利用人类诱导多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

摘要

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞衍生CD8++^单阳性T细胞的方法。

摘要

功能性T细胞在体外产生和扩展，可带来广泛的临床应用。其中一种用途是治疗晚期癌症患者。高富化肿瘤抗原特异性T细胞的采用T细胞转移（ACT）已被证明在一些患者中引起转移性癌症的持久回归。然而，在扩张过程中，这些细胞可能会耗尽或衰老，从而限制其作用和体内的持久性。诱导多能干细胞（iPSC）技术可以克服这些障碍，导致在体外产生大量分化程度较低的肿瘤抗原特异性T细胞。人类 iPSC （hiPSC） 有能力分化成任何类型的体细胞，包括淋巴细胞，当 T 细胞用作起始细胞时，这些细胞保留原始 T 细胞受体 （TCR） 基因组重排。因此，将人类肿瘤抗原特异性T细胞重新编程为hiPSC，然后再分化为T细胞系具有产生恢复性肿瘤抗原特异性T细胞的潜力。本文介绍的是一种使用OP9/DLL1共培养系统从hiPSC生成肿瘤抗原特异性CD8++^单阳性（SP）T细胞的方法。该方法是体外T细胞系生成的有力工具，将促进体外衍生T细胞的发展，用于再生医学和基于细胞的治疗。

引言

除了生理优势，T细胞还有许多潜在的治疗应用。体外T细胞的产生和扩展可用于疾病建模和治疗验证，以及遗传和后天免疫缺陷状态的治疗来源（即病毒免疫缺陷和淋巴性继发性化疗或移植），以及根除癌症。后一种质量已导致采用T细胞转移（ACT）用于治疗晚期^{癌症患者1}的发展。

ACT包括切除病人的肿瘤，提取肿瘤渗透淋巴细胞（TLL），扩大TiLs前体内，然后重新注入扩大的细胞到^患者2。它已被证明是一种有效的治疗方式，为一些转移性癌症患者。 不幸的是，并非所有患者都对这种疗法有反应。以前的报告已经表明，转移细胞的分化状态3，4，5，6，7，8，9，使用大数高富集的癌症抗原特异性T^细胞10，和持续T细胞^{转移11，12}所有与更持久的^{反应13，14}相关。因此，当ACT未能引起抗肿瘤反应时，部分原因可能是癌症抗原特异性T细胞产量低，低效率的外体扩张导致反应性克隆的耗尽和丧失，或转移后缺乏^持久性4.据推测，这些障碍可以通过在体外^产生大量分化性较差的癌症抗原特异性T细胞来^克服。

造血干细胞/祖细胞（HSPCs）是体外T细胞生成的常规来源，尽管这种方法受到可以从单个供^体1中恢复的少量细胞的限制。胚胎干细胞（ESCs）也已被证明能产生T细胞，但产量^低17，因此在临床应用中效率很低。此外，由于T系细胞在早期发育阶段经历其T细胞受体（TDR）的随机基因重组，如果不进一步基因组，就不可能使用HSPC或ESCs来生成纯抗原特异性T细胞群修改，如TCR基因转导。

克服这些警告的一种方法是重新编程TILs到人类诱导多能干细胞（hiPSCs），这可能为体外T细胞生成提供无限的来源。已经表明，癌症抗原特异性TILs可以重新编程到hiPSC，并重新分化为T细胞谱系，这保留了与原始T^{细胞18、19}相同的T细胞受体（TCR）基因重新排列。 这个细节对ACT很重要，因为单个患者肿瘤具有独特的突变谱，并且很少癌症抗原被证明在^{患者之间共享20。}因此，利用癌症抗原特异性TiLs作为体外产生hiPSC衍生T细胞的来源，可以为转移性癌症患者的个性化治疗提供一种新的策略。

