使用基于频率域的摄像机系统的 O2的发光寿命成像

摘要

我们描述了使用新型频域发光寿命相机绘制 2D O₂分布图和光学传感器箔。介绍了相机系统和图像分析程序，以及传感器箔的制备、校准和应用，以可视化水生植物根系层中的_O2微环境。

摘要

我们描述了一种在高空间（<50-100 μm）和时态（<10 s）分辨率下以2D图像溶解氧_（O2）的方法。该方法采用_O2敏感发光传感器箔（平面光片）与专用相机系统结合使用，用于在频域中成像发光寿命。平面光片的制备是通过将O₂敏感指示染料溶解在聚合物中，并通过刀涂在固定厚度的固体支撑上分配混合物。溶剂蒸发后，平面光片与感兴趣的样品密切接触- 这里用水生植物Littorella单花的根系演示。平面光片内指示器染料的发光寿命中的 O₂浓度相关变化通过透明载体箔和水族馆壁的背面使用专用摄像机进行成像。该摄像机通过调制激励信号和发射信号之间的相位角度偏移来测量发光寿命 （μs）。该方法优于发光强度成像方法，因为信号与激发源的染料浓度或强度无关，完全依赖于发光衰减时间，这是一个内在参考的参数。因此，不需要额外的参考染料或其他参照方法。我们演示了该系统用于植物根瘤球的宏观_O2成像，但相机系统也可以很容易地耦合到显微镜。

引言

沉积物和土壤中溶解气体和离子的分布和动力学提供了生物地球化学过程的关键信息，如微生物呼吸^1、2或植物根部^3、4、5的径向氧损失，以及微生物^6、7、植物^{根瘤5、8、9}和动物洞穴¹⁰的化学微环境^{。 11，12}.这种扩散有限环境中的生物和化学活性可产生化学基质或生物地球化学过程产物的陡坡。特别是_，O2的可用性对生物地球化学过程产生了巨大影响，从而对一个系统的生物学和生态学产生了^巨大影响。因此，以高空间和时间分辨率分析_O2浓度在水生和陆地科学中至关重要。首先，电化学和光学微传感器^14，15被开发来测量这个重要的Analya.后来，用平面视光对_O2进行了二维（2D）成像，引入了12、16、17、18、19，实现了土壤和沉积物中异构_O2分布的可视化和量化。

平面_O2光子由_O2敏感指标染料²⁰组成，该染料溶解在合适的聚合物²¹中。指示染料在特定光学波长下激发，在放松时以发光的形式发出红移光。在_O2的存在下，兴奋指示器染料可以在碰撞时将其能量转移到_O2分子上，这称为基于碰撞的发光淬火^22。因此，随着_O2浓度²³的增加，发光强度和发光寿命都降低。在理想情况下，强度和寿命的变化遵循斯特恩-沃尔默方程（等式1），在不存在时使用发光强度或寿命（I 0;+0）或给定浓度为O2的存在（I，+）[Q]。斯特恩-沃尔默常数（K_sv）是光度对_O2的灵敏度的量度;K_SV取决于环境变量，如温度和压力。

(1)

使用相机系统在平面传感器箔上记录这种发光变化可用于可视化 O₂分布中的相应变化。最初，使用基于发光强度的简单发光强度_O2成像^18。然而，这种方法对外部干扰非常敏感，由于异构照明、激发源或照相机的波动以及平面光晶内指示器染料的分布不均匀，外部干扰会危及结果的可靠性。

其中一些限制可以通过使用平面光度成像^17，24，其中_O2敏感指标染料被共同固定在平面光的聚合物层与不敏感的参考染料发射在不同的光谱范围比O₂指标。基于在两个光谱窗口获取的发射图像，O_2-敏感发射信号被参考信号除以，生成不太容易受到上述干扰^5、17的比例图像。该方法要求使用第二种染料，理想情况下，该染料可以由相同的激发源激发，但在相机的另一个光谱窗口（例如，RGB 摄像机的另一个颜色通道中）以不同的波长（没有显著的光谱重叠）发出。

