下一代病毒 RNA/DNA 原位杂交在人类免疫缺陷病毒/猿猴免疫缺陷病毒研究中的应用

摘要

在这里，我们提出了一种下一代原位杂交测定法，用于鉴定福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织中的特异性病毒 RNA 或 DNA 序列。这种方法可在不到 24 小时内以非常高的灵敏度和特异性对低拷贝的 RNA 和 DNA 进行可视化。

摘要

原位杂交是一种强大的技术，可用于识别组织切片中单个细胞内的特异性 RNA 或 DNA 序列，为生理过程和疾病发病机制提供重要见解。原位杂交 （ISH） 多年来一直用于评估被病毒感染的细胞的位置，但最近开发了一种具有独特探针设计策略的下一代 ISH 方法，该方法允许同时进行信号放大和背景抑制，以实现单分子可视化，同时保留组织形态。这种新一代 ISH 基于分支 PCR 等方法，但在原位进行，在常规检测福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织中的 RNA 或 DNA 时，比经典的 ISH 方法或原位 PCR 方法更简便、更灵敏、更可重现。在过去的几年里，我们的实验室一直在应用这个 ISH 平台来检测多种 FFPE 组织中的人类免疫缺陷 （HIV） 和猿猴免疫缺陷 （SIV） 病毒 RNA （vRNA） 和/或病毒 DNA （vDNA） 阳性细胞。通过这份详细的技术手稿，我们想与所有有兴趣在研究中使用下一代 ISH 的个人分享我们的知识和建议。

引言

ISH 是一种实验方法，用于靶向和可视化细胞或组织切片内特定 DNA 或 RNA 序列的互补 DNA、RNA 或修饰的核酸链（即探针）。ISH 允许对组织中的特定核酸序列进行特异性定位和可视化，这对于了解靶标与其细胞环境之间的表达水平、组织、分布和相互作用非常重要，这是使用其他流行技术（如 qPCR）无法获得的宝贵信息。直到最近，ISH 通常使用标记的互补 DNA 或互补 RNA（核糖探针）进行。这些探针直接与放射线、荧光或抗原标记的碱基（例如 ³⁵S、FITC 和地高辛）偶联，然后分别使用放射自显影、荧光显微镜或免疫组织化学检测方法在组织中定位和定量。虽然这些原位技术仍然是有价值的方法，但还有很大的改进空间来开发劳动密集度更低、更简单、更快、灵敏和特异性的方法。

2012 年首次描述的另一种商用下一代 ISH 方法（例如 RNAscope 检测）用于检测宿主信使 RNA （mRNA） 是基于分支 PCR。在 FFPE 细胞和组织中进行 mRNA 检测，灵敏度接近单个细胞中的单 RNA 分子可视化¹。这种方法的特异性是在两个双 Z 靶探针连续结合到它们各自的互补 RNA（或 DNA）序列上，以便信号前置放大器依次结合¹ 的独特条件下实现的。这允许通过类似于分支 DNA （bDNA） 的后续杂交步骤启动信号放大级联反应^1,2。此外，这种方法非常快速和简单，仅需 1 天 （<8 小时） 即可获得结果，与使用 Radio-ISH ^1,2 等替代技术长达 4 周相比，这是一个显着的优势。这种下一代 ISH 为 HIV/SIV 研究开辟了新的视角和机会。HIV 治愈的主要障碍是在疾病早期阶段建立的细胞和组织库 ^3,4。该技术的总体目标是识别、定位并最终了解充当病毒库并在感染宿主内持续存在的主要组织隔室。这反过来将有助于制定针对 HIV 的有效治愈策略。

