生成心室样HiPSC衍生的心肌细胞和用于钙处理特征的高质量细胞制剂

摘要

在这里，我们描述和验证一种持续产生强大的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞的方法，并描述其功能。这些技术可能有助于发展对信号通路的机械洞察力，为大规模药物筛查提供平台，并可靠地模拟心脏病。

摘要

人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）为研究钙（Ca^2+）处理和信号通路以及高通量药物筛选和毒性检测的基本科学提供了宝贵的人类来源。在此，我们详细介绍了用于生成高质量 iPSC-CM 的方法，这些方法可以持续再现不同细胞系的分子和功能特征。此外，还介绍了一种方法，通过评估 Ca²⁺处理特性，可靠地评估其功能特性。低氧 （O₂） 条件、 乳酸盐选择和长时间培养产生高纯度和高质量的心室状心肌细胞.与分离的成年大鼠心肌细胞 （ARCMs） 类似，3 个月大的 iPSC-CM 表现出更高的 Ca²⁺振幅、更快的 Ca²⁺再摄取率（衰变-tau），以及与第 30 天 iPSC-CM 相比，对 β-肾上腺素刺激的正热性反应。该策略在技术上简单、经济高效且可重现。它为心脏病建模和针对Ca²⁺处理蛋白的大规模药物筛查提供了一个强大的平台。

引言

人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）是一个有吸引力的基于人的平台，用于在体外模拟各种心脏疾病1、2、3、4、5、6、7、8。此外，iPSC-CM可用于预测患者对新药或现有药物的反应，筛选命中化合物，并开发新的个性化药物^9，10。然而，尽管取得了显著进展，但在使用iPSC-CM¹¹时，需要考虑一些限制和挑战。因此，改进心脏分化方案、提高iPSC-CMs效率和成熟以及产生特定心肌细胞亚型（心室、心房、心房和节点）的方法已被深入研究，并已导致许多文化策略克服这些障碍12、13、14、15。

尽管这些协议具有鲁棒性，但使用 iPSC-CM 的一个主要问题是，为了获得能够确保相同性能和可重复结果的高质量心肌细胞，需要重复和复杂的程序。重复性不仅在比较具有不同遗传背景的细胞系时，而且在重复同一细胞系的细胞和分子比较时都是至关重要的。细胞变异性（如 iPSC 密度的差异）可能会影响心脏分化，产生低产量和低质量的心肌细胞。这些细胞仍可用于执行不需要纯 VM 总体的实验（例如，执行 Ca²⁺瞬态测量时）。事实上，在进行电生理分析时，非CM不会跳动，无论是自发的，也不是电刺激的，所以很容易将它们排除在分析之外。然而，由于质量差，iPSC-CM 可以显示改变的电生理特性（例如，不规则的 Ca²⁺瞬态，低 Ca²⁺振幅），这些不是由于它们的遗传组成。因此，特别是在使用 iPSC-CM 对心脏病进行建模时，不要将劣质 CM 的结果与疾病表型混淆。在进行电生理学研究之前，需要仔细的筛选和排除过程。

该方法包括优化的协议，以生成高纯度和高质量的心肌细胞，并通过使用钙和收缩性采集和分析系统执行 Ca²⁺瞬态测量来评估其功能。该技术是一种简单而强大的方法，用于区分高效和低效率的 iPSC-CM 制剂，并提供更具有生理相关性的人类 iPSC-CM 表征。

研究方案

在这项研究中，使用成年大鼠心肌细胞的实验是在西奈山伊坎医学院批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议下进行的。成年大鼠心肌细胞被分离出斯普拉格道利鼠的心脏，通过兰根多夫的方法，如前¹⁶所述。

