果蝇黑色素血脑屏障完整性分析

摘要

血脑屏障完整性对神经系统功能至关重要。在果蝇黑色素仪中，血脑屏障是由胚胎发育晚期的胶质细胞形成的。该协议描述了在D.melanogaster胚胎和第三星幼虫中进行血脑屏障形成和维护的测定方法。

摘要

适当的神经系统发展包括形成血脑屏障，扩散屏障，严格调节进入神经系统，保护神经组织免受毒素和病原体的侵害。这种屏障形成的缺陷与神经病变有关，在许多神经退行性疾病中观察到这种屏障的分解。因此，确定调节血脑屏障形成和维护的基因以确定潜在的治疗目标至关重要。为了了解这些基因在神经发育中的确切作用，有必要分析改变的基因表达对血脑屏障完整性的影响。许多在建立血脑屏障中发挥作用的分子被发现被保存在真核物种，包括果蝇，果蝇，果蝇黑色素。果蝇已被证明是一个优秀的模型系统，用于检查调节神经系统发育和功能的分子机制。该协议描述了在D.黑色素气症发育的胚胎和幼虫阶段，用于血液脑屏障完整性的分步测定程序。

引言

在发育过程中，细胞-细胞的通信和相互作用对组织和器官结构和功能的建立至关重要。在某些情况下，这些细胞-细胞相互作用密封器官从周围环境，以确保适当的器官功能。神经系统就是这种情况，神经系统被血脑屏障（BBB）绝缘。人体BBB功能障碍与包括癫痫在内的神经系统疾病有关，在神经退行性疾病（包括多发性硬化症和肌萎缩性侧索硬化^症1）中观察到屏障的分解。在哺乳动物中，BBB是由内皮^细胞2、3之间的紧密结形成。其他动物，包括果蝇，果蝇黑色素，有一个由胶质细胞组成的BBB。这些胶质细胞形成选择性渗透屏障，控制营养物质、废物、毒素和大分子进入和流出神经系统^{的运动4。}这允许保持发射作用电位所需的电化学梯度，允许移动和协调⁴。在D.melanogaster中，胶质保护神经系统免受富含钾的、血样淋^巴5的淋巴。

在D.melanogaster的中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）中，两个外层胶质层、下眼胶质和眼质胶质，以及细胞外基质的外网络，神经层状，形成淋巴脑和淋巴神经^屏障6，在本文中称为BBB。在发育过程中，亚倍体成为多倍体并扩大以包围神经系统^{5，6，7，8，9，10，11}.亚苯并流感形成分离结，提供淋巴和^{神经系统5、6、12}之间的主要扩散屏障。这些结在分子上类似于脊椎动物在骨髓胶质的副节点处发现的类似分离的结，它们的作用与^{哺乳动物13、14}的BBB中的紧密结^{相同。15,16,17.}环状胶质分裂、生长和包裹在亚佩里尼胶质周围，以调节代谢物和大^{分子6、10、18、19}的扩散。BBB形成在25°C^5，8下产卵（AEL）后18.5小时完成。先前的研究已经确定了BBB形成的关键调控基因20，21，22。为了更好地了解这些基因的确切作用，必须研究这些潜在调控器突变对BBB完整性的影响。虽然以前的研究已经概述了在胚胎和幼虫中测定BBB完整性的方法，但是这个测定的综合方案还没有被^{描述5，7。}此分步协议描述了在D.黑色素气芽期和第三星幼虫阶段对BBB完整性进行诊断的方法。