此处详细介绍了使用 OP9/DLL1 共培养系统将 hiPSC 衍生的 T 系质细胞区分为功能抗原特异性 CD8+⁺单阳性 （SP） T 细胞的协议。该方法是体外T细胞分化的hiPSC，造血祖体，胚胎干细胞，以及其进一步应用于再生医学和基于细胞的治疗的有力工具。

研究方案

1. 在小鼠胚胎纤维细胞（MEF）上培养人类iPSC（hiPSC）

注:也可以使用培养 hiPSC 的替代方法，包括但不限于:在 6 孔板上播种，预涂有明胶、胶状蛋白混合物、重组层蛋白 511，或用于 hiPSC 扩展的任何其他细胞外基质，以及使用专为人类多能干细胞培养而配制的定明介质培养。

1. 栽培 MEF
   1. 涂上4 mL 0.1%明胶的10厘米细胞培养培养培养皿，在37°C下孵育30分钟。
   2. 将一小瓶4 x 10⁶辐照MEF快速解冻至10 mL的37°C MEF介质（DMEM = 10% FBS = 1x青霉素-链霉素 = 1x L-谷氨酰胺补充剂）。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，在MEF介质的9 mL中重新悬浮细胞颗粒。
   3. 从培养箱中取出明胶涂层的盘子。吸气明胶，并添加7 mL的MEF介质。将 MEF 悬架的 3 mL 板（从步骤 1.1.2）板到明胶涂层盘上。从侧面和前后摇动菜，确保 MEF 在盘子上均匀分布。在37°C孵育8-36小时。
2. 在 MEF 上传递 hiPSC
   注:数据是使用从长期培养的黑色素瘤TIL中提取的MART-1 iPSC生成的，该类型在HLA-A_02:01上下文中专门识别MART-1肽，如前^所述18。
   1. 当菌落直径在 0.8 - 1.2 mm 之间时，通过 hiPSC。在通过之前，在立体显微镜中检查hiPSC菌落，并使用200 μL尖端的塑料边缘去除培养体的任何分化区域。
   2. 吸气废介质，并添加10 mL hiPSC介质（人类ES培养基 [材料表]= 10纳克/mL 人类基本成纤维细胞生长因子[hbFGF]）辅以10μM ROCK抑制剂。
   3. 一手握住细胞培养皿，将一次性细胞传递工具卷过整个盘子，朝一个方向。施加足够的压力，使整个滚轮叶片接触培养皿，并在滚动操作过程中保持均匀的压力。
   4. 旋转培养皿 90°并重复步骤 1.2.3。在显微镜中查看板，以目视确认对菌落的正确切割，这些菌落应呈方格。使用 200 μL 移液器通过温和的机械冲洗分离切割菌落。
      注:用滚筒切割菌落后，必须立即通过机械冲洗分离切割菌落，因为 3 分钟后，切割菌落将开始重新连接到盘子，并且很难通过冲洗分离同质大小的菌落。
   5. 将 350 - 600 团切割菌落转移到新的 10 厘米的 MEF 盘中（在 hiPSC 传化前 8 - 36 小时）与 10 mL 的新鲜 hiPSC 介质辅以 10 μM ROCK 抑制剂。在37°C孵育。
      注:600团表示约1.0 x 10⁶ MART-1 iPSC，将在第35天产生0.5-1.0 x 10⁶ DP细胞。但是，预期数量将因起始细胞系的效力和培养条件而异。
   6. 第二天，吸气废介质并添加 10 mL 的新鲜 hiPSC 介质。根据 hiPSC 增长率，每 1-2 天更换一次 hiPSC 介质。

