分离外体富集的细胞外囊泡携带颗粒细胞-巨噬细胞-胚胎干细胞的细胞外刺激因子

摘要

这项研究描述了一种将携带免疫刺激性粒细胞巨噬细胞刺激因子的外细胞富集细胞外囊泡从胚胎干细胞中分离的方法。

摘要

胚胎干细胞（ESCs）是多能干细胞，能够自我更新和分化到所有类型的胚胎细胞。像许多其他细胞类型一样，ESC 将小膜囊泡（如外显子）释放到细胞外环境中。外显子是细胞间交流的重要中介，在许多（病理）生理过程中发挥着基本作用。粒细胞-巨噬细胞群刺激因子（GM-CSF）作为细胞因子调节免疫反应。GM-CSF在外显子中的存在有可能增强其免疫调节功能。在这里，GM-CSF在穆林ESC细胞系ES-D3中被稳定地过度表达。开发了一个协议，将高质量的外体富集细胞外囊泡（EV）与ES-D3细胞分离出来，从而过度表达GM-CSF。孤立的外体丰富的电动汽车的特点是各种实验方法。重要的是，在富含外显子的电动汽车中发现了大量GM-CSF。总的来说，来自ESC的具有转基因-CSF的外生丰富型电动汽车可以作为无细胞囊泡来发挥其免疫调节作用。

引言

ESC来自植入前胚胎¹的胚泡阶段。作为多能干细胞，ESC有能力自我更新并分化成任何类型的胚胎细胞。由于其显著的发展潜力和长期增殖能力，ESC对生物^{医学研究具有}极其宝贵的价值。目前的研究工作主要集中在ESC治疗各种重大病理疾病的潜力，包括糖尿病，心脏病和神经退行性疾病^2，3，4。

众所周知，哺乳动物细胞，包括ESC，会向细胞外环境释放大小不一的囊泡，这些EV由于在细胞^间通信中的作用而具有许多生理和病理功能。在不同的子类型EV中，外显子是小膜囊从不同细胞类型释放到细胞外空间后融合的中间内分泌室，多血管体（MVB），与等离子膜^6。据报道，外显体可以调解细胞间的交流，并严重参与许多（病理）生理过程^7，8。外显子从它们自己的母细胞中继承了一些生物功能，因为外体含有从细胞溶胶中获取的生物材料，包括蛋白质和核酸。因此，相关的抗原或刺激特定疾病免疫反应的因素被封装在特定类型的细胞⁹的外源中。这为探索肿瘤衍生外显体作为抗癌疫苗¹⁰的临床试验铺平了道路。

GM-CSF是由不同类型的免疫细胞¹¹分泌的细胞因子。新出现的证据表明，GM-CSF激活和调节免疫系统，并在抗原^{呈现过程中发挥}着至关重要的作用。例如，一份临床报告表明，GM-CSF刺激免疫反应肿瘤作为疫苗辅助剂^13。在¹⁴日的临床试验中，研究了几种基于GM-CSF的癌症免疫治疗策略，以利用GM-CSF强大的免疫刺激活性。其中，由辐照GM-CSF分泌肿瘤细胞组成的癌症疫苗通过诱导细胞和幽默抗肿瘤反应以及随后转移肿瘤¹⁵中的坏死，在晚期黑色素瘤患者中显示出一定的希望。

由于来自ESC的外显子具有与原始ESC相似的生物活动，因此可能来自ESC的转基因-CSF携带的外体可以起到无细胞囊泡的作用，以调节免疫反应。本文介绍了从ESC中生产出高质量外体浓缩电动汽车的详细方法，该方法表达了GM-CSF。这些富含外体的电动汽车有可能作为免疫调节囊泡来调节免疫反应。