或者，O₂成像可以基于对指标染料发光寿命的 O₂依赖性变化进行量化，该变化不受指标浓度²⁵中的不均匀照明或异质性的影响。第一个发光寿命的_O2成像系统是基于时域测量与门可带电带电耦合装置（CCD）相机系统^26，其中使用脉冲激发源和发光图像^{在指示8，23，27}的激发或发射在规定的时间间隔内拍摄。通过这些图像，可以确定发光寿命，并将其与校准中的相应 O₂浓度相关。随后，将特定样品的发光寿命图像压在平面光照上，可转换为_O2浓度相应2D分布的图像。该系统已在实验室和原地^16、28的许多应用中使用，但基本可门的CCD相机已不再具有商业价值。

最近，一个不同的发光寿命摄像系统发布，该系统在频域⁸中获取图像。系统依靠连续调制的光源进行激励。这可以是正弦波或方波，而不是脉冲激发，用于在时域中获取图像。这种调制导致 O₂指示染料的调制发光发射，该辐射以角度 α 相移，取决于指标染料 （*） 的发光寿命（参见方程 2）。

(2)

激发振幅和发射振幅之间的变化（即所谓的调制指数或深度（振幅除以恒定发光部分））也取决于发光寿命。因此，通过设置已知的调制频率，摄像机内的特殊CMOS图像传感器能够测量ns到μs范围内的发光寿命，如其他地方^8、29、30所述。有关操作原理的一般指南（使用以下链接https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8）。

在下面的协议中，我们演示了使用新型相机系统来成像_O2浓度在2D^9，31中水生淡水植物Littorella单株根周围的分布。我们要强调，这种方法绝不仅限于此应用程序。氧敏光度或传感器粒子²⁷与各种成像方法相结合，已应用于医学研究³²种，在生物印刷³³种，用于压力敏感涂料^34、35，或研究光合系统^{2、36、37，}仅举其他几个应用领域。

研究方案

1. 平面O₂光大光大

1. 将1.5毫克发光O₂指标染料铂（II）-5，10，15，20-四基-（2，3，4，5，6-五氟乙烯）和100毫克聚苯乙烯（PS）在1克叶绿素中获得所谓的"传感器鸡尾酒"。
   注意:鸡尾酒可以在封闭的、气密的玻璃瓶中保存几个小时，在冰箱和黑暗中，直到进一步使用。
2. 在水或乙醇的帮助下，在清洁的玻璃板上修复清洁、无尘聚乙烯对苯二甲酸酯 （PET） 箔（取决于应用大小）薄膜 （图 1A）
3. 将清洁的刀涂层装置（120 μm）放在铝箔上，并用玻璃移液器在设备前面涂上一条传感器鸡尾酒（图1B）。然后，将刀涂装置缓慢且均匀地拖动到 PET 箔上，均匀地将鸡尾酒均匀地铺开。
   注:所有材料和工具都必须彻底清洁，制造应在无尘环境中进行，如抽油烟机、流动台或点吸装置下方。为了避免最终传感器箔中的异质性，在氯仿快速蒸发时，应迅速完成传感器鸡尾酒在箔上应用的步骤。
4. 在环境空气中干燥成品的平面 O_2-敏感光片 1 小时，然后在加热柜中以 50-60 °C 过夜，在溶剂蒸发 12 μm 后形成最终层厚度。 在黑暗中（例如，在纸信封中）存储产生的光片，直到进一步使用（图 1C）。
   注:平面O₂光片可在使用前干燥和黑暗中储存数月至数年。最终层厚度范围为1-20μm，已证明具有良好的效果，具有足够的发光信号和足够的响应时间。

