具有体外转录mRNA的初级巨噬细胞的高效转染

摘要

巨噬细胞，特别是原发性巨噬细胞，由于它们专门检测非自源分子，因此很难转染。我们描述了一种协议，它允许使用从DNA模板（如质粒）生成的mRNA对原性巨噬细胞进行高效的转染。

摘要

巨噬细胞是专门检测非自源分子的噬菌体。为此，他们配备了大量模式识别受体（PRRs）。不幸的是，这也使得巨噬细胞特别难以转染，因为转染试剂和转染的核酸经常被PR识别为非自体。因此，转染通常会导致巨噬细胞活化和转染核酸的降解，甚至导致巨噬细胞的自杀。在这里，我们描述了一个协议，它允许高效转染鼠原性巨噬细胞，如围肠巨噬细胞（PM）和骨髓衍生巨噬细胞（BMDM），在体外转录从DNA模板（如质粒）的mRNA。通过这种简单的方案，在未观察到细胞毒性或免疫原性的情况下，PM和BMDM的转染率约为50-65%，BMDM约为85%。我们详细描述了从DNA结构（如质粒和转染过程）转染的mRNA的生成。

引言

巨噬细胞是噬菌体，专门检测、摄取和降解微生物、凋亡细胞和细胞碎片。此外，它们通过分泌细胞因子和化学因子，以及向T细胞和B细胞提供抗原，帮助协调免疫反应。巨噬细胞在许多其他过程中也起着重要作用，如伤口愈合、动脉粥样硬化、肿瘤发生和肥胖。

为了能够检测非自分子，如病原体相关的分子模式（PAMPs）和不合时宜的分子，如损伤相关分子模式（DAMPs），巨噬细胞配备了大量模式识别受体（PRR）1。不幸的是，这也使得巨噬细胞特别难以转^染2作为转染^试剂3和转染核酸4，5，6，7经常被PR识别为非自体。因此，使用化学或物理方法的巨噬细胞转染^通常会导致大噬细胞活化和转染核酸的降解，甚至导致巨噬细胞通过热膜病自杀，这是一种在识别细胞环管PAMPs/DAMPs（如DNA或外来RNA^9）后触发的细胞细胞死亡。使用腺病毒或扁病毒等病毒作为载体的巨噬细胞的生物转染通常效率更高，但构建这种病毒载体却非常耗时，需要生物安全2级^{设备10、11。}

因此，虽然巨噬细胞是深入研究的主题，但由于分子生物学最重要的工具之一，核酸构造的转染，用于外源性表达，因此在分子水平上对其功能的分析受到了阻碍。蛋白质，是很难适用的。这经常迫使研究人员使用类似巨噬细胞的细胞系，而不是真正的巨噬细胞。核酸构造转染的应用包括突变或标记蛋白的表达、特定蛋白质的过度表达、在各自敲除背景中的蛋白质重新表达以及来自其他物种的蛋白质的表达（例如。，Cre 重组酶或指导 RNA 和 Cas9 用于靶向基因敲除）。

在这里，我们描述了一个协议，允许高效转染（通常难以转染）原体噬菌体，即鼠围管巨噬细胞（PM）和骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）与MRNA产生的DNA模板，如质粒。重要的是，使用该协议产生的体外转录mRNA含有自然产生的修饰核苷5-甲基-CTP和伪UTP，降低免疫原性，增强稳定性4，6，7，12，13。此外，在体外转录的mRNA的5'端被南极磷酸酶去磷化，以防止RIG-I复合^体14、15的识别。这最大限度地减少了体外转录mRNA的先天免疫识别。通过我们易于执行的协议，转染率在50-65%（围脑巨噬细胞（PM））和85%（BMDM）之间，而重要的是，没有观察到细胞毒性或免疫原性。我们详细描述 （i） 如何从DNA结构（如质粒）和 （ii） 转染程序本身生成用于转染的免疫沉默的 mRNA。