研究方案

1. 培养ES-D3细胞

1. 要生成无外显子的母牛血清 （FBS），在 4 °C 下以 100，000 x g 的速度将 FBS 装载到超中心和离心机中，持续 16 小时。 离心后，收集血清超高纳特作为无外奥体的FBS，用于培育粘膜ESC细胞系ES-D3和获得富含外体的EV。
2. 在电镀ES-D3细胞之前，在室温下使用明胶（0.1%）涂抹15厘米的组织培养皿30分钟。
3. 按照先前描述的协议^16，培养ES-D3细胞没有喂食层细胞在明胶涂层的15厘米组织培养皿。ES-D3细胞培养基由DMEM、无外显子FBS（15%）组成， 非必要的氨基酸（0.1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、β-甲醇（0.1mM）、青霉素（50单位/mL）、链霉素（50微克/mL）和白血病抑制因子（LIF;100单位/mL）。在 5% CO₂ 加湿孵化器中，在 37 °C 下培养 ES-D3 细胞。
4. 一旦ES-D3细胞在15厘米的组织培养皿中达到90%左右的汇流，通过吸气去除介质。使用试丁石（5ml;0.05%）清洗细胞。将试丁鱼 （5 mL） 添加到菜肴中，在 37 °C 下孵育 5 分钟。从盘子中收集细胞。
5. 在收集的细胞中加入新鲜培养介质 （5 mL） 以灭活试丁二醇。将细胞以 390 x g 离心 5 分钟。将细胞重新用新鲜介质中恢复，并使用血细胞计确定细胞数。
6. 对于传递细胞，将ES-D3细胞（5 x 10^6）镀在明胶涂层（0.1%）15厘米组织培养皿中，用新鲜介质（15 mL）培养3天，然后再对细胞进行亚培养。
7. 为了收集细胞培养超高分子以隔离外层丰富的电动汽车，在收集细胞培养超高剂之前，将ES-D3细胞（1 x^{10 7）}在明胶涂层（0.1%）15厘米组织培养皿中，用新鲜介质（15mL）镀3天。

2. 转基因-CSF表达质粒的生成

注:生成转染质粒 pEF1+ -mGM-CSF-IRES-hrGFP，在 ES-D3 细胞中过度表达 GM-CSF。在这个质粒中，穆林GM-CSF cDNA的表达以及标记蛋白人性化的Renilla再造GFP（hrGFP）是由人类多肽链拉长因子1+（EF1+）促进剂^17，18驱动的。

1. 生成矢量骨干。
   1. 在 37 °C 的 2 小时中，使用限制酶 EcoRI （100 单位） 以 37 °C 为 2 小时消化质粒 pEF1+-FD3ER-IRES-hrGFP （20 μg DNA），生成两个 DNA 片段:矢量骨干（6.0 kb）和 FD3ER 插入（2.5 kb）。
   2. 将消化的质粒DNA（10 μg）的50%转移到一个1.5mL微中心管中，在37°C为1小时时用碱性磷酸酶（20单位）治疗。使用阿加罗斯凝胶电泳（2%）解决未经治疗和脱磷脱磷的DNA。
   3. 使用DNA凝胶提取包净化病媒骨干DNA片段（6.0 kb）。虽然未经处理的病媒骨干将用作空载体（pEF1+-IRES-hrGFP），但脱磷载体骨干将用于生成GM-CSF表达质粒（pEF1+-mGM-CSF-IRES-hrGFP）。
2. 生成 GM-CSF cDNA 插入。
   1. 在 37 °C 2h 下使用限制酶 EcoRI （100 单位） 消化质粒 pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP¹⁹ （20 μg），以产生两个 DNA 片段:矢量骨干（6.5 kb） 和穆林 GM-CSF cDNA 插入（474 bp）。
   2. 通过阿加罗斯凝胶电泳（2%）解决消化的DNA。使用DNA凝胶提取试剂盒净化穆林GM-CSF cDNA片段（474 bp）。
3. 生成表达质粒。
   1. 使用DNA连体件设置2个连合反应（10 μL 总体积）。
      1. 要生成空矢量 pEF1+ -IRES-hrGFP，从步骤 2.1.3（6.0 kb;500 ng）中将未经处理的矢量骨干液化。
      2. 生成 pEF1+ -mGM-CSF-IRES-hrgFP， 将以下DNA片段连结:（1） 从第 2.1.3 步（6.0 kb;500 ng）和 （2） 第 2.2.2 步（474 bp;200 ng）中生成的 mGM-CSF cDNA 片段。
   2. 利盖特在 25 °C 为 5 分钟。将液化DNA转化为DH5+称职 大肠杆菌 细胞。将转化后 的大肠杆菌 细胞镀在含有卡苯西林（50微克/mL）的LB-agar板上。
   3. 使用DNA分离试剂盒从单一 大肠杆菌 群中净化质粒。通过DNA测序验证质粒的身份。