2. 瑞佐三明治室

1. 用96%乙醇清洁两块玻璃板（24.5 x 14厘米^2，厚度:4毫米）。
2. 使用可固化的丙烯酸即时胶粘剂（见材料表）在第一玻璃板边缘（即后腔室侧）上粘附显微镜玻片（76 x 26 mm^2，厚度:1 mm），同时留下一个长边。根据需要使用玻璃切割机缩短显微镜幻灯片。
   注意:切割玻璃可能会导致锋利的边缘，应小心处理。
   注:显微镜滑动器在正面和背面之间充当垫片，根据根部厚度和植物大小，多层显微镜幻灯片可以相互粘合。
3. 将平面光电切成所需的形状和尺寸，以适合胶合显微镜幻灯片之间的空间。将其放在前玻璃板内侧，涂层侧朝上，以便在压上时与感兴趣的样品接触。
4. 将光片箔的一边绑在玻璃板上，在玻璃板和光片箔之间加入几滴自来水（图2A）。慢慢降低这些水滴上的箔，使其在玻璃表面上伸直。
5. 使用软组织小心地去除夹在平面视板和玻璃板之间的气泡，同时避免刮伤传感器涂层。将玻璃板擦干，并将光片箔的剩余边缘粘在玻璃板上（图 2B）。
   注:应选择在水中具有适当附着力的胶带。
6. 使用0.5毫米的网状尺寸筛分沉淀沉积物。在第一玻璃板上放置一勺湿沉积物（图2C）。
   注: 网格大小不应大于垫间隔厚度的一半。
7. 均匀分布沉淀物，并使用平板玻璃板将其调整到与显微镜滑动垫片相同的厚度。仔细清洁显微镜滑片的上表面，以确保第二个玻璃板正确密封造型室。
8. 在显微镜滑动表面涂抹硅润滑脂。用薄水膜覆盖沉积物，同时小心避免形成气泡。
9. 小心地洗一次利托雷拉单体，并将其放在沉积物上，植物叶子从上部开放侧伸出（图2D）。
10. 将第二块玻璃板（与光片相连）放在沉积物上，施加温和压力，使光片与植物根部和周围沉积物紧密接触。
    注:通过倾斜玻璃板，同时将它们组合在一起，可以去除沉积物中捕获的气泡。
11. 使用夹子将玻璃板固定在一起 （图 2E）。用纸巾擦干外边缘。在整个根茎三明治的组装过程中保持叶子的滋润（例如，经常加入几滴水）。
12. 使用乙烯基电气胶带拧紧根茎夹层。用建模粘土密封边缘，并额外用乙烯基胶带胶带胶带将其胶带（图2F）。
    注:如果沉积物中有许多气泡，或垫片显微镜玻片和第二玻璃板之间的沉积物颗粒，则应重新组装腔室，因为孔隙水可能会泄漏（重复步骤 2.4 - 2.8）。
13. 使用不透明的塑料覆盖根佐三明治，但在箔片中留下一条狭缝，让植物叶子粘出来。在塑料箔中切开一个窗口，以便通过展开来打开用于实验。在适应期间使用橡皮筋（图2G）关闭窗口，在植物孵育时保护光光剂免受照片漂白。
    注:由于藻类生长可能会干扰_O2浓度的测量，我们建议尝试尽量减少它，通过使用过滤水，预清洁的实验设备和去除藻类形成。

3. Rhizo-三明治室孵育

1. 将 rhizo-三明治室放在水箱 （32 x 7 x 28 cm^3）中，放在稍微倾斜的位置，以鼓励根生长对平面光。
2. 给水箱注水，使植物叶子完全浸没。
3. 使用时间控制的灯建立 14 小时光、10 小时暗循环，使工厂适应。在水箱中放置空气石或水泵，以确保水的通气和混合（图2H）。