研究方案

根据德国《动物保护法》，根据科隆大学伦理委员会对小鼠进行巨噬菌体分离。

注:戴上手套执行所有步骤。在层流罩下执行所有转染步骤，以防止细胞受到污染。在使用 mRNA 之前，使用 70% 乙醇和/或 RNAe 降解表面活性剂（材料表）清洁所有仪器，如移液器和每个表面。确保所有反应管无RNA酶和无菌。只使用无菌的无RNA酶水进行稀释。专门使用带过滤器的移液器吸头。在每个移液步骤后更换移液器提示。

1. DNA模板的生成

注:使用该协议的体外mRNA转录的DNA模板必须包含T7前运动序列，以允许RNA聚合酶的对接。如果含有感兴趣的蛋白质的DNA序列的质粒已经包含一个正确定向的T7运动序列，则需要对质粒进行线性化（参见步骤1.1.）。否则，通过聚合酶链反应将 T7 前马达连接到兴趣序列（PCR，参见步骤 1.2.）。

1. T7预运动质粒的线性化
   1. 通过消化，通过限制酶将兴趣序列的停止科顿下游切割，使已经包含正确定向的T7运动序列的质粒线性化。否则，转录在兴趣序列后将无法正常结束。
      注:最好使用限制性酶，留下钝端或5'悬垂。
   2. 通过未消化的胶质DNA与消化质粒DNA的藻酸凝胶电泳，确认质粒的完全线性化。
   3. 使用DNA纯化试剂盒（材料表）在用作体外mRNA转录的DNA模板之前，先纯化线性质粒DNA。
2. PCR 附件 T7 前马达
   1. 使用包含以下组件的正向引基（按指示顺序从 5' 到 3'）:promotor 上游约 5 个随机 bp（例如，GAAAT）;T7前运动序列（TAATACGACTACTATATAT;两个额外的G，提高转录效率（GG）;与起始科顿周围的质粒序列相同的目标序列特定部分。
      注:它应该由:3-6 bp上游的KOZAK序列和启动科顿，KOZAK序列和启动科顿（通常GCCACC ATG G），12-18 bp下游的起始科顿。如果兴趣序列尚未包含 KOZAK 序列或起始科顿，则可以在此步骤中附加这些序列，只需将它们包含在引物序列中即可。
   2. 仅通过考虑零件与目标序列的均值来计算正向引漆的 t_m。
   3. 要评估二聚体/发夹形成，请使用整个引色序列，这很容易超过50 bp。
   4. 使用位于停止科顿下游某处的反向底漆。
      注:如果兴趣序列尚未包含停止号子，则可以在此步骤中附加该兴趣序列，只需将其包含在引物序列中即可。
   5. 使用正向和反向引物使用具有校对的高保真聚合酶执行 PCR（材料表）。
   6. 通过阿加生凝胶电泳（例如，使用1%的胶质凝胶和100 V恒定电流）确认单一产品及放大剂尺寸的生成。
   7. 使用DNA纯化试剂盒作为体外mRNA转录的DNA模板之前，先纯化PCR产物。