1. 媒体的准备

1. 准备 hiPSC 介质。
   1. 平衡补充剂和基础介质到室温 （RT）。确保补充已完全解冻。使用 0.22 μm 真空驱动过滤器混合 400 mL 的基底介质和 100 mL 的补充剂和过滤器。储存在4°C下，在使用前与RT平衡。
2. 准备 RPMI = B27。
   1. 将 B27 补充剂和基础介质 （RPMI 1640） 与 RT 平衡。使用 0.22 μm 真空驱动过滤器混合基基介质 490 mL 和 50x 补充剂的 10 mL 和过滤器。储存在4°C下，在使用前与RT平衡。
3. 准备 RPMI + B27 （-） 胰岛素。
   1. 将 B27 （-） 胰岛素补充剂和基础介质 （RPMI 1640） 与 RT 平衡。使用 0.22 μm 真空驱动过滤器混合基基介质 490 mL 和 50x 补充剂的 10 mL 和过滤器。储存在4°C下，在使用前与RT平衡。
4. 制备选择介质 （RPMI （-） 葡萄糖 + B27 + 乳酸盐）。
   1. 将 B27 补充剂和基础介质 （RPMI 1640 （-） 葡萄糖） 与 RT 平衡。混合基底介质的490 mL和 50x 补充剂的 10 mL，加入无菌水中构成的 4 mM 乳酸钠，并使用 0.22 μm 真空驱动过滤器进行过滤。储存在4°C下，在使用前与RT平衡。
5. 准备 RPMI 20。
   1. 将基础介质 （RPMI 1640） 与 RT. 混合胎儿牛血清 （FBS） （20% 最终浓度） 和 RPMI。使用 0.22 μm 真空驱动过滤器进行过滤，并储存在 4°C 下。使用前与 RT 平衡。
6. 在 hiPSC 介质中加入含有蛋白激酶 （ROCK） 抑制剂 （2 μM 最终浓度） 的 Rho 相关盘绕线圈，制备过冲介质。
7. 通过添加 GSK-3 抑制剂，将 CHIR 99021 添加到 RPMI + B27 （-） 胰岛素介质 （10 μM 最终），制备 D0 介质。
8. 通过将 RPMI + B27 （-） 胰岛素介质与 IWR-1（5 μM 最终）混合，制备 D3 和 D4 介质。
   注:D1和D5介质由RPMI + B27（-）胰岛素组成。D7 介质由 RPMI + B27 组成。
9. 制备阻断缓冲液（2%牛血清白蛋白[BSA]，2%FBS，0.05%NP-40在磷酸盐缓冲盐水[PBS]）:在50 mL锥形管中，加入1克BSA，1mL FBS，49 mL PBS和250μL的NP-40。混合至完全溶解。

2. 制备人类胚胎干细胞（hESC）合格基质涂层板和盖玻片

注:在消毒组织培养罩下执行所有步骤。

1. 在 4 °C 的冰上解冻 hESC 合格基质库存溶液。请参阅产品规格表以确定适当的等分量，因为这可能因库存而异。将这些等分在-20°C中储存在1.5 mL微离心管中。
2. 为了将基质用于涂布板或玻璃盖玻片，首先在 4°C 下将 hESC 认证基质的等分解冻 30 分钟。
3. 冷Dulbeco的改性鹰介质（DMEM）:营养混合物F-12（DMEM/F:12）介质进入50 mL锥形管中的Aliquote 24 mL。
4. 将冷的 DMEM/F:12 介质与 2 mL 玻璃移液器混合，以冷却移液器表面。
5. 使用相同的移液器，占用大约 500–700 μL 的冷 DMEM/F:12，并与微离心管内符合 hESC 的基质等分混合。
6. 正确混合后，将溶液转移到含有冷 DMEM/F:12 的 50 mL 锥形管中，然后再次混合。
7. 对于标准 6 孔板，向每个孔中加入 1 mL 的这种混合物。确保油井完全覆盖。将板放在组织培养罩下方的 RT 上至少 30 分钟。如果需要，在电镀后立即在4°C下储存长达1周，并在使用前与RT平衡30分钟。
8. 为了使用板，吸气矩阵，用适当的介质替换。立即使用。
9. 将玻璃盖玻片存放在无菌环境中（例如，在无菌组织培养罩内）。
10. 在涂布之前，用70%乙醇擦拭每个单独的盖玻片。盖玻片干燥后，将其放入无菌 6 孔板的井内。
11. 取用 250*300 μL 的 hESC 认证基质溶液，并小心地将其直接分配到玻璃盖玻片的中心。在使用前，将盖玻片留在组织培养罩下方的 RT 上至少 30 分钟。

3. 小分子的制备

注:除非另有说明，否则在 DMSO 中重组所有小分子和 Wnt 调制器。

1. 准备 10 mM 等分，每 IWR-1 和 CHIR 99021 各 25 μL，并储存在 -20°C。
2. 重组 10 mM 等分，每个 50 μL 的 Thiazovivin（ROCK 抑制剂），并储存在 -20°C。