3. ES-D3细胞的生成过度表达GM-CSF

注:用质粒 pEF1+ -mGM-CSF-IRES-hrGFP 将 ES-D3 细胞转换为过度表达的 GM-CS。将质粒pBabe-Neo共生到ES-D3细胞中，以方便选择稳定转染的细胞^18，20。

1. 将质粒转移到ES-D3细胞中。
   1. 将ES-D3细胞（1.4 x 10^6）镀在明胶涂层（0.1%）10厘米组织培养皿中，培养介质（10ml）进行转染。培养镀ES-D3细胞在37°C为24小时。
   2. 在 1.5 毫升微中心管中准备两种质粒混合物: （1） pEF1+ -IRES-hrGFP （28 μg， 向量控制） 与 pBabe-Neo （4 μg） 和 （2） pEF1 + - mGM - CSF - iRES - hrgfp （28 μg， 表示 GM-CSF） 与 pBabe-Neo （4 μg）.。按照制造商的协议使用转染套件进行转染。
   3. 将转染介质（1 mL）和转染试剂（64微升）加入含有质粒混合物的管中，并在室温下孵育5分钟。
   4. 将转染混合物加入ES-D3细胞的10厘米盘子中。在 37 °C 下孵育 5 小时。
   5. 用新鲜培养介质（10 mL）替换 10 厘米菜肴中的介质。在 37 °C 下孵育 24 小时。
2. 生成稳定转染的ES-D3细胞的大量种群。
   1. 从转染的 ES-D3 细胞中取出介质。用试丁石（2 mL;0.05%）清洗细胞。加入试丁鱼（2 mL），在37°C孵育5分钟。将细胞转移到 15 mL 离心机管中，并添加 2 mL 的新鲜培养介质来中和试管素。离心机在 390 x g 5 分钟。
   2. 在新鲜培养物介质（10 mL）中重新使用受感染的细胞。根据制造商的协议，使用荧光激活的细胞排序 （FACS） 评估转基因 ES-D3 细胞中 GFP 的荧光强度。
   3. 将转染的细胞转移到两个10厘米的盘子中，其中含有新鲜培养介质（10ml）。加入新霉素（0.5毫克/毫升），以消除未受感染的细胞。
   4. 继续培养含有新霉素（0.5毫克/毫升）培养基的转染细胞。当转染的ES-D3达到90%的汇流时，再次将细胞转移到15厘米的组织培养皿中。重复此过程 2 周。
3. 生成稳定转染的ES-D3细胞的克隆。
   1. 一旦生成了稳定转染的ES-D3细胞的大量种群，就会像以前一样收集细胞。使用血细胞计确定细胞数。将细胞以 390 x g 离心 5 分钟。在新鲜培养介质中重新使用细胞（1 x^{10 7} 细胞/mL）。
   2. 通过无菌的 40 μm 细胞过滤器过滤细胞。按照制造商的协议，使用 FACS 净化 GFP 阳性 ES-D3 细胞。
   3. 将单个排序的ES-D3细胞板板放入明胶涂层（0.1%）96井组织培养板的一口井中，该培养板含有无新霉素介质（200微升）中的母体ES-D3细胞（1 x 10^3）。与未受感染的亲子细胞共同培育受感染的ES-D3细胞，确保稳定地转染单个ES-D3细胞作为单个克隆存活并增殖。
   4. 培养细胞48小时，然后加入新霉素（0.5毫克/mL）到96井板，以消除未翻译的父母ES-D3细胞。
   5. 继续在96井组织培养板中培育GFP阳性ES-D3细胞，其中含有新霉素（0.5毫克/毫升）1周。将克隆ES-D3细胞系转移到明胶涂层（0.1%）6厘米组织培养皿与培养基（5 mL）含有新霉素（0.5毫克/mL）1周。
   6. 根据制造商的协议，使用 FACS 确定每个转染的 ES-D3 细胞克隆中 GFP 荧光的强度。选择表达GM-CSF或具有高绿色荧光水平的空载体的ES-D3克隆。
   7. 根据制造商的协议，使用粘膜 GM-CSF ELISA 套件确定 ES-D3 细胞分泌的 GM-CSF 数量。