4. 成像

1. 成像设置
   1. 取出覆盖在根佐-三明治室中的平面光片的塑料箔。用玻璃墙将房间与光片直立在水族馆壁上。使用垫垫将 rhizo-三明治室按在水族馆的墙壁上。
      注:水族馆壁的整体厚度加上根佐夹层室壁不应太厚，但是，建议使用 > 1 cm 进行水族壁的玻璃厚度，以便通过增加散射光的衰减来减少空间串扰。重要的是，对两个玻璃墙使用相同的材料（相同的耐火性指数），以尽量减少材料界面上的光散射;因为这将导致图像模糊以及^12。
   2. 将装有目标（参见材料表）的基于频域的发光寿命相机放在水族馆和感兴趣的区域（与平面视光直接接触的水生植物Littorella 单体植物的根） （图 3）。
      注: 摄像机可能放置在实验室支架上，以便轻松调整摄像机的高度。实验室支架的位置应标记并保持固定。此外，可以将摄像机连接到实验室支架，以避免在实验期间意外移动摄像机。
   3. 在摄像机目标上拧下合适的发射滤光片，用于将 PtTFPP 成像为指示染料（参见材料表），以去除激发源中的推论。
      注: 螺钉式过滤器是理想的，但方形滤波器也可以与适当的适配器一起使用，或者小心地将它们连接到目标。
   4. 将 LED 激励源（参见材料表）连接到摄像机的调制和暗门输出。
      注: 前者提供光源的调制信号，而后者在图像传感器的图像读出期间关闭光。将 LED 激励源和摄像机连接到计算机。在图像读出过程中，背景光线应最小化，要么使整个房间变暗，要么在整个设置上铺上浓密的黑色布。在后一种情况下，必须确保有足够的通风，以避免摄像机加热。
   5. 将光导线固定在 LED 激励源中，并将其定位为均匀地照亮覆盖感兴趣区域的平面光片箔。
      注:在用过的 LED 激励源中，可以在 3 个不同的 LED（460 nm、528 nm、625 nm）之间切换，其强度可通过控制软件进行调整。
2. 设置和摄像机操作
   注:对于所述的实验，我们在商用软件包中使用基于频域的终身相机与用于终身成像的专用模块（参见材料表）。
   1. 使用前在所选软件中选择相机。
      注:在按照制造商指南进行成像之前，需要安装软件和摄像机驱动程序。
   2. 打开 LED 控制软件（在开始实验之前再次安装），然后通过勾选待机来选择合适的 LED（此处:528 nm）。根据需要设置 LED 强度（此处为 30%）。确保 LED 由外部 TTL 触发;这是通过勾选模拟和同步LED来完成的。
      注:LED 强度需要单独调整，因为过高的激光功率会导致指示器或参考染料的加速光漂白。
   3. 对焦相机并手动调整目标的光圈（在本研究中使用 f = 2.8）。
      注意:将相机聚焦在平面视光片上，而不是放在水族馆玻璃上，这一点很重要;这可以通过使用标尺进行缩放，并聚焦于光标上的标尺阴影而不是实际标尺来确保。
   4. 在软件的摄像机控制面板内设置以下参数:内部调制源;输出波形的当因波;附加相位采样（是）;8相位样品，相位顺序相反，点击A+B读出;5 kHz 调制频率。
      注:这些参数会影响图像质量，如果需要，可以更改。相机制造商提供有关各个参数的指南（每当软件更新时，相机制造商都会发布指南和更新）。
   5. 在实验前拍摄参考图像。
      注:这可以通过成像校准标准（已知寿命（ns 或 μs）的发光染料）或使用 LED 的反射光来实现。在后一种情况下，需要从目标中去除发射长通滤波器，并且已知寿命可以设置为 1 ns。
   6. 调整专用成像软件校准部分的曝光时间，直到标准化发光强度图像的ROI 统计信息读出（位于此面板底部）在 0.68 - 0.72 的范围内。
      注: 现在，引用生存期（例如 1 ns）作为软件的输入给出。
   7. 按捕获参考开始采集参考测量系列。
      注:完成后，将存储参考数据，并可在样品上进行单时或时差测量。
3. O₂光光的校准
   1. 将一块平面 O₂敏感光片放置在（小）玻璃水族馆中。如前所述，将平面光电固定在校准室的玻璃壁上（参见第 2.3 节）。将校准水族馆放在摄像机前面。确保 LED 照明均匀，以及光片填满整个视野。
      注:平面光片应来自同一片箔，或与实际实验中使用的铝箔用的传感器鸡尾酒制成。
   2. 向水族馆注入与实验中使用的相同液体介质。
      注:使用不同的介质进行校准和实验会影响测量（例如，通过改变传感器响应和/或 O₂溶解度）。因此，校准应在与实际实验相同的介质和相同温度下进行。温度的波动会影响发光信号，应避免。但是，如果温度不能保持稳定，则需要通过校准不同（相关）温度的 O₂敏感光度（多点）以及随后重新计算值来进行温度补偿。
   3. 使用气体混合装置，使用已知 O₂浓度的空气/N₂气体混合物冲洗水，调整校准水族馆内的 O₂浓度。确保水与用过的气体混合物充分平衡（取决于水族的流速和大小）。
      注: 我们建议使用具有温度补偿的外部校准 O₂传感器（例如，使用光纤或电化学 O₂传感器）监控校准水族馆中的 O₂电平。
   4. 在校准室中以不同的 O₂浓度拍摄一系列图像。
      注:应至少测量五种不同的 O₂浓度，以便使曲线适合采集的校准数据。在 0 hPa（缺氧条件）下测量，然后将其他值分布到特定指标染料的动态范围内，这一点很重要。在这里，我们使用PtTFPP作为O₂敏感指标染料固定在聚苯乙烯基质。以 0、48、102、156 和 207 hPa 拍摄图像;207 hPa 对应于给定盐度和压力下 100% 的空气饱和度。
4. 映像示例
   1. 将样品放在摄像机前面，确保均匀照明。
   2. 在获得植物的发光寿命图像之前，关闭向工厂（和所有其他光源）提供辐照的光源。根据强度图像调整采集时间，确保信号在寿命确定时不会过度饱和或太弱，从而达到良好的噪声 （S/N） 比。
   3. 使植物暴露在不同的光照条件下（例如，光/暗），并获取一组图像。
   4. 打开房间的灯以获取结构图像。
      注: 当背景灯打开时，相机将不会测量逼真的寿命图像。但是，强度图像现在显示整个视野，就像通过半透明光片看到的一样。
   5. 在视野中使用标尺或类似图像拍摄图像，以便以后缩放获取的图像。