在本手稿中，我们详细解释了我们的双链下一代 RNA/DNA 多重 ISH 方案（例如，RNAscope/DNAscope），并解释了我们如何修改现有的 RNA ISH 方案以针对我们的样品和特定靶标优化下一代 ISH。该方案允许对 5 μm 组织切片内的 HIV/SIV 病毒 RNA 和病毒 DNA 进行可视化、定位和定量。通过组合两个定制探针组来同时观察 vRNA 和 vDNA：一个正义，靶向 vDNA 编码链（C1 SIVmac239 Gag-Pol-Sense 探针 [416141-C1]），一个反义，靶向 vRNA 转录本（C2 SIVmac239 Vif-Env-Nef-Tar-Anti-Sense 探针 [416131-C2]），覆盖病毒基因组的不同区域（表 1），使用两个不同的可视化通道 C1 和 C2。在该协议中，通道 C1 和 C2 允许我们以不同颜色可视化信号（即红色的 AP 和棕色的 HRP）并用不同的方法检测探针。不包括组织固定处理和切割，该检测需要 2 天。这里介绍的是可在细胞沉淀或组织切片上进行的双链 vRNA 和 vDNA 原位杂交方案。

研究方案

1. 切片和载玻片的准备工作

1. 修剪石蜡块并使用切片机切割 5 +/-1 μm 切片。将切片或细胞沉淀固定在 40-45 °C 无 RNase 的水浴中的带电显微镜载玻片上。载玻片在 37 °C 或 RT 下风干过夜。
   注：载玻片在室温 （RT） 下可保存长达 3 个月，在 4 °C 下可保存长达 6 个月。
2. 对 FFPE 载玻片进行脱蜡处理。
   1. 将载玻片在干燥烘箱中于 60 °C 烘烤 1 小时。
   2. 在通风橱中，用 ~200 mL 新鲜二甲苯填充两个载玻片染色皿，用 ~200 mL 新鲜 100% 乙醇填充两个额外的染色皿。用盖子盖住容器。
   3. 将玻片放在架子上，浸入第一个含二甲苯的培养皿中。在 RT 下搅拌孵育 5-10 分钟。
   4. 将载玻片放入第二个含二甲苯的培养皿中，在 RT 下搅拌孵育 5-10 分钟。
   5. 立即将载玻片放入含有 100% 乙醇的培养皿中。将载玻片在 RT 下搅拌孵育 5-10 分钟。
   6. 立即将玻片放入含有 100% 乙醇的第二个培养皿中，并在 RT 下搅拌孵育 5-10 分钟。
   7. 从乙醇中取出架子，轻轻敲击架子的侧面以去除多余的乙醇，然后用不含 RNase 的水冲洗 5-15 分钟。

2. 烤箱准备

1. 打开杂交炉并将温度设置为 40 °C。
2. 将布或坚固的吸水纸巾放入托盘中，用双蒸水完全润湿，以便控制湿度。
3. 将带盖的托盘插入烤箱并关闭烤箱门。使用前，将托盘在 40 °C 下加热至少 30 分钟。不使用时，请将托盘放在烤箱中。

3. 热诱导表位修复

1. 制备 0.5x 基于柠檬酸盐的 ISH 杂交靶标修复缓冲液（10 nmol/L，pH = 6，参见 材料表）。将其放入加热板上的烧杯中煮沸。
2. 通过将载玻片放入沸腾的靶标修复缓冲液中 30 分钟来进行热诱导表位修复。
3. 从目标修复缓冲液中取出载玻片，并立即用双蒸水洗涤。在 100% 乙醇中脱水 5 分钟，然后风干。
4. 载玻片风干后，使用疏水屏障笔将组织切片环绕在载玻片上。确保疏水屏障完全风干。

4. 蛋白酶预处理

1. 将干燥的玻片放在锁定的玻片架上，然后用无菌冷 PBS 以 1：5 的比例稀释，制备蛋白酶预处理试剂（蛋白酶消化液，2.5 μg/mL）。搅拌均匀。
   注：市售试剂盒中提供了三种不同浓度的不同蛋白酶试剂。蛋白酶 III（标准）、蛋白酶 IV（强）和 Protease Plus（温和）。在研究中实施之前，凭经验测试蛋白酶的消化时间和稀释度，因为最佳条件会根据组织类型、固定和厚度而变化（参见讨论）。
2. 将稀释的蛋白酶溶液分配到载玻片上，以完全覆盖组织切片。立即将载玻片在 40 °C 下在烘箱中孵育 20 分钟（在步骤 1.4 中制备），确保载玻片密封在潮湿杂交托盘中。在方案的剩余时间内，不要让组织切片变干。
3. 将锁定玻片架浸入装满双蒸水的洗涤盘中，立即冲洗 3 次。
4. 通过将过氧化物酶溶液滴在每个组织切片上以完全覆盖它来执行内源性过氧化物酶阻滞。将载玻片在 RT 下孵育 10 分钟。完成后，用双蒸水冲洗切片 3 次。