2. 制备OP9/DLL1细胞，用于与hiPSC共培养

1. OP9培养基中[最小必需介质（β-MEM）+20%胎儿牛血清（FBS）+1x青霉素-链霉素]中的培养蛋白在37°C下。当OP9/DLL1细胞达到汇合时，吸气培养基用5mL的1x镁、钙和无苯酚无红磷酸盐缓冲盐水（PBS）。洗涤一次。
2. 吸气PBS，并添加2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。 在37°C下孵育5分钟。然后，加入4 mL的OP9介质，通过移液机械分离细胞层，使单细胞悬浮。
3. 通过100μm细胞过滤器将细胞悬浮液转移到50 mL锥形管中，以避免细胞团块。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在 OP9 介质的 12 mL 中重新悬浮。
4. 在 6 个新的 10 厘米细胞培养培养皿中，每增加 8 mL 的 OP9 介质。从步骤 2.3 到每个新的 10 厘米盘的 OP9/DLL1 细胞悬浮液的板 2 mL。从正面到背面摇动菜，以确保 OP9/DLL1 在盘上均匀分布。
5. 在37°C孵育。当细胞到达汇合时，每2-3天重复一次。
   注:制作足够的OP9/DLL1细胞冷冻库存，每4-6周解冻一次新股票，这一点很重要。