研究方案

1. 样品收集

1. 胚胎收集
   1. 在每个胚胎收集笼中，使用至少50名处女和20-25名男性进行采集。在开始^收集23之前，用玉米粉-琼脂食品（材料表）在瓶子里孵育这些苍蝇1⁄2天。
      注:可以使用更多的苍蝇，但雌性与雄性的比例应保持在2:1。
   2. 预加热苹果汁琼脂板 （表 1） 在 25 °C 过夜.
      注:这是适当分期胚胎所必需的。如果盘子迅速干燥，在培养箱中加一个带水的碗，以增加腔室的湿度。
   3. 使用 CO₂从步骤 1.1.1 对苍蝇进行麻醉，并将苍蝇转移到收集笼。将预加热的苹果汁琼脂盘与酵母膏小涂抹在开放端，用红色袖子固定在笼子上（材料表）。为了清除较老的胚胎，允许苍蝇在25°C下在苹果汁琼脂板上产卵1小时。
   4. 从培养箱中取出收集保持架。向下反转保持架网格侧，然后点击飞至笼子底部。用一小块酵母膏代替苹果汁琼脂，换上新的预加热苹果汁琼脂板。丢弃第一个板。
   5. 允许苍蝇在新的苹果汁琼脂盘上产卵1小时，在25°C下。在收集1小时后丢弃这个板，然后继续下一步收集胚胎进行注射。
   6. 为了收集晚期17个胚胎（20~21 h AEL），允许步骤1.1~1.1.5中所需基因型的苍蝇躺在新的预加热苹果汁琼脂板上，在25°C下涂上少量酵母膏，在25°C培养箱中19小时老化板19小时，所以胚胎在成像时的年龄为20-21小时。
      注:对于多轮样品收集、注射和成像，可以根据需要重复此步骤。
   7. 通过添加含有0.1%非离子表面活性剂（PBTx）的磷酸盐缓冲盐水（PBS），将胚胎从板中收集到具有70μm尼龙网的细胞滤网中。表 1）覆盖板的表面，并用画笔从表面松开胚胎。
   8. 在细胞滤网中收集的Dechorionate胚胎在50%漂白溶液中（表1）在100毫米培养皿中5分钟，在室温下偶尔搅拌。在培养皿中旋转 PBTx 中的细胞滤网，每次使用一道新鲜的 PBTx，将胚胎冲洗 3 倍。
   9. 如果所有胚胎都是正确的基因型，则直接执行步骤 1.1.10。如果生成正确基因型的胚胎需要与杂合体苍蝇交叉，则使用是否存在荧光标记平衡染色体来选择正确基因型的胚胎。使用具有荧光功能的立体显微镜进行基因型选择。
      注:标有变形-黄色荧光蛋白的平衡染色体;克鲁佩尔-加尔4，UAS绿色荧光蛋白（GFP）;和扭-Gal4，UAS-GFP在晚期胚胎生成的基因型选择（表2）24，25，26中工作良好。
   10. 使用玻璃移液器，将PBTx中的胚胎转移到2%的甘蔗凝胶板（表1）。用滤纸去除多余的液体。将 +6⁄8 胚胎对齐到 2% 的甘蔗胶板上，后侧朝右和背侧朝上（图 1B）。
       注:微皮，精子进入卵子的小孔，位于胚胎的前端。后端更圆。气管呈白色，位于胚胎的背侧，允许区分胚胎的背和腹侧（图1B）。
   11. 用一块双面胶带准备幻灯片。用力按压胚胎顶部的滑块，将其转移到双面胶带上。
   12. 通过在室温下孵育25分钟（不使用干燥剂）使胚胎脱除。干燥后，用卤化碳油覆盖胚胎。
       注:干燥期可能因室内温度、湿度和通风而异。培养期应用于设置注射装置和成像共聚焦显微镜，如本议定书第2节和第3节所述。
2. 拉瓦尔收藏
   1. 建立一个十字架与5+10处女雌苍蝇所需的基因型和一半的男性所需的基因型在小瓶与玉米粉-琼脂食物，并在25°C²³孵育。
   2. 5~7天后，根据基因型，用钳子从小瓶中轻轻收集游荡的第三星幼虫。在 1x PBS 中冲洗幼虫，以去除粘在幼虫上的食物。将幼虫转移到苹果汁琼脂板，以便进行基因分型，如步骤1.1.9中所述（如有必要）。
   3. 用画笔将幼虫卷在纸巾上，将其干燥。将 6⁄8 幼虫转移到使用钳子用双面胶带准备的幻灯片上。

2. 针头和标本注射的制备

1. 在启动此协议之前，在微移液器拉拔器上拉针。根据标准针的形状和D.melanogaster注射参数将毛细管固定到针拉器中并拉拔（表3）27。将针头固定在粘土中，直到用于注射，将针头存放在培养皿中。
2. 在胚胎的25分钟干燥期间（步骤1.1.12）或转移后立即使用20μL凝胶加载移液器尖端，将5 μL的10 kDa dextran结合到磺胺101氯化酸（材料表）的针头中装入幼虫到幻灯片（步骤 1.2.3）。
3. 将针头装入针架，并置于固定在钢基上的微操作器（材料表）中。
   注:针应几乎平行于胚胎注射的显微镜阶段，幼虫注射应稍微向下倾斜。
4. 将注射装置（材料表）设置为50 psi，5⁄10 ms，范围为 10。
   注:对于所使用的特定注射装置，可能需要更改这些设置。
5. 将滑轨放在舞台上，以 45° 角将针的指针边缘刷到双面胶带的边缘，以创建一个倾斜的、破碎的尖端。
   注:对于胚胎，只需要打破尖端足以允许10 kDa dextran的流动。完美的针头有一个略角的尖端，每次注射时只有一小滴染料。对于幼虫，有必要打破尖端更多，但与角尖渗透幼虫身体壁。一滴更大的染料会出来。
6. 泵脚踏板，直到染料位于针尖。
7. 将针头对齐，使其与胚胎平行或向幼虫稍微向下倾斜。
8. 移动针头刺穿试样后端，然后通过泵送脚踏板注射试样。将±2 nL的染料注入胚胎，向幼虫注射220 nL的染料。
   注:如果注射成功，胚胎或幼虫应大量使用染料。
9. 注意为孵育目的注射的时间。在室温下孵育胚胎10分钟。在室温下孵育幼虫30分钟。
10. 继续沿着幻灯片注入其他试样，注意每个试样的注射时间。
    注:根据后续解剖和成像步骤的速度，一次可注射 4~8 个试样。

