电压在动态光散射粒子尺寸分析中的应用

摘要

这里提出了在动态光散射颗粒尺寸测量过程中将电压应用于溶液的协议，旨在探索电压和温度变化对聚合物聚合的影响。

摘要

动态光散射 （DLS） 是描述聚合物、蛋白质和其他纳米和微粒大小分布的常见方法。现代仪器允许测量颗粒大小作为时间和/或温度的函数，但目前没有简单的方法在应用电压的情况下执行 DLS 颗粒大小分布测量。执行此类测量的能力将有助于开发用于传感、软机器人和储能等应用的电活性、刺激响应聚合物。这里介绍了一种利用施加电压与DLS和温度斜坡相结合的技术，用于观察带和无电活性单体的热响应聚合物的聚合和颗粒尺寸变化。这些实验中观察到的聚合行为变化只能通过电压和温度控制的组合应用才有可能。为了获得这些结果，将电位器连接到经过修饰的比色皿，以便对溶液施加电压。在恒定电压存在的情况下，使用DLS监测聚合物颗粒尺寸的变化。同时，生成了当前数据，这些数据可与粒子大小数据进行比较，以了解当前行为和粒子行为之间的关系。聚合物聚物（N-丙丙丙烯酰胺）（pNIPAM）作为该技术的测试聚合物，因为pNIPAM对温度的反应得到了很好的研究。观察pNIPAM和聚氨酯（N-同丙烯酰胺）-块-聚物（铁甲基丙烯酸酯）的低临界溶液温度（LCST）聚集行为的变化，这是一种电化学活性块共聚物，存在施加电压。当试图在施加电压的情况下实现可逆聚合物结构时，了解这种变化背后的机制非常重要。

引言

动态光散射（DLS）是一种通过随机改变通过溶液¹散射的光强度来确定颗粒大小的技术。DLS 能够通过确定颗粒尺寸来测量聚合物的聚合。在本实验中，DLS与受控温度变化相结合，以观察聚合物聚集物时，该聚合物指示超过较低临界溶液温度（LCST）2、3。在LCST下方，存在一个均质液相;在LCST之上，聚合物变得不溶性、聚合和冷凝出溶液。在散射场中引入一个施加的电压（即应用电位或电场），以观察电场对聚合行为和LCST的影响。电压在颗粒尺寸测量中的应用有助于深入了解粒子行为以及随后在传感器、储能、药物输送系统、软机器人等领域的应用。

在该协议中，使用了两个示例聚合物。聚类（N-异丙烯酰胺），或pNIPAM，是一种热敏聚合物，它同时含有亲水酰胺组和大分子链^4，5上的疏水异丙基组。热反应聚合物材料，如pNIPAM，近年来已广泛应用于受控药物释放、生化分离和化学传感器^。pNIPAM 的 LCST 文献值约为 30-35 °C⁴。pNIPAM 通常不具有电化学活性。因此，作为第二样品聚合物，在聚合物中加入了电化学活性块。具体来说，铁甲基丙烯酸酯用于创建聚（N-丙烯酰胺）-聚聚（铁甲基丙烯酸酯）块-共聚物，或p（NIPAM-b-FMMA）6、7。两种示例聚合物均通过可逆添加碎片链转移聚合合成，其链长度为^{8、9、10。}非电化学活性聚合物pNIPAM合成为100mer纯pNIPAM。电化学活性聚合物p（NIPAM-b-FMMA）的链长为100mer，含有4%的甲基丙烯酸酯（FMMA）和96%的NIPAM。

本文介绍了一种研究施加电压对聚合物聚合影响的协议和方法。该方法还可以扩展到DLS的其他应用，例如分析蛋白质折叠/展开、蛋白质-蛋白质相互作用以及静电带电粒子的聚集等。样品从20°C加热至40°C，以在1V应用场不存在的情况下识别LCST。然后，将样品从40°C冷却至20°C，同时不中断应用场以研究任何滞后或平衡效应。