5. 探针杂交和信号放大

注意：为防止蒸发，请确保湿度控制托盘正确密封，以免组织在孵育步骤中变干。在洗涤步骤中，将湿度箱放回烘箱中，以确保其保持在 40 °C。

1. 按照制造商的建议，将 1 体积的 C2 探针与 50 体积的 C1 探针移液到试管中，以 1：50 的比例混合 C2 探针和 C1 探针。将试管倒置数次。将目标探针混合物在 40 °C 烘箱中预热 ~10 分钟，以溶解任何沉淀物，然后再使用。
   注意：混合靶探针可在 4 °C 下储存长达 6 个月。
2. 从水中取出载玻片。冲洗，轻敲或轻弹载玻片以去除组织切片中多余的水分。立即将探针分配到载玻片上，确保每个组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将探针混合物在湿度室中于 40 °C 孵育过夜。
3. 第二天，从烤箱中取出载玻片，将它们放入含有 0.5x 洗涤缓冲液的洗涤盘中，在 RT 下放置 5 分钟。再重复一次洗涤步骤。
4. 从洗涤缓冲液中取出载玻片。冲洗，然后点击或轻弹载玻片，从组织切片中去除多余的洗涤缓冲液。
5. 在载玻片上的杂交缓冲液 B（20% 甲酰胺、5x SSC、0.3% 十二烷基硫酸锂、10% 硫酸葡聚糖、封闭试剂）中分配市售即用型 AMP 1 试剂 （2 nmol/L），确保完全覆盖组织切片，无任何气泡。在 40 °C 的湿度箱中孵育 30 分钟。重复步骤 1.6.3-1.6.4，每次洗涤 2 分钟。
6. 分配市售的 AMP 2。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 15 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。
7. 分配市售的 AMP 3。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 30 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。
8. 分配市售的 AMP 4。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 15 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。
9. 分配市售的 AMP 5。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 30 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。
10. 分配市售的 AMP 6。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 15 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。
11. 检测前，在 1x TBS-Tween 20 （0.05% v/v） 中冲洗载玻片一次。从洗涤缓冲液中取出玻片，冲洗，然后轻敲或轻弹玻片以去除组织切片中多余的洗涤缓冲液。立即放入装有 1x TBS-Tween 缓冲液的洗涤盘中。

6. 通道 1 （C1） 目标信号检测

注：这是使用含有碱性磷酸酶标记和显色检测的 2 重检测试剂盒（参见 材料表）中的红色碱性磷酸酶和快速红色显色扩增 6 进行的。它使用快速红作为底物来产生红色信号。

1. 使用 1：60 稀释的 Fast RED-B 至 Fast RED-A 制备固红 （FR） 工作溶液。搅拌均匀。为了减少沉淀并获得更清晰的信号，使用注射器通过 0.45 μm MCE 膜过滤色原溶液。
   注：在 5 分钟内使用 Fast RED-B 溶液。请勿暴露在阳光直射或紫外线下。
2. 从 TBS-Tween 中取出载玻片，冲洗，然后点击或轻弹载玻片以去除组织切片中多余的缓冲液。
3. 将混合、过滤的 FR 溶液分配到每个组织切片上，确保每个切片都被完全覆盖。在 RT 孵育 6-8 分钟。在显微镜下观察。
4. 在 2 倍 0.5 倍洗涤缓冲液中冲洗载玻片。从洗涤缓冲液中取出玻片，冲洗，然后轻敲或轻弹玻片以去除组织切片中多余的洗涤缓冲液。
5. 分装市售的 AMP 7。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 10 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。
6. 分装市售的 AMP 8。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 15 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。
7. 分配市售的 AMP 9。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 30 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。
8. 分装市售的 AMP 10。确保组织切片完全覆盖，没有任何气泡。将载玻片在湿度室中于 40 °C 孵育 30 分钟。 重复步骤 5.3-5.4，每次洗涤 2 分钟。