5. 数据分析

1. 使用相机制造商提供的宏，直接从专用成像软件导出相位寿命和强度图像。
2. 使用免费的图像分析软件执行进一步的图像分析（参见材料表）。
3. 在图像分析软件中打开校准的相位寿命图像，并使用测量功能确定整个图像的平均值。根据已知的 O₂浓度绘制测量寿命以确定校准函数（图 4A）。
4. 从所有数据中计算₊₀/*（ ₊₀是不存在 O₂时测量的相位寿命）。将这些值与已知的 O₂浓度（图 4B） 进行绘制。
5. 从校准图中确定参数K_sv和f，使用简化的双位点模型进行动态碰撞淬火（方程 3）^38，39其中 [Q] 为 O₂浓度。在数据分析软件中定义拟合函数，然后确定 K _sv和 f。

(3)

6. 在图像分析软件中打开采集的样本图像，使用确定的参数K_sv、f和+₀将图像寿命转换为 O₂浓度。
   注:作为替代方法，也可直接使用采集的校准相位寿命值（图4A）。在这种情况下，使用曲线拟合函数的指数拟合用于校准。
7. 在图像分析软件中打开下一个标尺的图像，并使用测量工具测量已知距离。在"设置比例"下将此度量设置为全局比例。

结果

作为新成像系统的应用示例，我们展示了复杂生物样品（即水生植物利托雷拉单体动物的根系球）的2D O₂成像。

首先，该方法描述了平面传感器薄膜的制造，即所谓的平面光片。如图1所示，这种光片是由聚合物基质中一层薄的光学指标构成的，该指标分布在透明支撑上。按照所述方案，获得由刀涂装置间隙定义的均匀厚度的均匀传感器膜。如果生产的光片具有零碎的传感器材料分布（例如，涂层中的孔、显示条纹或染料骨料（可在紫外线灯的帮助下进行视觉评估和目视评估），则需要重复该协议，并且需要使用丙酮彻底清洁所有材料。

一旦制备了平面光度，样品就可以与平面光道的传感层密切接触，如此处所示，平面光度与集成在根佐-夹层室中的平面光，其中植物的根部在周围的沉积物基质内可以定位与平面光道的密切接触（图2）。如果准备得当，rhizo-三明治室应该很容易从一个水族馆（孵化）移动到另一个（测量）。如果构造不正确，根糖夹层室可能不稳定、失去沉积物或含有气泡。因此，建议在组装后直接对根佐-三明治室进行目视检查。

给定的协议使用基于频域的发光寿命相机，使与平面光照台接触的样品能够进行基于频域的发光寿命成像。有关该摄像系统的更多详情，例如图像采集模式和科学互补金属氧化物半导体（SCMOS）相机特性，详见^{最近出版的8、29。}

设置本身相当简单，仅包括控制光源的摄像机（在本例中为 LED 激励源）和带有光化的样品（图 3）。确保所有部件正确连接，且样品均质照明。在进行成型测量时，需要避免背景光。

在对样品进行成像之前，需要校准光子。如图4A所示，测量的发光寿命随着准指数衰变后_O2浓度的增加而降低。也可以使用简化的双位模型（图 4B和方程 3）来描述这种关系。在给定的示例中，随后计算 O₂浓度所需的参数如下;±₀ = 56.26 μs，K_sv = 0.032 hPa^-1和 f = 0.86。