4. iPSC 的维护和传递

注:在无菌组织培养罩下执行以下所有步骤。

1. 在标准 6 孔板中维护 iPSC，并在无菌条件下执行所有步骤。用每口井2mL的hiPSC介质维持细胞。每隔一天更改一次媒体。使细胞保持在37°C，6%O2，5%CO_2。当细胞在70-80%的汇入之间时，通过细胞。
2. 将 PBS 平衡，而不使用 Ca²⁺和 Mg²⁺到 RT。
3. 要开始通过过程，在需要通过口的井中添加 1 mL 的 PBS，而不添加 Ca²⁺和 Mg^2+。在RT孵育7-10分钟。检查显微镜下的细胞，以确保PBS治疗不会导致单层完全解索。
4. 拆下 PBS 并更换为 1 mL 的过用介质。使用细胞提升器轻轻刮擦细胞，并将细胞从井表面提起。
5. 使用无菌的 2 mL 玻璃移液器机械分离细胞。重复，直到在显微镜下观察时，细胞均匀地分裂成小菌落。
6. 一旦细胞充分分离，加入5 mL的传递介质，以分割细胞1:6。调整要添加的传交介质量，以匹配首选拆分比率。
7. 从 hESC 认证的基质涂层板上吸出 hESC 认证的基质，并每孔更换 1 mL 的过孔介质。每口井添加1 mL分离细胞。

5. 心肌细胞分化

1. 使用已建立良好的hiPSC线（超过20个段落），并在开始心脏分化之前表现出均匀形态。
2. 确保 iPSC 的汇入率约为 70-80%。
3. 在没有Ca²⁺和Mg²⁺的情况下，在PBS中清洗细胞1x。
4. 每口井添加 2 mL D0 介质（步骤 1.7），并将细胞移回培养箱。
5. 24 小时后，每口井更换 3 mL 的 D1 介质 48 小时。
6. 在第 3 天，用每口井 2 mL 的 D3 介质替换介质。第 4 天使用 D4 介质重复上述步骤。
7. 在第 5 天，用每口井 3 mL 的 D5 介质替换介质。
8. 在第7天，用每口井3mL的D7介质替换介质，然后转移到37°C、5%CO2和正常_O2浓度的培养箱中。每 2 天更换一次 D7 （RPMI + B27） 介质。

6. 选择程序和iPSC-CM分离

1. 在执行 Ca²⁺瞬态测量或任何功能分析前十天，将 RPMI + B27 介质更换为每口井 3 mL 的选择介质，每次 48 小时。
2. 将介质更换为 3 mL 的选择介质，持续 48 小时。
3. 将介质更换为每口 2 mL 的 RPMI + B27 介质，每次 24 小时。
4. 如第 2 节所述，涂覆标准 6 孔板。
5. 在每个井中加入1 mL的无菌0.25%胰蛋白酶，加入EDTA。在37°C下孵育板5分钟。
6. 使用1，000 μL移液器，机械分离细胞，以便在显微镜下观察时可以看到单个细胞。
7. 将细胞转移到无菌的15 mL锥形管中，每孔加入2 mL的RPMI 20介质。在800 x g下离心5分钟。
8. 吸出上清液，在 RPMI + B27 介质中重新悬浮细胞。从板中吸出 hESC 认证的基质，然后替换为 1 mL 的 RPMI + B27 介质。
9. 使用 1，000 mL 移液器尖端，机械分离细胞颗粒，直到溶液看起来均匀。
10. 将大约500，000个细胞转移到每个井。转移到孵化器24小时。
11. 将介质更换为每口井 3 mL 选择介质 48 小时。
12. 用每口 3 mL 的 RPMI + B27 更换介质。在 D7 介质中保持细胞（RPMI + B2 每 2 天更换一次介质，直到准备好进行功能分析。