7. 通道 2 （C2） 目标信号检测

注：这是使用市售的 Brown HRP 和 DAB 色原试剂盒进行的（参见 材料表）。来自 2 重检测的扩增 10 包含辣根过氧化物酶标记，并使用 DAB 进行显色检测以产生棕色信号。

1. 为了对 DAB 信号进行最佳检测，请使用市售试剂盒并遵循制造商的说明（参见 材料表）。在显微镜下观察。
   注意：DAB 有毒。在处理和处置这种化学品时，请遵循适当的预防措施和安全指南。

8. 复染和封片

1. 用苏木精对载玻片进行复染。
   1. 用 50% 新鲜过滤的苏木精对载玻片复染 30 秒，同时搅拌载玻片。幻灯片将显示为紫色。立即用流水冲洗，同时上下搅动载玻片，直到水清澈为止。组织切片将保持紫色。
   2. 为了获得更好的对比度，将复染玻片置于碳酸锂饱和的蒸馏水中 1 分钟。在搅动载玻片的同时，用流水彻底冲洗至少 3 次。使用双蒸水进行最后冲洗。
   3. 由于 FR 对有机溶剂敏感，因此需要用水基封片剂覆盖用 FR 染色的玻片，并在室温下干燥过夜。
2. 安装载玻片。
   1. 确保用水基封固剂覆盖的组织切片干燥。
   2. 使用封固剂在盖玻片之前将载玻片浸入二甲苯中。确保防止或去除盖玻片和组织切片之间的任何气泡，并在室温下干燥 16 小时。

9.使用 CellProfiler⁵ 的 RNAscope 定量图像分析方案

1. 简而言之，确保软件将苏木精和 FR 染色剂分离成单独的图像。识别并测量感兴趣的对象：细胞核、病毒粒子、阳性细胞和聚集体 FR 阳性染色。将测量值存储在 CSV 文件中并保存分析的图像。
2. 选择“Unmix colors”（解混颜色）选项，该选项可分离污渍，将原始感兴趣区域 （ROI） 分割为单独的苏木精和 FR 图像。
3. 如果含铁血黄素、纹身或类似特征干扰分析，则添加苏木精、FR 和 DAB 的第二个“解混”步骤。使用第二个 FR 图像查找最强烈的 FR 像素。第二张图像将用作真正 FR 染色的掩码。
4. （可选）在对染色图像进行阈值处理之前对其进行平滑处理。这是一个实证决定，并不总是需要的。使用 “IdentifyPrimaryObjects” 对单个染色图像进行阈值处理，以选择正像素。
5. 识别三种不同类型的对象（病毒粒子、病毒粒子聚集体、生产细胞）。
   1. 确保细胞核是直径为 4-100 像素 （px） 的物体，并用苏木精染色。阈值处理后去团块并填充孔。“IntenseFastRed”对象的直径为 4-100 像素，包括病毒粒子、阳性细胞和聚集体阳性染色，例如在 B 细胞滤泡 （BCF） 中的滤泡树突状细胞 （FDC） 上看到的。该图像用于过滤掉假阳性（例如，含铁血黄素）。
   2. 确保 FR 小正片是直径为 2-12 像素的对象。该测量包括病毒粒子和 vDNA + 细胞。丢弃此范围之外的任何对象。阈值处理后去团块并填充孔。
   3. 确保 FR 大正数：9-100 px 直径的对象。该测量包括 vRNA + 阳性细胞和聚集体阳性染色。阈值后 Declump。小型和大型 FR 正对象的大小可以重叠。他们将在后续步骤中分离。
      注意：该软件（例如，Cellprofiler）使用像素来表示对象大小，而此处使用的像素来自以 0.2510 μm/像素 （40x） 扫描的载玻片。
6. 定义和提取结果。
   1. 识别出任何对象后，定义并提取病毒粒子数量、生产性感染细胞和细胞核的结果。
   2. 通过屏蔽 FastRedSmallPositives 并设置 IntenseFastRed 对象来去除假阳性（例如，含铁血黄素）来识别病毒粒子。
   3. 接下来，识别阳性细胞并聚集 FR 阳性染色。通过使用 IntenseFastRed 和 virion 对象集屏蔽 FastRedLargePositives 来删除误报和病毒粒子。
   4. 通过再次用 Nuclei 掩蔽，从精制的 FastRedLargePositives 中提取阳性细胞。拆分不再接触的对象，并按对象区域筛选结果，删除小对象 （≤6 px）。这将删除因遮罩细胞核重叠而创建的杂点。结果是阳性细胞。
   5. 最后，定义聚合 FR 正值。此步骤使用 IdentifyTertiaryObjects，查找较大的父对象中包含的对象。在这种情况下，优化后的 FastRedLargePositives 对象集是父项，并减去正单元格。
7. 计算病毒粒子和阳性细胞的数量。
8. 测量聚集正区域并将其从像素转换为 mm²。或者，如果分析需要使用标准细胞和病毒粒子大小而不是直接计数，则以^{mm 2} 为单位记录病毒粒子和阳性细胞所占据的面积。
9. 将正对象叠加在原始图像上并保存结果。
   注意：ISH 数据由每 10⁶ 个细胞核（细胞）的病毒粒子数和每 10⁶ 个细胞核（细胞）生产性感染的 vRNA + 细胞数报告，以便更好地理解并促进与 qPCR 数据的比较，但结果也可以按组织面积报告，单位为 mm²。

结果

在之前的手稿 2,6,7,8,9,10,11 中，我们报道了检测 vRNA 或 vDNA 的下一代 ISH 平台可以组合使用靶向 SIV/HIV 基因组的 5' gag-pol 部分的正义探针 （vDNA） 和靶向基因组 3' 半部基因的反义探针 （vRNA）（vif、vpx、vpr、 tat、env 和 nef）以及 5' 基因组中的 TAR 元件（表 1）。这种方法将转录活性细胞（vRNA + 、 vDNA + ）与转录无活性（推测潜伏）感染细胞或在同一组织切片中携带转录无能力前病毒（vRNA-、vDNA +）的细胞区分开^{来 2}（图 1）。

图 1：同一组织切片中的病毒 RNA 和 vDNA 检测。在急性 SIV 感染的 RM 淋巴结中结合 RNA 杂交（红色）和 DNA 杂交（棕色）测定，证明能够检测同一组织切片中的 vRNA 和 vDNA，并提供一种有效的方法原位识别转录沉默的 vDNA + vRNA- 细胞。该图是从 Deleage C. 等人2 ^{修改而来的。}请单击此处查看此图的较大版本。

单重 RNA/DNAscope 探针组
名字	ACD 目录#	ZZ 数	描述
SIVmac239 （反义）	312811	83	靶向 D01065.1 的 1251-9420bp 范围内的反义探针（gag、pol、vif、vpx、vpr、tat、env 和 nef）
SIVmac239 （感知）	314071	83	靶向 D01065.1 的 1251-9420bp 范围内的反向链的传感探针（gag、pol、vif、vpx、vpr、tat、env 和 nef）
V-HIV1 分支 A（反义）	416101	80	靶向 HIV-1 分支 A 共识 （gag， pol， vif， vpr， tat， rev， vpu， env， nef） 的 879-7629bp 范围内的反义探针
V-HIV1 分支 A （正义）	426341	80	靶向 HIV-1 分支 A 共识 （gag， pol， vif， vpr， tat， rev， vpu， env， nef） 的 879-7629bp 范围内的反向链的检测探针
V-HIV1 分支 B （反义）	416111	78	靶向 AF324493.2、HIV-1 分支 B NL4-3 的 854-8291bp 范围内的反义探针（gag、pol、vif、vpr、tat、rev、vpu、env 和 nef）
V-HIV1 分支 B （正义）	425531	78	靶向 AF324493.2、HIV-1 分支 B NL4-3（gag、pol、vif、vpr、tat、rev、vpu、env 和 nef）的 854-8291bp 范围内的反向链的正义探针
V-HIV1 分支 D（反义）	416121	76	靶向 HIV-1 分支 D 共识 （gag， pol， vif， vpr， tat， rev， vpu， env， nef） 的 894-7697bp 范围内的反义探针
V-HIV1 分支 D （正义）	426351	76	靶向 HIV-1 分支 D 共识 （gag， pol， vif， vpr， tat， rev， vpu， env， nef） 的 894-7697bp 范围内的反向链的检测探针
多重 RNA/DNA 探针组
名字	ACD 目录#	ZZ 数	描述
V-SIVmac239-gag-pol-Sense-C1	416141-C1	40	检测探针靶向 D01065.1 的 1251-4093bp 范围内的反向链（gag 和 pol）