执行校准也是测试系统是否正常工作的理想方法。如果所有组件均按此处描述（或制造商指南）安装，则测量的生存期应显示如图4所示的相同 O₂依赖性。此外，对于 O₂传感材料（聚合物和染料）的相同组合，测量的_±0应位于此处测量的相同范围（± 几 μs）中（主要受实验温度影响）。如果无法获得类似的校准曲线，请确保正确执行所有步骤。有时，光片意外地修复了面向玻璃墙的敏感侧，而不是样品，或者获取的图像曝光过度或曝光不足。

使用校准参数，可以通过成像发光寿命 （*） 来确定 O₂浓度。如图5A，B所示，其中_O2浓度在光藻根圈中的分布在黑暗中和光照射后分别被射至500μmol光子^m-2-1，为12小时。 由于植物的光合活性，根生圈中的_O2浓度在光照射后增加。除了寿命图像外，还可以在外部照明下获取"结构"图像，同时保持成像几何形状的固定性。这样_，O2图像可以精确地与结构图像（图5C）相关，横截面或感兴趣区域。例如，从在黑暗和光线中获取的图像中分别提取单个根上的 O₂浓度剖面（图 5D）。

图1:平面_O2光大光大。（A） PET箔固定在玻璃板上，刀涂装置放在箔上.（B） 制备的传感器鸡尾酒在 PET 箔上作为细线在刀涂装置前铺开。（C） 刀涂装置向下移动，将传感器鸡尾酒作为薄膜涂在 PET 箔上，在溶剂蒸发后产生随时可以使用平面光片。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:Rhizo-三明治室组件，集成平面_O2光度。（A） 光片用水膜固定在其中一块玻璃板上。（B） 光片用电胶带粘在盘子上.（C） 沉积物用附着的垫片（即显微镜幻灯片）填充到相对板上。（D） 植物根系在均匀分布的沉积物上。（E） rhizo-三明治室关闭，并暂时用夹子固定。（F） 完全封闭和组装的根佐三明治室.（G） 为防止培养灯照射光，并避免藻类生长，在组装的rhizo-三明治室上放置塑料盖。（H） 在水族馆孵育的根佐三明治室。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:包含基于频域发光寿命相机的成像设置，通过透明水族馆和rhizo-三明治室壁，将目标聚焦在样品上，从后方将光子聚焦在样品上。LED 激励源的导光器定位为均匀照亮样品。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:平面 O₂光的校准曲线。（A） 在充满水的校准室中以相应的_O2浓度测量的不同磷光寿命。（B） Stern-Volmer 使用简化的双位点模型拟合的校准数据图（方程 3）。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:水生植物利托雷拉单体动物根瘤圈中_O2分布的终生成像。（A） O₂在保持植物在光下12小时后，在大约500μmol光子^{m-2 s-1}下分配。（B） O₂分布后，保持植物在黑暗中1小时 （C） 结构图像的植物根，通过平面视光看到.（D） 横截面 O₂浓度轮廓（位置由面板 A 和 B 中的黄线指示）在 12 小时后（红色）和 1 小时在黑暗（黑色）中）。经允许（科伦，K.，莫哈默尔，M.，Scholz，V.V.，鲍里索夫，S.M.，霍尔斯特，G.，Köhl，M.发光化学传感器寿命成像 - 时域和基于频域的相机系统之间的比较）。分析化学.91 （5）， 3233-3238， doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 （2019））。版权所有 （2019） 美国化学学会。请点击此处查看此图的较大版本。

讨论

在该协议中，涵盖了从光光处理制备到_O2图像分析的整个工作流程。通过遵循此协议，可以使用新型基于频域的发光寿命相机获得化学图像。根据不同的应用，平面光电可以制成各种尺寸和层厚度的传感器层范围从坚固的50-100μm厚平面光电几十平方厘米到显微镜盖滑与<1 μm厚的传感器层^6，40。该方法的潜力在特定的应用中得到了证明，但不仅仅限于植物根质球^12、28中的_O2成像。