研究方案

1. 聚合物制剂示例

1. pNIPAM 聚合物合成
   注:此制剂可产生 10 mL 的 1 g/L 溶液，足以进行 3-4 次实验。
   1. 准备施伦克生产线设备。确保冷陷阱 Dewar 烧瓶充满干冰和丙酮浆料，或者如果使用机械制冷疏水阀，请确保疏水阀已达到适当的温度。
   2. 在 50 mL 圆底烧瓶中， 加入0.566克N-异丙烯酰胺（NIPAM）单体，0.016克可逆添加分片链转移聚合（RAFT）剂（邻苯二甲酸酯），0.0008克2，2-阿佐比（2-甲基丙酸酯）（AIBN）和10mL的1，4-二恶英。在烧瓶中放入搅拌棒。用橡胶隔膜密封烧瓶，用乙烯基胶带包裹，并将单体溶解在1，4-二恶烷中。
   3. 执行以下冷冻泵解冻:将圆底烧瓶浸入含有干冰和甲醇浆料的 Dewar 烧瓶中，冻结溶液。所有材料冻结后，使用 Schlenk 管线的真空歧管将烧瓶排空至 100 kPa 以下的内部压力。用温水将烧瓶隔离，在静态真空下解冻。使用 Schlenk 生产线的氮歧管将烧瓶返回大气压力。
   4. 重复步骤1.1.3三次，以尽量减少内部氧气浓度。
   5. 用氮气分离溶液，以平衡对大气的压力。使用油浴将混合物加热至 85°C，在 200 rpm 下搅拌 36 小时。
   6. 在 50 mL 烧杯中，添加 40 mL 的己安。然后将聚合物混合物加入至己己醇滴。pNIPAM 应沉淀为白色絮状物。
      注:NIPAM单体可溶于己之苯，但pNIPAM在己安中的溶解度较差。
   7. 将浑浊的混合物倒入Büchner漏斗中，收集白色pNIPAM粉末。将粉末转移到 20 mL 小瓶中，并将其放入真空烤箱中过夜，以去除剩余溶剂。在室温下存放在密封的容器中，直到需要为止。
2. pNIPAM-块-聚（铁甲基丙烯酸酯）块-共聚物（p（NIPAM-b-FMMA）合成
   注:此制剂可产生 10 mL 的 1 g/L 溶液，足以进行 3-4 次实验。
   1. 准备施伦克生产线设备。确保冷陷阱 Dewar 烧瓶充满干冰和丙酮浆料，或者如果使用机械制冷疏水阀，请确保疏水阀已达到适当的温度。
   2. 在50mL圆底烧瓶中，加入0.057克铁甲基丙烯酸酯（FMMA）单体、0.016克RAFT剂、0.0008克AIBN和10 mL1，4-二恶烷。在烧瓶中放入搅拌棒。用橡胶隔膜密封烧瓶，用乙烯基胶带包裹，并将单体溶解在1，4-二恶烷中。
   3. 执行以下冷冻泵解冻:将圆底烧瓶浸入含有干冰和甲醇浆料的 Dewar 烧瓶中，冻结溶液。所有材料冻结后，使用 Schlenk 管线的真空歧管将烧瓶排空至 100 kPa 以下的内部压力。用温水将烧瓶隔离，在静态真空下解冻。使用 Schlenk 生产线的氮歧管将烧瓶返回大气压力。
   4. 重复步骤1.2.3三次，以尽量减少内部氧气浓度。
   5. 用氮气分离溶液，以平衡对大气的压力。使用油浴将混合物加热至 85°C，搅拌 10 小时。
   6. 将 0.543 g 的 NIPAM 和 0.0002 g 的 AIBN 溶解到 3 mL 的 1，4-二恶烷中。将溶液加入氮气下的烧瓶中，在30分钟内搅拌30分钟，用油浴将混合物加热至85°C，并在200rpm下搅拌36小时。
   7. 将 40 mL 的己带添加到 50 mL 烧杯中。然后将聚合物混合物加入至己己醇滴。p（NIPAM-b-FMMA）应沉淀为棕色粉末，因为FMMA单体具有深黄色。
      注:NIPAM和FMMA单体可溶于己己，但p（NIPAM-b-FMMA）在己毒中溶解性较差。
   8. 将黄色浑浊混合物倒入Büchner漏斗中，收集棕色p（NIPAM-b-FMMA）粉末。将粉末转移到 20 mL 小瓶中，并将其放入真空烤箱过夜，以去除剩余溶剂。在室温下存放在密封的容器中，直到需要为止。

2. DLS样品和比色皿制备

注:本节为施加电压准备比色皿和 DLS 测量样本。

1. 测量 10 mg 聚合物粉末，并溶解在 10 mL 的过滤脱离子 （DI） 水中。将混合物放在冰箱里过夜。准备好开始实验时，将样品保存在冰上。
   注:这些实验中使用的聚合物浓度为1克/升，但每个样品的最佳浓度范围将是唯一的。此外，最佳做法是将聚合物保持在LCST下方，直到其准备好进行测试。
2. 切割两块 6.3 mm x 7 厘米单面铜胶带 （图 1）。使用钳子将每块粘在 DLS 样品比色皿内部的另一侧，垂直于光路。胶带的底部应到达接近比色皿的底部。将铜胶带的边缘折叠到比色皿的顶部。确保铜胶带靠近/包裹在样品比色皿的顶部，以确保良好的电气接触。还要确保铜胶带不与用于 Zeta 电位测量的 DLS 设备相关的金属触点连接。
3. 用DI水洗三次比色皿，然后用Kimwipe擦掉多余的水。

3. DLS 仪器控制和设置

注:建议在运行每个 DLS 实验之前完成三个控件:（1） 空白水溶液;（2）尺寸标准;（3） 在温度斜坡或施加电压开始之前测量聚合物。操作前，请参阅仪器手册，以获得有关准备样品、选择设置和评估样品和数据质量的指导。

1. 将 1.5 mL 的过滤溶剂转移到比色皿中。使用 DI 水。
2. 将比色皿插入比色皿支架，确保比色皿顶部的小箭头与比色皿支架对齐。合上盖子。
3. 在 Zetasizer 软件中，选择工具栏上的"测量"。为控制装置设置了手动测量。将温度设置为实验起点。为此实验选择 20°C。
4. 一旦窗口底部的文本显示"插入单元格并按下准备就绪时启动"，则点击屏幕顶部的绿色三角形启动按钮。这将启动实验，在此之后不应打开比色皿支架。
5. 单击"多视图"选项卡可观察实时结果。通过观察计数率和关联函数，持续监控样本和数据质量。由于此样品只是溶剂，因此不应观察到与颗粒存在对应的明确信号。
6. 向比色皿中添加两滴标准溶液，或只使用水控制，然后重复步骤 3.2-3.6。为此实验使用 20 nm NIST 可追溯聚苯乙烯尺寸标准。
   注: 如果运行的水或标准解决方案控件显示的数据与预期结果不一致，请排除故障并重复，直到控件按预期读取。
7. 冲洗比色皿并添加过滤过的聚合物/测试溶液。重复步骤 3.2-3.5。应观察初始测试解决方案的明确测量。建议在任何温度斜坡或施加电压之前执行此操作，以便进行基线测量。

4. DLS SOP 设置

注:本节专门介绍马尔文 Zetasizer NanoZS DLS 仪器的温度斜坡操作。在开始实验之前，强烈建议广泛查阅仪器手册，以指导选择细胞、准备样品、选择测量设置以及评估样品和数据质量。

1. 在 Zetasizer 软件（版本 7.11）中，选择"文件"，然后单击"新建"以设置新的 SOP（图 2）。
2. 单击"测量类型"以选择趋势 > 温度 > 大小。
3. 在材料中，选择适当的材料和折射率。为本实验选择蛋白质和折射率（RI）为1.450。如果需要折射率的精确值以更准确地计算体积分布，实验者应通过实验确定其样品的折射率。
4. 在分散剂中，选择适当的溶剂。在此实验中选择水作为溶剂。
5. 在单元格中，选择正在使用的比色皿。为此实验使用一次性比色皿 （DTS0012）。
6. 在"顺序"中，设置"开始温度"和"结束温度"。对于加热实验，将起始温度设置为 20°C，并将末端温度设置为 40°C。对于冷却实验，请选择相反的一点。取消选中"返回起始温度"框。
7. 为每个温度步长变化选择一个间隔。对于这些实验，请选择 1.5 °C。
8. 在大小测量中，设置平衡时间。对于这些实验，将持续时间设置为 120 s。选择测量数。选择 3 个测量值和自动测量持续时间。
9. 保存 SOP，然后关闭文件。
10. 如果要使用施加电压，则先设置电位 （第 5 节），然后再继续。
11. 设置电位器后，或者未使用施加电压后，返回到 Zetasizer 软件并单击工具栏上的"测量"，然后单击"开始 SOP"。
12. 一旦 SOP 窗口底部的文本显示"插入单元格并按下准备就绪时启动"，则点击屏幕顶部的绿色三角形启动按钮。这将启动实验，在此之后不应打开比色皿支架。
13. 单击"多视图"选项卡可观察实时结果。通过观察计数率和关联函数，持续监控样本和数据质量。有关具有代表性的实验结果，请参阅图 3-5。

5. 电位设置

注: 建议使用同一台计算机进行颗粒大小和施加电压操作以对数据进行时间同步，从而便于以后评估。有关配线设置、软件咨询和选择适当参数的指导，请参阅应用电压仪表手册。在这些实验中使用了甘美电位。

1. 准备两根足够薄的电线，以便穿过 DLS 比色皿支架区域右上边缘的小缝隙（图 6）。在已准备的导线的一端，剥去绝缘层，以便连接到电位。另一端，将短鳄鱼夹焊接到电线上，然后连接到比色皿。确保 DLS 样品盖已关闭。
2. 夹紧白色参考电位电位引线和红色计数器电位器引线一起到其中一根准备好的导线上。夹紧绿色工作电位电位引线，蓝色工作感电位器通向另一根准备好的导线。对于这个实验，不要使用橙色计数器感和黑色地面电位位引线，并让他们浮动。为确保电路不短路，这些导线不应接触任何其他导线或导电表面。
   注: 每个引线连接到哪一侧并不重要。
3. 在软件工具栏中，单击"实验"，然后单击选项E 物理电化学，然后选择计时测量。就本协议而言，使用简单的施加电压，通过施加一个电压，并随时间测量的电流响应（即时间调节仪）。无论采用哪种特定的电化学方法，建议随着时间的推移来监视系统响应。
   1. 设置预步骤、步骤 1和步骤 2 电压与参考。这将是整个场/网的电压。将所有三个步骤的电压设置为 1 V 与参考。
   2. 设置预步骤延迟时间。对于这些实验，将系统设置为 0.5 s，以确保系统在记录信号之前稳定在所需的电压下。
   3. 设置步骤 1时间和步骤 2 时间的时间。这将控制电压的施加时间。将两者设置为 14，400 s，以确保在整个 DLS 实验中应用的电压将继续。
   4. 设置采样周期。这是图形读取和记录电流和电压值的频率。在此实验中使用 10.0 s。
      注: 此处显示的数据的其他设置不重要。使用了系统中的默认值。
4. 单击"确定"。顶部工具栏将显示一个活动符号，指示正在施加电压。电流应给予中等响应（μA），而不是使电位器过载。如果未观察到任何信号或信号过多，则系统可能连接不正确，因此，可以排除故障并重复，直到观察到预期电流。
5. 返回到步骤 4.10 以启动 DLS SOP。

6. 数据分析

注:本节详细介绍了初步分析，以了解获得的数据。

1. 将数据导入首选数据分析和绘图软件。
2. 对于在给定温度下在一组测量范围内进行的每个运行，确定峰值的颗粒体积大小，其体积百分比最大。
3. 计算在给定温度下记录的三个测量值中体积大小的平均值和标准偏差。
4. 对于每个实验，绘制 y 轴（对数刻度）上的平均大小 = 标准偏差与 x 轴（线性刻度）上的温度。
5. 导入 Gamry 当前数据进行分析。在 y 轴上的 x 轴上用时间绘制当前数据，在 y 轴上绘制电流（以微安表示）。
6. 为了将当前数据与粒子大小数据相关联，请将 Zetasizer 数据的时间戳与 Gamry 当前时间戳进行比较。如果从同一台计算机收集两种类型的数据，则可能这样做。否则，尽可能匹配记录的时间。

结果

温度斜坡中每次运行的实时文件输出以表的形式显示，如图3所示。每个记录都可以独立选择，以查看卷大小（图4）和相关系数 （图 5）。体积粒径分布 （PSD） 是解释整体分布和 LCST 的最准确数据，但数据的质量应通过相关图（图 5）进行评估，以确定是否应从分析中排除任何点。?...

讨论

对pNIPAM或p（NIPAM-b-FMMA）溶液施加电压改变了聚合物聚集行为，以响应温度。在这两种材料中，当存在施加电压时，即使溶液冷却到LCST以下，聚合物的体积尺寸仍然很高。这是一个意想不到的结果，因为没有电压的试验表明聚合物恢复到原来的尺寸。这些实验使我们能够得出结论，对于我们的温度范围，并在施加电压下，聚合物聚合不是完全可逆的，无论在pNIPAM中添加的电活性单体是什么?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Isopropylacrylamide	Tokyo Chemical Industry CO., LTD	I0401-500G
1,4-Dioxane	Alfa Aesar	39118
2,2"-Azobis(2-methylpropionitrile)	SIGMA-ALDRICH	441090-100G
Cuvette	Malvern	DTS0012
Dynamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer NanoZS
Ferrocenylmethyl methacrylate	ASTATECH	FD13136-1G
Phthalimidomethyl butyl trithiocarbonate	SIGMA-ALDRICH	777072-1G
Potentiostat	Gamry	Reference 600