V-SIVmac239-vif-env-nef-tar-C2 （反义）	416131-C2	47	靶向 D01065.1 的 5381-10257bp 范围内的反义探针（vif、vpx、vpr、tat、env、nef 和 TAR 元件）
V-HIV1-Clade_B-gag-pol-sense-C1	444051-C1	40	检测探针靶向 AF324493.2 854-3940bp 范围内的反向链，HIV-1 分支 B NL4-3（gag 和 pol）
V-HIV1-Clade_B-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 （反义）	444061-C2	40	靶向 AF324493.2 的 5042-9673bp 范围内的反义探针，HIV-1 分支 B NL4-3（vif、vpr、tat、env、nef 和 TAR 元件）
V-HIV1-Clade_C-gag-pol-sense-C1	444021-C1	48	靶向 HIV-1 分支 C 共识序列 （gag 和 pol） 888-5032bp 内的反向链的检测探针
V-HIV1-Clade_C-vif-vpr- rev-vpu-env-nef-tar-C2 （反义）	444041-C2	49	靶向 HIV-1 分支 C 共识序列 （vif、vpr、tat、env、nef 和 TAR 元件） 5078-9698bp 范围内的反义探针
V-HIV1-Clade_AE-gag-pol-sense-C1 抗体	444011-C1	55	检测探针靶向 AF259954.1、HIV-1 分支 AE（gag 和 pol）的 890-4812bp 范围内的反向链
V-HIV1-Clade_AE-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-tar-C2 （反义）	444031-C2	57	靶向 AF259954.1、HIV-1 分支 AE（vif、vpr、tat、env、nef 和 TAR 元件）的 5052-9694bp 范围内的反义探针

表 1：靶向 HIV-1 和 SIV 的 vRNA 和 vDNA 的探针列表。

讨论

原位杂交是一种细致的分析方法，需要严格的核酸化学、细胞生物学和组织学基础知识，才能适应每个关键步骤，以便在保存良好的环境中定位靶标。在本次讨论中，我们想重点介绍故障排除对于获得准确和可解释的结果至关重要的关键步骤。

组织的固定和处理至关重要，应提前解决，以确保检测能够产生最佳结果。中性缓冲 PFA（4% 新鲜制备的）固定剂是双重测定的最佳选择。然而，该测定也可以在具有适当冷冻切片后固定条件的冷冻组织 （OCT） 上进行。

组织切片的预处理是关键步骤。该检测有两个预处理步骤：第一个是热诱导表位修复 （HIER）。此步骤对于亚甲基桥交联的逆转和蛋白质结构的恢复很重要，这是固定组织中所必需的。这种处理的效率取决于时间、温度、修复缓冲液类型和 pH 值。第二种预处理是蛋白酶诱导的表位修复 （PIER）。此步骤裂解肽，暴露抗原或核苷酸，并使用包括蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶在内的酶。这是一个极其敏感的步骤，可能会损害组织形态和目标靶标。在此过程中，酶的浓度以及孵育的时间和温度至关重要。过度消化会导致细胞核划分不良和定量步骤困难。在获得 RNA/DNA 靶标的最佳途径和不损伤目标组织或靶标的预处理条件之间找到平衡至关重要。每种组织类型对这些预处理中的每一种都有不同程度的敏感性，并且每个参数（酶浓度、时间、温度）都应进行实证测试。