2. mRNA 生成

1. 解冻体外mRNA转录试剂盒的所有成分（见材料表）。涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。保持冰上，直到使用。
2. 以以下顺序在0.5 mL微离心管中制备体外mRNA转录反应混合物（总体积为40μL）:20μL的10xARCA/NTP混合物（包含在体外mRNA转录试剂盒中）;0.25 μL的5甲基CTP（最终浓度（f.c.）为1.25 mM;占CTP总量的50%;0.25 μL 的伪 UTP（f.c. 为 1.25 mM;占 UTP 总量的 50%;X=L的DNA模板;2 μL T7 RNA聚合酶混合物（包含在体外mRNA转录试剂盒中）;无RNAE H₂O的 Y μL。
   注:X 是包含至少 1 μg DNA 的体积。例如，625 纳克/μL 库存溶液中为 1.6 μL。Y 是总体积为 40 μL 的备用体积。
3. 涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。在37°C下在400rpm的转速下在热混合器上孵育30分钟，进行体外转录。
4. 然后，将2μL的DNase I直接加入反应混合物中，以去除模板DNA。涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。
5. 在 37°C 下在 400 rpm 转速下在热混合器上孵育 15 分钟。对照凝胶（步骤 3.3）取2μL的等分，并储存在-80°C。
6. 对于聚（A）尾料，将以下成分直接添加到前一反应混合物中（最终体积为50μL）:5μL的10x聚酯（A）聚合酶反应缓冲液和5μL聚酯（A）聚合酶（均包含在体外mRNA转录试剂盒中）。涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。
7. 在 37°C 下在 400 rpm 的转速下在热混合器上孵育混合物 30 分钟。对照凝胶（步骤 3.3）取2μL的等分，并储存在-80°C。
8. 对于 mRNA 5 μ 端的脱磷酸化，将以下组分直接添加到前一个反应混合物中（最终体积为 60 μL）:3 μL 无RNA H₂O;6 μL 10x南极磷酸酶反应缓冲液;3 μL 南极磷酸酶（15 个单位，用于 60 μL 反应体积）。涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。
9. 在 37°C 下在 400 rpm 转速下在热混合器上孵育混合物 30 分钟。
10. 在80°C孵育2分钟，使南极磷酸酶失去热活性。
    注:理想情况下，使用单独的热混合器，不要等到第一个混合器达到所需温度。

3. mRNA 纯化

1. 使用专用的RNA纯化试剂盒（材料表）纯化体外转录的mRNA。
   1. 从步骤2.10向mRNA反应混合物中加入X μL洗脱溶液。通过反转 5 次进行混合。加入300μL的装订溶液浓缩物。通过温和的移液5次混合。
      注:X 是总体积为 100 μL 的备用卷。例如，将40μL洗脱溶液加入60μL mRNA反应混合物中。
   2. 加入100μL无RNA酶乙醇。通过温和的移液5次混合。
   3. 在提供的收集管之一中放置一个过滤器列。将 mRNA 反应混合物轻轻转移到过滤器的中心，而不接触过滤器。在室温 （RT） 下，在 15，000 x g下离心 1 分钟。
   4. 小心地抬起滤芯柱，并丢弃收集管中的流过。将过滤器柱放回同一收集管中。
   5. 加入500μL的洗涤溶液（不要忘记在首次使用洗涤溶液之前加入20mL无RNA酶乙醇）。
   6. 在 RT. 重复步骤 3.1.4-3.1.6 时，在 15，000 x g下离心 1 分钟，再清洗一次。
   7. 全速（17，900 x g）在RT下离心1分钟，以清除滤芯柱上的任何残留液体。小心地从收集管中取取滤芯柱。将过滤器列放在新的收集管中。
   8. 在不接触过滤器的情况下，将 50 μL 的洗脱缓冲液添加到过滤器的中心。在65°C下在热混合器上孵育10分钟。
   9. 在 RT 下以 15，000 x g 离心 1 分钟，拆下滤芯并丢弃。
2. 例如，使用微体积分光光度计测量 260 和 280 nm 的吸光度，测量洗脱的 mRNA 的浓度和纯度。
   注:A260/A280 比率为 1.8-2.1 表示高度纯化 mRNA。
3. 通过在变性条件下分析步骤 2.5 和 2.7 步骤中的异位，验证单个产品、正确的转录长度和聚（A） 尾液的存在（例如，使用含有 20 mM 3-（N-形态诺） 的 1.2% agarose 凝胶丙苯丙酸 [MOPS]，5 mM 醋酸钠，1 mM EDTA 和 20% 甲醛，在 20 mM MOPS、5 mM 醋酸钠、1 mM EDTA 和 0.74% 甲醛中运行，电流为 100 V 恒流。
4. 将纯化的mRNA储存在-80°C的洗脱管中，直到转染。如果只使用少量的mRNA转染，则与mRNA等分，以避免重复的冻融循环。
   注:mRNA可在-80°C下储存约1年。