3. 在体外分化高PSC到CD8++⁺单正（SP）T细胞

1. 在与 hiPSC 共同培养前一周准备明胶化 OP9/DLL1 菜肴。要制备0.1%明胶溶液，将5mL室温（RT）组织级库存明胶溶液加入500 mL的PBS中。
   1. 涂层 3 新的 10 厘米细胞培养培养培养皿，每道菜加入 4 mL 0.1% 明胶。 在37°C下孵育30分钟。
   2. 吸气明胶，并在每道菜中加入8 mL的OP9介质。将 OP9/DLL1 的一个汇盘中（如上文第 2 节所示）移至三道明胶预涂盘。
2. 4天后，在明胶上每 10 厘米的 OP9/DLL1 盘中添加 10 mL 的 OP9 介质，每道菜共 20 mL 的介质。
3. 7 - 8天后，开始对OP9/DLL1汇盘（分化日0）进行hiPSC共培养。
   1. 吸气花费媒体从融合 10 厘米盘的 hiPSC 在 MEF.添加 10 mL 的 OP9 介质。使用一次性细胞通过工具切割和分离 hiPSC 菌落，如步骤 1.2.3 和 1.2.4 中所做的那样。
   2. 使用 200 μL 移液器将 350 - 600 团切割菌落转移到 10 厘米预明胶化 OP9/DLL1 盘（步骤 3.1）上，使用 10 mL 的新鲜 OP9 介质。从正面到背面摇动文化菜，以确保菌落的均匀分布。
      注: 或者，可以使用预成型的 hiPSC 胚胎体 （IB） 或小团块悬浮液。 然而，使用一次性细胞传递工具或EB形成系统是首选产生统一大小的hiPSC团块。
4. 在第 1 天，吸气废旧介质，并替换为 20 mL 的新鲜 OP9 介质。在OP9/DLL1上共同培养1天的hiPSC团群将显示为小圆单层菌落（图1）。
5. 第 5 天，吸出 10 mL 的废介质，并添加 10 mL 的新鲜 OP9 介质。hiPSC菌落将开始分化成原始中皮，其特点是多层黑暗中心。
6. 第 9 天，吸出 10 mL 的废介质，并添加 10 mL 的新鲜 OP9 介质。此时，多层中心结构将演化为圆顶状形状，外围网络状区域将开始变得明显。
7. 第13天，收获造血祖细胞（HPCs）（图1）。第13天HiPSC衍生结构的特点是一个黑暗的中央器官，周围是圆顶状区域网络，代表先前报告包围人类胚胎干细胞衍生造血祖体的造血区（HZs）²¹.
   注:在没有暗中心的情况下，圆顶状结构的存在表明过程是成功的。无法生产 HPC 可能是由于 OP9/DLL1 质量差、FBS 批次质量低、种子到 OP9/DLL1 上的 iPSC 团块的汇合（350-600 团群是最佳），以及/或 iPSC 管路效力的变化以产生造血前体。
   1. 吸气废介质和洗涤1x与5mL的1x苯酚无红汉克斯的平衡盐溶液与钙和镁（HBSS）修饰。
   2. 吸气HBSS，在10 mL的HBSS中加入250μL的5000单位/mL胶原酶IV。在37°C孵育45分钟。用胶原酶IV吸脂HBSS，用5mL的PBS洗涤一次。
   3. 吸气PBS，并加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在37°C孵育20分钟。然后，加入4 mL的OP9介质，通过移液分离细胞层，使单细胞悬浮。
   4. 通过100μm细胞过滤器将细胞悬浮液转移到50 mL锥形管中。 在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在 OP9 介质的 10 mL 中重新悬浮。
   5. 板细胞悬浮到新的明胶10厘米细胞培养培养皿（见步骤3.1.1和3.1.2）。在37°C孵育45分钟。然后，通过温和的移液收集非粘附细胞。
   6. 通过100μm细胞过滤器将收集的细胞悬浮液转移到50mL锥形管中。 在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。在10 mL的分化介质中吸出上清液并重新悬浮[OP9介质，具有5纳克/mL人类干细胞因子（hSCF）、5纳克/mL人FLT3配体（hFLT3L）和5纳克/mL人类白细胞介素7（hIL-7）]。
   7. 将细胞悬架盘到新的 10 厘米 OP9/DLL1 汇盘中。
8. 第16天，通过细胞。
   1. 通过温和的移液和过滤100μm细胞过滤器，机械地分离非粘附细胞。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。吸出上清液，并在10 mL分化介质中重新悬浮。
   2. 将细胞悬架盘到新的 10 厘米 OP9/DLL1 汇盘中。
9. 之后每5-7天通过重复步骤3.8继续传递非粘附细胞。
10. 在第35天，丰富CD4+CD8+双阳性（DP）总体，刺激产生CD8+++SP T细胞（图2）。
    1. 通过温和的移液和过滤100μm细胞过滤器，机械地分离非粘附细胞，以去除细胞团块。根据制造商的协议，通过CD4磁珠隔离来^丰富CD4+细胞群。
       注:使用CD4磁珠的原理是从培养基中去除CD4-CD8-DN细胞，因为已经证明这些细胞^在刺激后会导致CD4+CD8+DP细胞的直接杀伤。
    2. 使用 Neubauer 血细胞计和 Trypan 蓝色染料计数活 CD4 富集细胞。 以总浓度 0.5 x 10⁶细胞/mL 悬浮在 OP9 介质中。将1 mL的细胞悬浮液（0.5 x 10⁶细胞）放入每个孔的组织培养平底24孔板的汇合OP9/DLL1。
    3. 加入100 IU人白莱素2（hIL-2），5纳克/mL hIL-7，500纳克/mL抗人CD3抗体，2μg/mL抗人CD28抗体，然后在37°C培养。
    4. 在刺激后第4-7天，收集细胞进行分子分析（图3）或与肽脉冲抗原呈现细胞（APC）共培养。

4. 测量hiPSC^{衍生CD8+++SP} T细胞的抗原特异性

注:用于此测试的 APC 类型取决于 hiPSC 衍生 T 细胞的 MHC 限制。在这里，使用T2细胞系，这是T和B淋巴细胞系的杂交。T2细胞表达HLA-A_02:01^23，这是由JKF6细胞识别，其中MART1-iPSC^派生18。此 T2 细胞系可在 RPMI 1640 + 20% FBS + 1x 青霉素-链霉素中扩展，当细胞密度达到 5 x 10⁵细胞/mL 时，可通过。