4. 分离出体丰富的细胞外囊泡

1. 在 37 °C 下将 ES-D3 细胞（1 x^{10 7）}培养在 15 厘米组织培养皿中，培养 72 小时。 收集细胞培养超高。商店在 4 °C 下收集超高纳坦，最长达 1 周，以保持外显体完整性。
2. 用离心机将细胞培养超高分子在 5，000 x g 下离心，在 4 °C 下进行 60 分钟，以沉积大细胞片段。
3. 使用超中心喷气在 4 °C 下以 100，000 x g 收集超高离心机 90 分钟。
4. 取出超高超。用磷酸盐缓冲盐水（PBS;1 mL）轻轻冲洗每个颗粒两次，以去除残留培养物超高超。
5. 在 PBS 中重新使用每个颗粒。通过蛋白质含量⁵来量化富含外体的 EV。
   1. 用双辛酸 （BCA） 检测外层富集 EV 的蛋白质浓度。ES-D3细胞中富含外体的EV的预期产量约为4微克蛋白质/mL的细胞培养超高。在 PBS 中重新使用富含体的 EV（蛋白质浓度:+6 μg/μL）。将富含外体的 EV 存储在 -80 °C 下。

5. 通过传输电子显微镜对外体富集的细胞外囊泡进行定性

注:使用传输电子显微镜^{（TEM）5，}研究从ESC分离出来的富含外体的电动汽车的组成和结构。

1. 将富含外体的 EV（3-5 μg/μL）在室温下将 2% 的 EM 级副甲醛固定在 2 小时。
2. 用碳支持膜将固定样品 （10 μL） 加载到铜格栅上。用铜网格孵育样品1分钟，然后用滤纸排干网格。
3. 按照制造商的协议用染色解决方案弄脏网格。
4. 使用钳子将网格传输到一张滤纸上。允许网格在室温下通宵干燥。
5. 根据制造商的协议，使用传输电子显微镜（50，000 倍放大倍）获取电子显微镜图像。

6. 通过西方斑点分析对富含外体的细胞外囊泡的评价

1. 准备整个细胞提取物。
   1. 从 15 厘米盘中培养的 ES-D3 细胞中取出介质。用试丁石（5ml;0.05%）清洗细胞。在细胞中加入试丁石（5ml）。在 37 °C 下孵育 5 分钟。收集细胞并添加新鲜培养介质 （5 mL） 来中和试丁石。将细胞以 390 x g 离心 5 分钟。重新暂停 PBS 中的细胞。
   2. 使用血细胞计确定细胞数。以 390 x g 再次离心细胞 5 分钟。在 SDS-PAGE 加载缓冲器中重新暂停包含 0.5% SDS（5，000 个单元格/μL）的电池。
   3. 使用振幅为 10% 的声波器（功率:500 W;超声波频率:20 kHz）对样品进行 10s 的声波处理。在 100 °C 下加热样品 5 分钟。
2. 准备富含外体的电动汽车的解质。
   1. 在 SDS-PAGE 装载缓冲器中重新使用富含外体的 EV，该缓冲器的浓度为 1.2 μg/μL，其中包含 0.5% SDS。
   2. 使用振幅为 10% 的声波器（功率:500 W;超声波频率:20 kHz）对样品进行 10s 的声波处理。在 100 °C 下加热样品 5 分钟。
3. 通过西方污点检测蛋白质。
   1. 将全细胞提取物（10 μL;5，000个细胞/μL）和富含外体的EV裂解剂（10 μL;1.2 μg/μL）装载到 Bis-Tris PAGE 凝胶（4-20%）的每个井中。将蛋白质转移到氟化物聚乙烯（PVDF）膜上。
   2. 用适当的初级和二级抗体孵育膜。在含有PBS、Tween-20（0.2%）和脱脂干牛奶（10%w/v）的印迹缓冲中稀释抗体（在下面所示的浓度）中。
      1. 使用以下主要抗体:抗附素V（200 ng/mL）、抗CD81（50 ng/mL）、抗浮法林-1（200 ng/mL）、抗细胞色素c（10） 0 ng/mL）、抗蛋白脱硫异构酶（200 ng/mL）、抗GAPDH（33 ng/mL）和抗牛磷COXX IV-亚细胞IV（600 ng/mL）。
      2. 使用以下二级抗体:过氧化酶结合山羊抗兔IgG（20 ng/mL）和过氧化酶结合山羊抗鼠IgG（20 ng/mL）。
   3. 使用增强的化疗检测包检测蛋白质。