4. 巨噬菌体准备

1. 通过宫颈脱位使C57/BL6小鼠（使用同性小鼠和6-24周年龄的小鼠）实施安乐死。
   注:相同的小鼠可用于分离PM（步骤4.2）和生成BMDM（步骤4.3和4.4）。对于 PM 的隔离，请至少使用两只鼠标。如果只生成 BMDM，通常只需一个鼠标就足够了。
2. 围肠巨噬细胞的免疫磁富集。
   1. 将 10 mL 注射器与 8 mL 的冰冷磷酸盐缓冲盐 （PBS） 和 2 mL 空气一起填充 0.9 x 40 mm 管条。用 PBS 冲洗围周腔。空气将形成气泡，以尽量减少 PBS 的泄漏。
   2. 使用相同的注射器快速收集围网洗漱，并转移到50 mL锥形离心管中。如果需要，结合多只小鼠的围细胞。保持细胞悬浮在冰上。
   3. 离心细胞悬浮在650 x g下，在4°C下悬浮5分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在5 mL 0.2% NaCl中，30s，以赖以治疗红血球。
   4. 将 5 mL 的 1.6% NaCl 添加到 10 mL 的总体积中，以重建等向条件。在 650 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。
   5. 每1次围肠洗菌（例如，如果三只小鼠被冲洗，在292.5μL中重新悬浮在PBS中的5%牛血清白蛋白[BSA]）中，在97.5 μL的磁性细胞分拣（MCS）缓冲液（2mM乙二胺乙酸[EDTA]，PBS中的5%牛血清白蛋白[BSA]）中重新悬浮细胞颗粒).
   6. 每97.5μL细胞悬浮液中加入2.5μL的顺磁珠，加入CD11b特异性抗体（例如，将7.5μL添加到292.5μL）。
   7. 在轨道摇床上以150rpm的转速在冰上孵育15分钟。
   8. 在650 x g下，离心细胞悬浮5分钟，在4°C下，丢弃上清液，并在1mL的MCS缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。
   9. 将 4 mL 的 MCS 缓冲液添加到 5 mL 的总体积中，通过轻轻上下移液三次来清洗细胞。
   10. 重复步骤 4.2.8 和 4.2.9 两次，总共三个洗涤步骤。
   11. 在洗涤步骤中，在磁性细胞分离器中放置一个LS列（参见材料表）。用 3 mL 的 MCS 缓冲液冲洗该柱。
       注:避免任何气泡，因为这些气泡可能会堵塞列。
   12. 在 MCS 缓冲液的 1 mL 中重新悬浮细胞颗粒。将 3 mL 的 MCS 缓冲液添加到 4 mL 的总体积中，通过上下移液混合三次。
   13. 将 4 mL 的细胞悬浮液转移到冲洗过的 LS 柱上。
       注:同样，避免任何气泡，因为这些气泡可能会堵塞列。
   14. 等待，直到列的储藏库完全清空。在柱停止滴落之前，不要添加额外的液体。
   15. 将 3 mL 的 MCS 缓冲区添加到列上。然后，等待，直到列的储层完全清空。重复步骤 4.2.15 再重复两次。
   16. 将 LS 柱放入 15 mL 锥形离心管中。将 5 mL 的 MCS 缓冲区应用于列。等待 2 mL 的液体通过柱，然后使用柱塞轻轻地将剩余馏分推入管中。
   17. 离心细胞悬浮在650 x g下，在4°C下悬浮5分钟，并丢弃上清液。