与纯发光强度化学成像方法相比，该方法具有多种优点。发光寿命成像没有受到不均匀照明、光照厚度不均匀和光漂白²⁵的影响，或者至少要小得多。此外，这种方法避免了在比成像^17，37中常见的附加参考染料的使用。与其他基于寿命的相机系统相比，如常用的门控时域摄像机^8，26，这里介绍的新型相机系统和协议可以提供可比的结果。在最近的一份出版物中，比较了这两个系统的分析特性，发现基于频域的发光寿命摄像系统至少与停产的基于时域的前身⁸相当。

我们提出了最简单的_O2光聚合物光大，只包括聚合物基质中的指标。除了许多其他可能使用的O₂指标^20，可能使用添加剂，即散射剂，如TiO₂或金刚石粉末^2，以增加传感器信号，同时降低光光的透明度。此外，额外的染料可能被用来通过能量传递⁴¹来增强信号强度。

对于平面光片制造，我们建议在使用所述传感器鸡尾酒组合物时，使用 75 - 120 μm 的刀涂装置间隙，在溶剂蒸发后产生约 7.5 至 12 μm 的最终传感器层厚度（约占所用间隙的 10%）。这是信号强度之间的一个很好的折衷，可以通过更高的染料负载，或者选择亮度更高的指标和参考染料以及响应时间来改变信号强度。层厚度的增加会导致响应时间的增加，因为与周围介质的传感层中达到热力学平衡的解毒剂所需的时间跨度增加¹²。

如本文所述，光度在¹⁷秒内对_O2浓度的变化做出反应，同时仍然具有足够强的发光信号。超薄传感器涂层具有亚秒响应时间，可以通过自旋涂层⁶实现。如果支架或刀涂装置未清洁良好，则可能导致传感器层不均匀。此外，当鸡尾酒不完全均匀或涂在涂层装置前面后应用过快时，可以观察到这种不需要的结果。因此，可能需要一些实践来准备最佳光向。

该方法可用于成像样品，可以放在近距离接触的光电，如某些海洋动物^42，生物膜⁶和土壤³¹仅举几例。我们使用目标提供独立的设置，但是，相机可以很容易地耦合到显微镜上，用于更高分辨率的化学成像^43。

虽然基于时域的发光寿命成像能够抑制背景荧光^26，但当使用新的基于频域的摄像系统⁸时，这是一个问题。由于连续图像采集，此摄像机将记录样品的任何背景荧光，这些荧光可以由所选 LED 激发，并在摄像机目标上的发射滤镜定义的选定光谱窗口中发出。这将导致寿命明显降低，因此会导致错误读数。如果您处理的样品具有与 O₂传感器激发和发射显著的内在荧光重叠，则必须在光片顶部涂上一层含有炭黑^2、17的额外光学隔离。因此，只有从平面光照道发出的发光才会到达相机。为了检查背景发光，可以拍摄一个没有光光的图像，然后专门显示样品的内在发光。也可以在传感器鸡尾酒中加入散射剂，如TiO₂或金刚石粉^2，44，以增加指示染料的发光强度。然而，这也会导致更快的光漂白和TiO₂是已知的光催化剂，这可能会损害染料⁴¹的光稳定性。另一个需要考虑的方面是背景光。当成像发光寿命时，需要尽可能有效地避免背景光。因此，此成像方法要求将设置放置在深色环境中，并且任何外部光源都需要在图像采集期间暂时关闭。

总之，发光寿命成像是一种强大的化学成像方法，可适用于许多不同的应用。该协议（参见第 1 - 5 节）涵盖了生成 O₂图像的所有基本步骤，并使用目前最灵活的频域发光寿命成像系统，该系统可用平面光片取代 2D O₂成像的已停止门控时域摄像机。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air pump with air stone and water pump	Local aquarium store
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 silicone compound	Dow Corning GmbH	2793695
Gas mixer	Vögtlin Instruments GmbH	red-y compact meter GCM	This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria	Local aquarium or hardware store
ImageJ Software	ImageJ		Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device	BYK-GARDNER GMBH byk.com	2021	This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage, Germany		Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software	Nikon Inc		Software package used for image acquisition
pco.flim	PCO AG, Germany		Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)	Frontier Scientific	PtT975	O2 indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil	Goodfellow	320-992-72	Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS)	Sigma Aldrich	9003-53-6	Polymer matrix
Schott RG610 filter	www.uviroptics.com		Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape	Scotch, Super 33+	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor	delivered with the camera		Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount