评估DNA损伤

摘要

该协议描述了在尸体解剖时准备高质量冷冻组织样本以评估DNA损伤的几个程序:1） 切碎组织，2） 从胃肠道刮掉上皮细胞，3） 块状组织样品，需要使用组织切碎装置进行均质化。

摘要

彗星测定越来越受欢迎，作为评估培养细胞和组织DNA损伤的一种手段，特别是在接触化学物质或其他环境压力因素之后。2014年通过了经济合作与发展组织（OECD）测试指南，推动了彗星检测在啮齿动物基因毒性可能性监管测试中的使用。彗星测定幻灯片通常是在尸体解剖时从新鲜组织制备的;然而，冷冻组织样本可以避免与同时制备每只动物和许多动物的幻灯片相关的后勤挑战。冷冻还允许将样品从暴露设施运送到不同的实验室进行分析，而冷冻组织的储存有助于推迟为特定器官生成DNA损伤数据的决定。碱性彗星测定可用于检测与暴露相关的DNA双绞线和单链断裂、碱性拉片病变以及与不完全DNA切除修复相关的绞线断裂。然而，DNA损伤也可能由机械剪切或不当的样品处理程序造成，混淆了测定结果。由于实验室人员在为彗星测定采集组织方面具有不同程度的经验，因此在尸体解剖期间收集和处理组织样本的可重复性可能难以控制。通过进修培训或部署配备经验丰富的实验室人员的机动单位来增强一致性成本高昂，而且可能并不总是可行的。为了优化彗星检测分析的高质量样品的一致生成，评估了一种使用定制组织切碎装置对闪冻结组织块进行均质化的方法。用这种方法为彗星检测准备的样品在质量上与在尸检期间切碎制备的新鲜和冷冻组织样本相比，质量优视。此外，在长期储存后，从冷冻组织立方体的细胞中测量低基线DNA损伤。

引言

彗星测定越来越多地被用作评估受培养细胞和组织DNA损伤的手段，这些细胞和组织暴露于化学物质或其他环境压力因素^1。该测定可以检测DNA双绞线和单链断裂、碱性病变和与不完全DNA修复相关的单股断裂。国际药物药物技术要求协调委员会（ICH）药物测试指南建议DNA链断裂测定，如彗星测定作为第二次测试，以补充啮齿动物红细胞微核测定，以评估体内基因毒性，并作为后续测试，以评估肿瘤诱导²的目标器官的作用模式。欧洲食品安全局（EFSA）建议体内彗星测定作为一个合适的后续测试，以调查体外基因毒性试验³阳性结果的相关性。2014年，经合组织批准了啮齿动物彗星测定测试指南，从而提高了该测定在基因毒性电位监管测试中的可接受性。该测定基于从裂解细胞的细胞核素迁移的放松DNA回路和片段的电泳分离。基本上，单个细胞嵌入在阿加罗斯中，这种细胞被分层到显微镜幻灯片上。然后，幻灯片浸入滑管中，然后浸入碱性 （pH > 13） 溶液中，使紧密卷曲的核 DNA 放松和放松。然后，幻灯片被放置在电场中，刺激带负电荷的DNA向阳极迁移，产生类似于彗星的图像;彗尾与彗星头的相对DNA量与DNA损伤量成正比;尾部的DNA含量通常使用数字成像软件进行量化。

由于彗星测定检测成碎片DNA，因此，由治疗引起的细胞毒性或应力引起的染色质分裂或凋亡可能混淆暴露引起的DNA损伤。此外，DNA损伤可能由于机械剪切或不当的样品处理^4。在幻灯片准备之前保持收获的组织冷藏的重要性，以尽量减少DNA损伤的基线水平，此前已经证明^55，6。6许多实验室准备来自新鲜组织的彗星测定幻灯片;然而，在与大量动物的研究中，在准备每只动物的多种组织类型的幻灯片时，这在后勤上可能具有挑战性。此外，当在远程实验室进行幻灯片准备和分析时，这就提出了一个问题，需要装运样品。例如，美国国家毒理学计划将彗星测定作为其遗传毒理学测试计划（https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html）的组成部分，有时还将该测定纳入28天或90天的重复剂量毒性研究;这需要由生命实验室收集组织，并将样品转移到另一个实验室进行分析。为此，将组织碎片切碎，和/或胃肠道上皮细胞被刮伤，细胞悬浮液被闪入冷冻并储存在冰柜中，供接收实验室随后装运和储存，直到分析^7。正确处理样品对于使用冷冻组织获取高质量数据至关重要;然而，在不断变化的人员进行的尸检期间对组织样本的可重复操作是难以控制的，尤其是在不定期为彗星检测采集组织的生命实验室。对尸检人员进行进修培训或使用由经验丰富的实验室人员组成的流动单位收集新鲜或冷冻组织样本往往成本太高、不可行或被简单地低估。

为了更好地确保高质量组织样本的一致生成，以便转移到远程地点进行彗星检测分析，探讨了已公布的从闪冻组织立方体保存组织的方法⁶的效用。在这种方法中，冷冻的组织立方体被装入不锈钢组织切碎装置（图1），该装置被放入含有冷缓冲液的微离心管中。然后，组织立方体通过设备末端的小仪表网格推。多次通过两个方向的网状筛子反复强迫组织悬浮液，导致相对均匀的单细胞悬浮液。该方法制备的样品在质量上与通过切碎制备的新鲜和冷冻组织样本相比，具有优优。作为一个额外的好处，与切碎的样品不同，组织立方体可以长期冷冻储存，在彗星测定中仍然产生高质量的结果。

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研究方案

根据良好实验室实践条例（21 CFR 第 58 部分）和机构动物批准的动物使用协议，在 NTP 合同实验室进行 AAALAC 认证设施进行研究期间，收获了组织每个实验室的护理和使用委员会（IACUC）。

1. 组织收获和加工

注:准备重复的样品管（如肝脏）或将大约一半的样品转移到另一个储液管（如十二指肠、胃）以进行复分析（如有必要），是很有用的。为了尽量减少肠道组织潜在的样本到样本变异性，建议注意为每个动物的胃样本相同的组织区域，并划分样本以生成重复的样本。建议使用塑料钳来转移粘性组织，如大脑。作为一种选择，可过滤切碎、刮擦或均质组织制剂，使用连接到锥形管的40μm细胞滤网实现均匀的单细胞悬浮液。

1. 从感兴趣的器官中取出任何连接组织、器官和碎屑。拆卸后立即在含有+7 mL的冷新鲜制备的切碎溶液（Mg^+、Ca+和酚类无红 Hank 的平衡盐溶液、10% v DMSO 和 20 mM EDTA pH 7.5） 的中型称重船上大力旋转器官，以去除残留的血液和碎屑。
2. 将每个器官转移到另一艘装有足够（+7 mL）冷切碎液的清洁称重船，以保持组织在冰上浸没，直到进一步加工。
3. 取出每个感兴趣的器官的一部分，并将其放入嵌入盒中。根据实验室的标准程序，固定10%中性缓冲形式内，修剪和石蜡嵌入，以便将来可能进行组织病理学评估。
4. 对于肝脏，切割左叶的 5 mm 纵向部分，轻轻在 ±7 mL 的冷切碎溶液中轻轻摇动。将组织带放入一个干净的中型称重船中，其中含有+7 mL的冷切碎溶液，并维持在冰上，直到准备进一步加工（步骤1.8或1.11）。
5. 对于十二指肠，将十二指的10毫米部分切入胃部。使用 21-25 G 针，冲洗以清除碎屑和细菌。
   1. 将针头插入十二指的一端，并用 1 mL 的冷切碎溶液冲洗。
   2. 通过翻转十二指肠，再使用另外 1 mL 的切碎溶液重复，冲洗另一个方向。丢弃针头。
   3. 将十二指肠切开，用+7 mL的切碎溶液冲洗，然后放入含有+7 mL清洁切碎溶液的中型称重船中;保持在冰上，直到准备进一步处理（步骤1.8或1.11）。
6. 对于大脑来说，首先将大脑分成两个半球可能很有用;一个半球可以保存可能组织病理学（见步骤1.2）。
   1. 分离感兴趣的大脑区域，轻轻在+7 mL的冷切碎溶液中轻柔地摇动。
   2. 将组织转移到含有+7 mL冷切碎溶液的清洁中型称重船，并在冰上保持，直到准备进一步加工（步骤1.8或1.11;请注意，小脑和海马等小区域可能不需要任何进一步的修剪）。
7. 胃
   1. 取出并丢弃前胃。切开腺体胃，在中型称重船上使用+7 mL的冷切碎缓冲液从食物中洗净。
   2. 将5毫米的腺体胃皮带近似到十二指肠进行固定，以便进行可能组织病理学评估（参见步骤 1.2）。
   3. 将剩余的胃放入中型称重船的+7 mL冷切碎缓冲液中，在冰上孵育15~30分钟。
      注:此孵育步骤可能没有必要;此步骤已包含在 JaCVAM 验证协议中，但在 OECD 测试指南^8、,9中未提及。
   4. 将胃转移到干净的石蜡片（或培养皿或称重船），并使用手术刀刀片或聚四氟乙烯 （PTFE） 刮擦器轻轻刮两次或两次以上表面上皮，以清除碎屑。用钳子拿起胃黏液，并用1 mL的冷切碎缓冲液用移液器冲洗。将胃组织转移到干净的表面或盘子。
   5. 小心刮胃上皮4~5次（如有必要），用手术刀刀片或PTFE刮刀背面释放细胞（通常为250μL/鼠标或500-1，000μL/rat）。或者，用大约相等的切碎溶液冲洗组织，以恢复更多的细胞。使用移液收集含有释放的细胞的切碎液，并转移到冰上的微离心管。
8. 对于切碎组织样本，切割肝脏或脑组织 3⁄4 mm 部分或 +5 mm 十二指肠，并转移到标有 1.5 或 2.0 mL 的微离心管，其中包含 1 mL 冷切碎溶液。快速切碎（+30秒），用切碎的剪刀，直到细散，同时保持样品的低温。样本应看起来略多云;然而，这是常见的一些件保持，将定居到管的底部。
9. 要使用组织新鲜，维护含有碎组织或刮在冰上的上皮细胞的管;使用组织在收获约1小时内准备彗星滑梯（第2节概述）。
10. 用于冷冻组织样本，在切碎或收集刮刮的上皮细胞后立即
    1. 将管盖固定并放入含有液氮的 Dewar 烧瓶中;在尸检期间（±3 h），管可保存在液氮中。
    2. 使用包取回管子，放在干冰上进行排序。将管子转移到干冰上的冷冻箱，并在 -80°C 冰柜中存放。
11. 用于制备冷冻组织块，切割几小块组织（直径+4毫米，长度+6毫米）;图1。
    1. 单独将它们直接放入中型称重船或其他装有液氮的合适容器中。
    2. 等待几秒钟，让碎片完全冻结，并将单个冷冻组织立方体转移到在干冰上维护的标有微离心管或冷冻管;在冻结过程中，不要让碎片聚集在一起。
    3. 将管子转移到干冰上的冷冻箱，并在 -80°C 冰柜中存放。