   18. 在 1 mL 的 DMEM 中重新悬浮细胞颗粒，辅以 10% 热灭活胎儿小牛血清 （FCS） （DMEM+FCS）。
   19. 通过在 Neubauer 计数室中的锥蓝色溶液中计数，在 DMEM_FCS 中将种子细胞计数到培养板中，确定可存活细胞的数量。
       注:种子PM在100，000个细胞/孔的扁平底部微粒板的密度。不要使用组织培养处理的板，因为 PM 不能从这些板分离。改用未经处理的盘子。
3. BMDM 的生成
   1. 用剪刀从后腿上去除皮肤和肌肉。用70%乙醇的短浸液清洗每条腿。
   2. 用剪刀切开双腿，打开股骨和头骨的两端。
   3. 将装有0.6 mm x 30 mm管状的5 mL注射器填充，内毒素（VLE）RPMI 1640，并将骨髓从打开的骨骼中冲洗到培养盘中。
   4. 如果需要重复步骤 4.3.1-4.3.3，结合多个小鼠的骨髓。将骨髓转移到50 mL锥形离心管中。
   5. 在4°C下将骨髓悬浮液在650 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
   6. 在5 mL红细胞赖舍缓冲液（8.3% NH₄Cl，0.1 M Tris）中重新悬浮细胞颗粒，并在RT孵育5分钟以赖解红血球。
   7. 在 4°C 下将细胞悬浮液在 650 x g下离心 5 分钟，然后丢弃上清液。
   8. 在 1 mL 的 VLE RPMI 1640 介质中重新悬浮细胞颗粒，辅以 10% FCS、1% 青霉素/链霉素、1% HEPES、1% 丙酸钠和 10 纳克/mL 重组巨噬细胞菌群刺激因子 （M-CSF） （RPMI⁺⁺）。
   9. 将 4 mL 的 RPMI⁺添加到 5 mL 的总体积中。
   10. 将 7 mL 的 RPMI⁺介质移入每盘，每只鼠标可用凸轮（参见材料表）准备 5 个 92 mm x 16 mm 未经处理的培养皿。
   11. 将1mL的细胞溶液转移到5个准备好的培养皿中，并在37°C和5%CO₂下孵育。
   12. 4天后，通过添加 4 mL 的 RPMI⁺来给细胞喂食。6-7天后，骨髓细胞完全分化成BMDM。
4. 收获BMDM
   1. 从培养皿中完全去除介质。在 PBS 中加入 5 mL 的温暖 0.2 mM EDTA 到每道菜中。
   2. 用细胞刮刀轻轻刮擦整个板，以分离 BMDM。将细胞悬浮液组合在50 mL锥形离心管中。
   3. 再次冲洗所有 5 道菜。在所有 5 道菜中，在 PBS 中使用相同的 5 mL 热 0.2 mM EDTA 的体积。将此电池悬架与上一步骤中的一个组合。
   4. 在 4°C 下将细胞悬浮液在 650 x g下离心 5 分钟，然后丢弃上清液。
   5. 在 1 mL 的 VLE RPMI 1640 介质中重新悬浮细胞颗粒，辅以 10% FCS、1% HEPES、1% 丙酸钠和 10 纳克/mL 重组剂 M-CSF，但没有抗生素 （RPMI^+）。
   6. 通过在 Neubauer 计数室中的锥蓝色溶液中计数，在 RPMI⁺中将种子细胞计数到培养板中，确定可存活细胞的数量。
      注:种子BMDM在平底微粒板中最大密度为50，000个细胞/孔。不要使用组织培养处理的板，因为BMDM很难从这些板分离。改用未经处理的盘子。