1. 使用 Neubauer 血细胞测定仪和锥形蓝色染料计数实时 HLA-A_02:01⁼ T-B 混合淋巴细胞 T2 细胞。在24孔组织培养板中孵育APC，在37°C下用1μg/mL MART-1肽孵育2小时。
   注:最佳肽浓度是可变的，取决于细胞系和抗原特异性。
2. 收集APC，用10 mL的PBS洗涤2倍，以去除任何额外的肽。
3. 在 OP9 介质中计数 APC 并悬浮在 2 × 5 x 10⁵个单元/mL，介质中具有 100 IU IL-2 和 5 纳克/mL IL-7。将100 μL的细胞悬浮液（2-5 x 10⁴细胞）放入超低附件U底部96孔板的每个孔中，或直接放入预涂的ELISpot板中。
4. 使用细胞分拣机对HIPSC衍生的CD8++++SP T细胞（抗人CD3/CD28抗体刺激后1周）进行分类，并在100 IU IL-2和5 ng/mL IL-7的OP9介质中悬浮在1 x 10⁶细胞/mL。将100μL的细胞悬浮液（1 x 10⁵细胞）到APC的每口井中，在37°C下培养16-20小时。
5. 16-20小时后，根据制造商的协议（图4）通过ELISpot测定分析细胞因子分泌配置文件。

结果

13天后hiPSCs与OP9/DLL1共同培养，CD34⁺CD43⁺造血祖细胞出现（图1）。在hSCF、hFLT3L和hIL-7的存在下，在非明胶化OP9/DLL1上再培养22天后，造血原代细胞分化成CD3+CD7+CD4+CD4+CD8+双阳性（DP）T系系细胞，其中大多数表示特定于 MART-1 表位 （四联体） 的 TCR （图 2）。

此前已经表明，CD8+ SP T细胞可以通过激动剂肽或抗体驱动的TCR^{刺激24、25}从CD4+CD8+DPT细胞诱导。因此，在培养的第35天，hiPSC衍生的CD4+CD8+DP T细胞在hIL-7和hIL-2的存在下受到抗人CD3和反人类CD28抗体的刺激。 刺激四天后，CD3⁺CD8+ +^SP细胞的数量急剧增加，并且对 MART-1 表位保持特异性，确认其遗传抗原特异性的保存（图3）。

为了确定hiPSC^{衍生CD8+++SP} T细胞的功能特性，分析了干扰素伽马（IFN-+）的抗原依赖性活化和分泌。在用抗人CD3和抗人类CD28抗体刺激1周后，使用细胞分拣机分离出HIPSC^{衍生CD8++SP} T细胞，并与T2细胞系共同培养，表达HLA-A_02:01，带或不带共理MART1肽16-20小时。ELISpot测定表明，当在MART-1肽存在的情况下培养时，hiPSC衍生^的CD8+++-SP T细胞分泌的IFN-*与CD8+++^和SP T细胞相比，分泌量更高。IFN-α的表达对于T细胞和APC来说是无效的，表明人类T-iPSC衍生的T细胞具有抗原特异性和功能性（图4）。

图1:产生hiPSC衍生造血原细胞。（A） 使用 OP9/DLL1 共文化将 hiPSC 分化为造血系的原理概述。（B） 第 1 天（左上）、3（右上）、7（左下）和 13 日（右下角）出现 hiPSC 派生结构。刻度条 = 100 μm. （C） 在 13 日对 hiPSC 派生 CD34⁺CD43⁺造血祖细胞的流量细胞学分析。数据代表六个独立实验（n = 1 到 2）。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:hiPSC分化^为Mart1+ CD4+CD8++DPT细胞。 （A） 使用OP9/DLL1共培养的hiPSC衍生造血系与未成熟的T细胞分化的原理概述。（B） 第35天，CD4与CD8+、CD3与CD8+和MART-1四元体表达在hiPSC衍生T细胞中的流动细胞学分析。门在淋巴细胞，单细胞，PI阴性。数据代表三个独立实验（n = 3 - 8）。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:CD8+++SP T细胞表型诱导。在人抗CD3和人体抗CD28抗体驱动刺激后4天^对CD4- hiPSC衍生T细胞进行流细胞分析。门在淋巴细胞，单个细胞，PI负数（n = 4）。  请点击此处查看此图的较大版本。

图4:hiPSC衍生CD8++SP T细胞的抗原特异性。 IFN-α 分泌通过ELISpot检测的hiPSC衍生CD8++ + SP，CD8+++SP，和散装T细胞后20小时共培养与或不T2细胞脉冲（或不）与MART-1肽。 请点击此处查看此图的较大版本。

讨论

OP9鼠位细胞的共同培养是一个完善的系统，用于从HSPC和多能干细胞体外生成淋巴细胞（即NK、B和T细胞）。Notch信号是诱导T系承承诺的，可以通过Notch配体DLL1或DLL4的异位表达来完成，后者对T细胞^生成1具有可比的疗效。因此，OP9/DLL1共培养系统已成为在体外产生T细胞的广泛使用方法。 此外，该方法适用于多种类型和来源的人体细胞，包括脐带血、骨髓HSPC和ESCs。 然而，从这些源中产生T细胞受到来源细胞检索不足或对T^细胞1的低效分化的限制。此外，具有单个 TCR 重组的 T 单元产品不能从这些开放式剧目源生成。通过使用再生医学技术，即诱导多能干细胞（iPSC）技术，有可能产生大量抗原特异性T细胞，用于基于细胞^{的治疗15。}

hiPSC 与多能 ESC 类似，其自我更新、无限扩张和能够区分体内任何类型的体细胞的能力;然而，他们缺乏关于使用胚胎源产品用于临床应用的道德问题。此外，hiPSC可以从任何体细胞生产，允许开发个性化药物的细胞产品。在以前的报告中，hiPSC是从人类T细胞中产生的，使用全外周单核细胞、CD3+细胞或分离的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）作为^{来源18，19，22， 26.}当HiPSC从T细胞源（T-iPSCs）生成时，原始TCR基因重新排列被继承。因此，患者T-iPSC衍生T细胞可以通过靶向患者独特的癌症抗原，为个性化的ACT治疗提供模型。

人类多能干细胞分化为T系细胞分为两个步骤:造血祖细胞（HPCs）27及其进一步分化为T系^细胞21。这两个步骤都可以使用 OP9/DLL1 共区域性系统完成。重要的是，OP9/DLL1进纸细胞的质量对T细胞分化的成功至关重要。由于OP9/DLL1细胞不是不朽的同质细胞系，FBS质量和培养条件对于保持其扩张而不丧失支持hiPSC分化的能力至关重要。因此，建议在细胞与细胞质接触开始发生时，一致地预先评估FBS的批次和通道，以防止细胞分化和衰老。需要考虑的一点是，根据显微镜的相位对比度和放大倍率，细胞与细胞接触可能与背景无法区分。根据我们的经验，大多数 OP9/DLL1 菜肴在准备通过时看起来有 80% 的康收。

研究表明，OP9/DLL1共培养从T-iPSC产生的重新分化的T系系细胞在^{刺激18、19}时可产生CD8+SP T细胞。然而，^再生CD8+SP T细胞获得先天状CD8+homodimer22，28，这是TCR^信号29的无效共受体。 此外，这些再生^的CD8+SP T细胞表现出强烈的TCR无关细胞毒性，使这些细胞不利于临床^使用30。该协议描述了最近一种方法，涉及刺激纯化CD4+ CD8⁺ DP细胞，以产生CD8+^{+ SP} T细胞与更传统的表型和改进抗原特异性细胞^毒性22。虽然由于继发性TR®等位重排引起的抗原特异性损失是在长期培养后的DP阶段，但可以通过T-iPSCs31中的基因组编辑来克服。 根据我们的经验，hiPSC衍生的DP细胞开始出现在培养的第30-35天，这些新生成的DP细胞尚未经历二次TCR+重排。因此，第35天的大多数DP细胞保留抗原特异性，可用于生成抗原特^{异性CD8+++SP} T细胞。