7. 用于流动细胞测定的 iPSC-CM 的准备

1. 一旦细胞达到预期年龄，并经历了代谢选择（第6节），用PBS清洗细胞，而不使用Ca²⁺和Mg^2+。
2. 每口胰蛋白酶增加1 mL 0.25%，在37°C下孵育5~7分钟。
3. 用P1000尖端将混合物移移5⁄10x，使细胞奇点化，并转移到含有2 mL的RPMI 20的15 mL管中。
4. 以 600 x g旋转单元格 5 分钟。
5. 向细胞颗粒中加入100 μL的固定溶液（4%PFA）。通过连续、温和的涡旋，将溶液滴落，然后在冰上放置15分钟。
6. 添加 1.5 mL 的 PBS。通过离心收集细胞，吸出上清液。
7. 对于每个实验，每个固定/渗透条件包括一个未染色的控制。
8. 在500μL的阻断溶液中重新悬浮细胞（PBS中2%FBS/2%BSA，NP-40），在RT处30分钟。
9. 在不去除阻滞溶液的情况下，加入原抗体MLC2V/MLC2A（5mg/mL），并在RT孵育45分钟。
10. 用阻塞缓冲液清洗。通过离心和吸气溶液收集细胞。
11. 加入二级抗体 Alexa Fluor 555/488（1:750），在阻断缓冲液中稀释 45 分钟，在 RT 或 4°C 过夜。
12. 添加 1.5 mL 的 PBS。通过离心和吸气溶液收集细胞。
13. 在250~300 μL的PBS中重新悬浮细胞。使用 P1000 移液器分解细胞。
14. 使用 35 μm 尼龙网状细胞滤帽准备圆形底管。用 50 μL 的 PBS 预湿细胞滤网，并将管放在冰上。
15. 将分解细胞溶液转移到带细胞滤帽的圆形底部管中。允许细胞溶液自然排干或在必要时将管底部与平坦的表面敲击，以确保完全排水和将细胞收集到管中。确保尽快将管子放回冰上。
16. 用250μL的PBS冲洗细胞滤网以恢复任何残留细胞。
17. 保持管子在冰上，用铝箔盖，直到流式细胞分析。

8. 将心肌细胞电镀到玻璃盖玻片上

注:在无菌环境中执行所有步骤。

1. 按照步骤 2.10 和 2.11 中所述，准备玻璃盖玻片。
2. 一旦选择了 iPSC-CM 且达到所需年龄，请按照步骤 6.5_6.7 分离 iPSC-CM。
3. 吸出上清液，在足够量的RPMI 20介质中重新悬浮细胞，每250μL有大约300，000个细胞。
4. 使用 2 mL 玻璃移液器，机械分离细胞颗粒，直到溶液看起来均匀。
5. 从盖玻片中吸出 hESC 限定矩阵。
6. 使用 1000 μL 移液器，从 15 mL 锥形管中混合和拉出 250 μL 溶液。
7. 缓慢地将溶液的 250 μL 分配到玻璃盖玻片上，特别注意仅添加到存在 hESC 认证基质涂层的区域。
8. 小心地转移到孵化器，并离开过夜，注意不要摇晃或分散覆盖物上的细胞。第二天早上，用盖玻片轻轻地将 2 mL 的 D7 （RPMI + B27） 介质添加到每个井中。24 小时后和之后每 2 天更换一次介质。

9. 修复单元格

1. 确保具有 Ca²⁺和 Mg²⁺的足够数量的 PBS 平衡到 4°C。
2. 在PBS中用Ca²⁺和Mg²⁺制备4%的甲醛（PFA）溶液，并平衡至4°C。
3. 一旦 iPSC-CM 达到适当的年龄，经过代谢选择（第 6 节），并已在盖玻片上镀面（第 8 节），用 1 mL 的冷 PBS 清洗细胞 3x，每孔使用 Ca²⁺和 Mg^2+。
4. 加入1 mL的冷4%PFA，并将电池留在发动机罩下方的RT处15分钟。
5. 用冷PBS清洗细胞，以去除多余的PFA。
6. 加入 2 mL 的 PBS，加^2°和 Mg^2+，并储存在 4°C。

10. 免疫荧光染色

1. 从固定单元中取出 PBS 并添加 1 mL 的阻塞缓冲区。在 RT 孵育 1 小时。
2. 去除阻塞缓冲液，加入在阻断缓冲液中稀释的原抗体（5mg/mL）。在4°C下孵育过夜。
3. 在 PBS 中用 Ca²⁺和 Mg²⁺洗涤 3 倍，每次 5 分钟。
4. 在阻塞缓冲液中添加稀释的二级抗体 1:1，000。
5. 用铝箔盖住板，保护其免受光线照射，并在 RT 孵育 45 分钟。请保留铝箔以执行以下步骤。
6. 在 PBS 中洗涤 3 倍，加 Ca²⁺和 Mg^2+，各 5 分钟。
7. 加入足够数量的DAPI工作溶液，以完全覆盖细胞，并在RT孵育10分钟。
8. 用 Ca²⁺和 Mg²⁺彻底清洗样品，以去除多余的 DAPI。
9. 取新的玻璃玻片，并在中间添加一滴安装介质。使用滴滴器均匀地铺开安装介质。将单元格正面朝下盖板放在幻灯片上。
   注:如果保护免受光线照射，细胞可以储存30天。