5. 巨噬细胞与mRNA的转染

1. 计算所需的mRNA转染缓冲液体积。
   注:所需的mRNA转染缓冲液的体积取决于井的大小:在6孔板中使用200μL转染，在12孔板中使用100μL，等等。由于移液损失，始终添加一点备用体积（但不要过多，以防止 mRNA 过度稀释）。例如，使用 450 μL 而不是 4 x 100 μL = 400 μL 在 12 孔板的 4 个孔中转染。
2. 计算所需的mRNA转染试剂体积。mRNA 转染试剂以 1:50 的比例添加。例如，450 μL的最终体积需要9μL的mRNA转染试剂。
3. 计算所需的mRNA总量。高效转染至少需要每100，000个巨噬细胞100纳克，200纳克效果更好（例如，800纳克RNA转染400，000个巨噬细胞）。
   1. 将计算出的mRNA量与必须转染的孔总数相乘（例如，4口井，每口400，000个巨噬细胞:4个800纳克= 3，200纳克RNA，所有孔总共需要）。例如，如果您的 mRNA 库存为 426.8 纳克/μL，则需要 7.49 μL 才能对 4 口井进行最佳转染，每个井具有 400，000 个巨噬细胞。
4. 将mRNA转染缓冲液的计算体积（步骤5.1.）减去mRNA转染试剂（步骤5.2）和mRNA（步骤5.3）的体积，加入反应管。例如，450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL。
5. 解冻mRNA股票，并通过洗脱管的温和翻转混合。使用 mRNA 反应缓冲液将 mRNA 的计算体积（步骤 5.3）添加到反应管中（在上面提供的示例中:433.51 μL 中的 7.49 μL）。
6. 涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。
7. 涡旋 mRNA 转染试剂 5 s，在 2，000 x g 下旋转 2 s。
8. 将mRNA转染试剂的计算体积（步骤5.2）添加到含有mRNA转染缓冲液和mRNA的反应管中（在上面介绍的示例中:mRNA转染试剂的9μL）。
9. 涡旋转染混合物5s和旋转2s在2000 x g。
10. 在 RT 孵育 15 分钟。
11. 同时，用新鲜、温暖的培养基体替换巨噬细胞的培养基（参见步骤4.2.18和4.4.5）。
12. 孵育步骤5.10后，将转染混合物添加到含有巨噬细胞的孔中，其体积适合井的大小（参见步骤5.1）。将转染混合物从井外到井中间的圆圈滴入一个圆圈中。
13. 轻轻摇动板，先垂直，然后水平方向，以确保转染混合物在井中均匀分布。然后，在37°C和5%CO₂孵育。转染mRNA编码的蛋白质的合成将在转染后不久开始。为获得最佳效果，孵育至少6小时。
14. 孵育后，通过（免疫）荧光显微镜、流式细胞学或免疫^管16分析转染效率，或使用转染巨噬细胞进行首选实验。

结果

我们已经成功地使用该协议为FLAG标记的NEMO和IKK+变体生成mRNA编码，用于转染原巨噬^细胞16。FLAG 标记野生型 （NEMO^WT） 和 C54/347A 突变 NEMO （NEMO^C54/374A）（见材料表）的质粒编码已经包含方向正确的 T7 前电机 （图 1A）。因此，我们只需要线性化质粒，以生成体外转录的DNA模板。为此，用5μL Xb...

讨论

在这里，我们提出了一个协议，用于使用体外转录mRNA对通常难以转染的通常难以转染的初级巨噬细胞进行高效转染。重要的是，使用该协议的巨噬细胞转染不会诱发细胞死亡或激活亲炎信号，表明转染试剂和转染的mRNA均不被识别为非自体。

mRNA的质量对于使用该协议成功转染巨噬细胞至关重要。因此，应非常小心，mRNA不会与RNA接触（例如，通过受污染的缓冲液或小瓶）。如?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-methyl-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase	New England BioLabs	M0289	stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x)	New England BioLabs	B0289	stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody	Invitrogen	MA1-41046	stored at -20 °C
anti-β-actin antibody	Sigma-Aldrich	A2228	stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams	Sarstedt	821,473	stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human	Miltenyi Biotec	130-049-601	stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x)	Thermo Scientific	B64	stored at -20 °C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs Inc	M0491S	stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)	New England BioLabs	E2060	stored at -20 °C
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	stored at RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid	Addgene	11105	stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid	Addgene	62043	stored at -20 °C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid			F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	stored at -20 °C
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated	BioLegend	101212	stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated	eBioscience	12-4801-82	stored at 4 °C
Recombinant M-CSF	Peprotech	315-02	stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit	ThermoFisher Scientific	AM1908	stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4	Invivogen		stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid	Addgene	11103	stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid	Addgene	27268	stored at -20 °C