洗涤缓冲液的严格性基于三个主要参数：温度、盐和去污剂的浓度以及时间。洗涤缓冲液是盐水柠檬酸钠缓冲液 （SSC），缓冲液中的盐浓度控制洗涤步骤中的严格性。在其方案中，ACD 建议使用终浓度为 0.1x SSC、0.03% 十二烷基硫酸锂的洗涤缓冲液。在进行 DNAscope 和多重优化时，我们确定使用终浓度为 0.05x SSC 的洗涤缓冲液可以更好地显示 DNA 信号，并大大有助于减少因检测探针过夜孵育而导致的非特异性脱靶杂交。

在开始检测之前，需要根据组织类型和目标考虑检测方法的选择，即色原（红色或棕色）与荧光。红色显色方法将产生很好的对比，因为红色并不天然存在于组织中。棕色色原将产生与红色色原相似的结果。然而，重要的是要记住，组织中存在的一些血液降解产物具有相似的颜色，并且在量化时，纹身墨水将很难与棕色信号分开。荧光检测方法将允许明确区分不同的细胞标志物，而多重检测将提供完美的检测方法，对携带 vRNA 和/或 vDNA 的细胞进行表型分析。

需要多种对照来确保探针的特异性和检测的质量。每个新设计的探针都必须在已知的阳性和阴性对照组织或细胞沉淀上进行测试。我们通常生成包含靶向序列的质粒，并转染到细胞系中以生成阳性对照。对于每次运行，我们添加一个已知的阴性组织（HIV 或 SIV 阴性）、一个仅包含探针稀释剂的无探针对照和一个 RNase 处理的对照，以确保检测的质量和特异性。

定量是一个极其重要的步骤，应根据所提出的问题使用适当的工具和算法进行。在这份手稿中，我们展示了一个图像分析软件（例如 Cellprofiler），我们在评估了多个选项后选择了它。我们估计该软件是最适合我们需求的软件，但有许多图像分析软件程序可以使用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACD HybEZII Hybridization system (110V) with ACD EZ-Batch Slides system	ACD	321710	Hybridization oven
CAT Hematoxylin	Biocare medical	CATHE-GAL	colorstain
Clear-Mount	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	17985-15	mounting reagent for red chromogen
Immpact DAB Peroxidase Kit	Vector	SK-4105	Used to reveal HRP - DAB (Brown) to replace the DAB coming in the ACD kit
lithium carbonate	Fisher chemical	L119-500	bluing solution
paraformaldehyde	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	15714-S	for tissue fixation (4%)
PBS	life technology	14190-136
Permount Mounting Medium	ThermoFisher Scientific	SP15-100	mounting regaent for brown chromogen
Prolong Gold	ThermoFisher Scientific	P36930	mounting regaent for fluorescence
ribonucleases A	ThermoFisher Scientific	12091039	for RNAse treatment in DNAscope protocol
ribonucleases T1	Roche	R1003	for RNAse treatment in DNAscope protocol
RNAscope 2.5, 2-plex detection reagent	ACD	322430	Brown and red kit chromogen detection
RNAscope Target Retrieval Reagents	ACD	322000	retrieval buffer
SuperFrost Plus Glass Slides	ThermoFisher Scientific	12-550-17
TBS	BOSTON BIOPRODUCTS	BM-301-4L	for washes
TSA Plus Fluorescence palette kit (Cy3, Cy5, TMR, Fluorescein)	Perkin elmer	NEL760001KT	HRP Fluorescence detection
Tween 20	SIGMA	P1379-1L	for washes
XYLENE 20LT	ThermoFisher Scientific	AC422680200