7. 由 ELISA 确定外层富集的细胞外囊中的 GM-CSF 浓度

注:根据制造商的协议，对 ELISA 在富含外体的 EV 中的 GM-CSF 数量进行评估，并根据制造商的协议进行一些修改。

1. 用捕获抗体涂抹 ELISA 板。单独在 PBS 或 PBS 中单独处理富含外体的 EV（0.6 μg），或在室温下将 0.05% Tween-20 （100 μL） 治疗 30 分钟。将经过处理的样品添加到涂层的 ELISA 板中，并在室温下孵育 1 小时。单独用 PBS 或 PBS 清洗盘子 = 0.05% Tween-20。
2. 在样品中添加检测抗体。在室温下孵育1小时。单独用 PBS 或 PBS 清洗盘子 = 0.05% Tween-20。在样品中添加阿维丁-HRP。在室温下孵育30分钟。单独用 PBS 或 PBS 清洗盘子 = 0.05% Tween-20。
3. 通过测量微板读卡器上 450 nm 的吸水量，确定外体富集 EV 中 GM-CSF 的浓度。

结果

GM-CSF 在穆林 ESC 中表达过度。
为了在ES-D3细胞中稳定地过度表达GM-CSF，将MM-CSF cDNA克隆成一个转染载体，以生成表达载体pEF1+-mGM-CSF-IRES-hrGFP（图1A）。通过转染，GM-CSF在ES-D3细胞中表达过度，约20%的瞬态瞬态瞬态ES-D3细胞为GFP阳性。细胞克隆稳定过度表达GM-CSF或空矢量控制被FACS收购。如图1 B

讨论

本研究展示了一种高效的方法，可以产生携带免疫刺激蛋白GM-CSF的富含外体的EV，可用于研究富含外体的电动汽车的免疫调节作用。一些研究表明，外显体表现出免疫调节和抗肿瘤功能^22。因此，来自表达转基因-CSF的ESC的外显子可能也具有调节免疫反应的生物活动。在本协议中，外源性粘液GM-CSF通过转染在木质ES-D3细胞中稳定过度表达（图1）。重要的是，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline phosphate, Calf Intestinal	New England Biolabs	M0290S	Dephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAb	Santa Cruz Biotechnology	clone H-3, sc-74438	Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAb	Santa Cruz Biotechnology	clone B-11, sc-166029	Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAb	Santa Cruz Biotechnology	clone A-8, sc-13156	Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAb	Santa Cruz Biotechnology	clone C-2; sc-74566	Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAb	Rockland	600-401-A33S	Western blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated	Thermo Fisher	31430	Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb	Thermo Fisher	clone 20E8C12 A21348	Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb	Enzo	ADI-SPA-890	Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated	Thermo Fisher	31460	Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assay	Thermo Fisher	23223	Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%	Genscript	M42015	Western blot
Carbenicillin, Disodium Salt	Thermo Fisher	10177012	Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPI	Beckman Coulter		Low speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10	Beckman Coulter	09U1597	Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCO	Thermo Fisher	3120-0500PK	Low speed centrifugation
Cu grids with carbon support film	Electron Microscopy Sciences	FF200-Cu	Acquiring electron microscopy images
EcoRI	New England Biolabs	R0101	Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection system	Thermo Fisher	32106	Western blot
FACScalibur flow cytometer	Becton Dickinson		Examining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serum	ATCC	SCRR-30-2020	Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm	Thermo Fisher	22-363-547	Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%)	Thermo Fisher	ES006B	Culturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kit	Thermo Fisher	88733422	Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Thermo Fisher	10-829-018	Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory Factor	Thermo Fisher	ESG1106	Medium for ES-D3 cells
L-glutamine	VWR	VWRL0131-0100	Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher	11668019	Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XS	BioTek		Determining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorter	Beckman Coulter		Isolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2988J	Generating GM-CSF expression plasmid
Neomycin	Thermo Fisher	10-131-035	Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acids	Thermo Fisher	SH3023801	Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milk	Thermo Fisher	NC9022655	Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062	Transfecting ES-D3 cells
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycin	VWR	sc45000-652	Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP	Addgene	37270	Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranes	Millipore EMD	IPVH00010	Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	QIAGEN	28704	Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200S	Generating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscope	Hitachi	HT7700	Acquiring electron microscopy images
Trypsin	VWR	45000-660	Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP	Beckman Coulter		High speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45Ti	Beckman Coulter	09U4454	High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottle	Beckman Coulter	355622	High speed centrifugation
UranyLess staining solution	Electron Microscopy Sciences	22409	Acquiring electron microscopy images