3. 成像样品的制备

1. 胚胎成像
   1. 注射后，准备胚胎进行成像。在滑轨的左右两侧涂抹带有棉布施用器的石油果冻作为垫片，以防止在放置盖玻片时损坏胚胎。
   2. 在胚胎深度使用共聚焦显微镜，具有20倍物镜的图像样本。使用以下公式计算在腹腔神经线 （VNC） 中观察到的染料总样本的百分比:BBB受损的样本百分比 = VNC 中染料累积的样本数/检测样本总数。
2. 幼虫的解剖和成像
   1. 提前准备幼虫样本的幻灯片。安装两个盖玻片，间隔约0.5厘米的幻灯片与指甲油。
      注:盖玻片作为大脑的垫片，因此在安装过程中不会损坏。
   2. 在30分钟的孵育之后，直接在用于成像的幻灯片上解剖1x PBS中的幼虫。首先，使用一对钳子抓住幼虫的中途，并使用第二对钳子分离幼虫的前半部分和后半部分。
   3. 接下来，使用一对钳子抓住嘴钩的前部区域，并使用第二对钳子将身体壁倒置到抓住嘴钩的钳尖上。大脑和VNC将暴露。
   4. 通过切断神经将大脑和VNC从身体壁中分离出来，并从幻灯片上去除身体壁（图1C，D）。如果需要，取出想象光盘。
   5. 用 10 μL 的 80% 甘油覆盖样品，并在样品顶部放置一个盖玻片进行成像。
   6. 使用 20x 目标通过神经系统组织的深度进行图像。计算在 VNC 中观察到的染料的总样本的百分比。

结果

此处描述的方法允许在D.黑色素气素胚胎和幼虫中在整个CNS中实现BBB完整性的可视化（图1）。在胚胎发育晚期完成BBB形成后，BBB功能从大脑中排除大分子和VNC^5。该协议利用此功能来测定BBB的形成。当野生型（俄勒冈R）后期17（20⁄21 h老）胚胎被注射10kDa dextran结合成磺胺101氯化氯化荧光染料时，大dextran分子被排除在VNC中，如预期（图2...

讨论

该协议全面描述了在D.melanogaster发育的晚期和第三星幼虫阶段，分析BBB完整性所需的步骤。其他地方也曾描述过类似的方法，以在发展期间以及成人阶段5、7、29、30中，分析BBB的完整性。但是，材料和方法部分中对程序的描述通常很广泛，缺乏足够的细节，便于实施，因此需要代表研究人员进?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran	ThermoFisher Scientific	D1863	Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips	Eppendorf	22351656
100% Ethanol (200 proof)	Pharmco-Aaper	11000200
Active Dry Yeast	Red Star
Agar	Fisher Scientific	BP1423
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Air Compressor	DeWalt	D55140
Apple Juice	Mott's Natural Apple Juice
Bleach	Household Bleach		1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Bottle Plugs	Fisher Scientific	AS-277
Cell Strainers	BD Falcon	352350
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator	Puritan	19-062614
Double-Sided Tape 1/2"	Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip	Roboz	RS-5015
Fly Food Bottles	Fisher Scientific	AS-355
Fly Food Vials	Fisher Scientific	AS-515
Foot Pedal	Treadlite II	T-91-S
Gel Caster	Bio-Rad	1704422
Gel Tray	Bio-Rad	1704436
Glass Pipette	VWR	14673-010
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Granulated sugar			Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil	Lab Scientific, Inc.	FLY-7000
Light Source	Schott	Ace I
Manipulator Stand	World Precision Instruments	M10
Micromanipulator	World Precision Instruments	KITE-R
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Needle Holder	World Precision Instruments	MPH310
Nightsea Filter Sets	Electron Microscopy Science	SFA-LFS-CY	For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head	Electron Microscopy Science	SFA-RB	For visualization of GFP
Paintbrush	Simply Simmons	Chisel Blender #6
Pipetter	Fisher Scientific	13-683C
Pneumatic Pump	World Precision Instruments	PV830	This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Small Embryo Collection Cages	Genesee Scientific	59-100
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Steel Base Plate	World Precision Instruments	5052
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000	Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source	Baytronix		Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)	Genesee Scientific	20-258
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	Nonionic surfactant
Vial Plugs	Fisher Scientific	AS-273