在人类抗CD3和反CD28刺激之前，CD4-CD8-DN细胞必须从培养基中取出，因为这些细胞已被证明^在刺激后导致CD4+CD8+DP细胞直接杀伤。使用CD4磁珠富集（步骤3.10）将丰富DP和CD4+^CD8-中间单阳性（ISP）^细胞1，我们已经证明没有^{负面影响22。}或者，通过流式细胞测量对荧光激活细胞进行分类，以分离DP细胞。然而，磁珠分离是首选，因为它避免了流动细胞学引起的机械应力。

^CD8+++SP T细胞从人类多能干细胞生成，无需活化介导的激动剂选择，随后通过使用3D鼠位细胞^培养32来证明。然而，生理阳性选择取决于TCR与自肽-MHC复合物的相互作用，这些复合物由胸腺皮质上皮^细胞33进行独特的处理和呈现。此外，TCR对选择肽的亲和力已被证明确定^{成熟CD8+++SP} T^细胞34的后续功能。 目前，没有证据表明，基于Notch基质细胞的共培养系统可以提供生理阳性选择所需的定义选择肽和MHC复合物。

此前，在一个小鼠模型中，仅使用OP9/DLL1就从肿瘤抗原特异性T细胞衍生的HiPSCs产生的T系质细胞未能经历常规成熟。然而，由OP9/DLL1系统产生的iPSC衍生的不成熟T细胞可以通过在3D培养系统中进一步进行生理胸腺教育，成熟成天真的T^细胞。因此，这里提出的生产由OP9/DLL1系统产生的iPSC衍生的不成熟T细胞的协议对于进一步尝试产生真正的人类肿瘤抗原特异性后胸肌T细胞至关重要，这些细胞能够在体内长期持久。治疗已建立的血管化肿瘤的效率。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning, Inc.	353003
Anti-CD3, human	BD Biosciences	Cat# 561812, RRID:AB_1089628
Anti-CD34, human	BD Biosciences	Cat# 348791, RRID:AB_400381
Anti-CD4, human	Biolegend	Cat# 344612, RRID:AB_2028479
Anti-CD43, human	BD Biosciences	Cat# 560198, RRID:AB_1645460
Anti-CD7, human	BD Biosciences	Cat# 555361, RRID:AB_395764
Anti-CD8a, human	BD Biosciences	Cat# 555369, RRID:AB_398595
Anti-CD8b, human	BD Biosciences	Cat# 641057, RRID:AB_1645747
Anti-TCRb, human	BD Biosciences	Cat# 555548, RRID:AB_395932
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade	Miltenyl Biotec	130-093-375
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade	Miltenyl Biotec	130-093-387
CD4 Microbeads, human	Miltenyl Biotec	130-045-101
Cell strainer 100 um	Fisher Scientific	22-363-549
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini	100-500
Flt-3 ligand	R&D Systems	427-FL
Gelatin Solution 2%	SIGMA-Aldritch	G1393-100ML
GlutaMAX (100X)	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-Glutamine supplement
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free	Gibco	14025-092
Interleukin-2	R&D Systems	202-IL
Interleukin-7	R&D Systems	407-ML
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV	MBL	Cat#TB-0009-2
Mart1-hiPSC	Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013	RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35)	InnoPep	3146-0100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
αMEM powder	Gibco	61100061
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)	Thermo Fisher Scientific	C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962
OP9/N-DLL1	Riken Bioresource center	Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220	OP9/DLL1
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
Primate ES Cell Medium	Reprocell	RCHEMD001	Human ESC Culture Media
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride)	Tocris	1254
RPMI 1640	Gibco	11875093
Stem Cell Factor (SCF)	R&D Systems	455-MC
StemPro	EZPassage	23181-010
T2-tumor	ATCC	T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™)
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200-072
U Bottom 96 well plate	Corning, Inc.	3799