2. 幻灯片准备

1. 用于切碎/刮擦组织
   1. 在湿冰上维护含有新鲜组织的管子。
   2. 将冷冻组织管放入室温水浴中，直到样品完全解冻，同时确保它们保持低温。立即将管子转移到冰上。
   3. 在提取细胞转移到琼脂糖之前（步骤2.3），轻轻混合每个细胞悬浮液;对于未过滤的样品，允许大块沉降到管的底部。保持冰上所有管，直到为所有样品准备滑轨。
2. 用于立方组织
   1. 从 80°C 冰柜中取回包含组织立方体的管，并在干冰上保持，直到幻灯片准备。
   2. 阿利quot 1 mL 的商人介质 （0.14 M NaCl， 1.47 mM KH₂PO_4，2.7 mM KCl， 8.1 mM Na₂HPO_4，10 mM NaEDTA， pH 7.4） 或切碎溶液到标记的 1.7 mL 微离心管为每个样品和维护在冰上.
   3. 快速工作以避免组织解冻，将一块组织放入室温组织切碎装置的开端（图1）。可以使用多个组织件;如有必要，可以使用冷砂浆和虫子将冷冻组织切割或裂解成更小的碎片，以减少立方体大小以放入设备中。
   4. 快速将大小匹配的注射器柱塞插入设备，将组织推到网状端，然后放入含有冷切碎溶液的微离心管中;避免迫使液体溢出管子。将设备的网状端浸入冷切碎溶液中约 5-10 秒，使组织完全解冻。
   5. 完全压下柱塞，直到看到细胞通过网格孔挤出。然后向上拉起柱塞约 2.5 厘米，然后再次完全按下;重复该过程几次，直到切碎溶液浑浊。
   6. 如有必要，样品可以集中，通过在1100 rpm下冷藏离心5分钟和去除部分上清液来增加细胞密度。
   7. 使用每个样品的清洁组织切碎装置对所有样品重复此过程。
3. 在37°C下将50μL的细胞悬浮液转移到含有450μL0.5%低熔点阿加罗斯的管子上。
   注:交易量可以调整，但琼脂的量应为±1%。
4. 准备和评分幻灯片，如前面描述的^{10，11。10,}

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结果

学习 1
肝脏是从两组雄性斯普拉格道利大鼠身上收获的，施用玉米油4天，交错一周。幻灯片由新鲜切碎的组织、冷冻切碎组织和冷冻块状组织制备，这些组织使用组织切碎装置在商人的介质或切碎溶液中处理。从第一组动物身上获得的冷冻组织在冷冻储存3.5个月后进行评估。从第二组动物身上获得的冷冻组织在储存6个月后进行评估。表现出特征的"刺猪"形态的彗星，表示严重受损?...

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讨论

如前^{77、12、1312,13}所示，妥善处理的闪速冷冻碎组织在彗星测定中提供了良好的效果。事实上，根据经合组织测试指南⁹建议的新鲜切碎大鼠肝脏样本，我们实验室准备的冷冻碎鼠和小鼠肝脏的基线%尾部DNA值通常为±6%。多个实验室利用各种被切碎和冷冻储存的组织类型取得了良好的结果;同样，从胃肠道器官刮...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL)	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL)	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B