11. 细胞内Ca²⁺瞬态的评估

1. 一旦iPSC-CM至少3个月大，经过代谢选择（第6节），并镀在盖玻片上，用2μL的Fura-2，AM（最终浓度:1μM）处理它们，并在37°C孵育10分钟。
   注:Fura-2 是光敏的。在黑暗中执行所有装载程序和实验。
2. 准备钙和收缩性采集和分析系统。
   1. 为系统供电，确保电弧灯启动（图 1B）。
   2. 将造型室放在系统上，并将泵的管连接到相应的进气口和出口，并将电线从刺激器连接到造型室，如图1C所示。
   3. 用 37 °C 预热 Tyrode 溶液填充流经流体内联加热器的灌注管。
   4. 调整相机和帧光圈尺寸，以尽量减少背景区域。
3. 将带有 iPSC-CM 的玻璃盖玻片安装到造型室中并固定。
4. 将 500 μL 的 Tyrode 溶液直接加入紧固玻璃盖上，然后开始用 Tyrode 溶液对造型室（1.5 mL/min）进行渗透。
5. 使用电气刺激器（10 V，4 ms）使用 1 Hz 现场刺激来加快 iPSC-CM。
6. 在腔室中孵育 iPSC-CM，刺激至少 3⁄5 分钟，使细胞洗涤 Fura-2 染料并适应环境并洗出荧光染料。
7. 将查看窗口调整到玻璃盖玻片的左上部区域。
8. 开始录制。
9. 收集 5×10 个峰值的一致流后，单击"暂停"以暂时停止录制。
10. 确保观察窗口的焦点和尺寸均无变化，将显微镜的台移至相邻区域，向另一端移动，然后继续录制。
11. 重复步骤 11.9 和 11.10 扫描覆盖滑，最初向左移动，然后以锯齿形方式向下覆盖整个盖玻片区域。这包括每个盖玻片 80-100 次测量。
    注: 将总测量时间限制在 10 分钟，因为次要因素会导致 Ca²⁺瞬态性下降。
12. 获得 Ca²⁺瞬变后，根据制造商的说明使用荧光轨迹分析软件分析数据。

结果

图1A中描述的协议生成了高度纯的心肌细胞，这些细胞在培养中具有随时间而获取心室/成人样表型。通过心房和心室肌苷调节光链2异种的免疫荧光染色评估，该协议产生的大多数细胞在诱导心脏分化后的第30天是MLC2A阳性，而MLC2V在同一时间点以更低的数量表示（图2A，顶部面板）。随着文化时间的增加（第 60 天和第 90 天），?...

讨论

使用人类 iPSC-CM 作为实验模型的关键步骤是:1） 生成高质量的心肌细胞 （CM），以确保一致的性能和可重现的结果;（ 1） 生成高质量的心肌细胞 （CM），2） 允许细胞在培养中成熟至少90天，以充分评估其表型;3） 进行电生理学研究，例如钙（Ca^2+）瞬态测量，为人类iPSC-CM提供生理相关功能表征。我们开发了一种基于单层的分化方法，可生产高质量的心室状 iPSC-CM。我们的方法依赖于几个?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal	Sigma Aldrich	A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit	Invitrogen	A21428
B27 Supplement	Gibco	17504-044
B27(-) insulin Supplement	Gibco	A18956-01
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DAPI nuclear stain	ThermoFisher	D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes	Gibco	11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook	Celltreat	229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well	Corning	353046
Fluidic inline heater	Live Cell Instrument	IL-H-10
Fura-2, AM	Invitrogen	F1221
hESC-qualified matrix	Corning	354277	Matrigel Matrix
hPSC media	Gibco	A33493-01	StemFlex Basal Medium
IWR-1	Sigma Aldrich	I0161
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody	Synaptic Systems	311011
Myocyte calcium and contractility system	Ionoptix	ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)	Proteintech	10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane	ThermoFisher	124-0045
PBS with Calcium and Magnesium	Corning	21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium	Corning	21-031-CV
Premium Glass Cover Slips	Lab Scientific	7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)	Gibco	11879-020
RPMI medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093
Sodium L-lactate	Sigma Aldrich	L7022
StemFlex Supplement	Gibco	A33492-01
Thiazovivin	Tocris	3845
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Tyrode's solution	Boston Bioproducts	BSS-355w	Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride