慢性活体电成像的植入系统

摘要

此处介绍的是一种用于制造植入式系统的协议，用于在体内按时间顺序记录唤起和自发的肌电图电位。该系统适用于神经损伤后喉部肌肉再生的调查。

摘要

电成像 （EMG） 测量肌肉对电刺激或运动单元自发活动的反应，并在评估神经肌肉功能方面起重要作用。由于传统EMG记录技术的侵入性，反映神经损伤后肌肉再生状态的EMG活性的慢性记录受到限制。在这方面，一个植入系统被设计为长期，体内EMG记录和神经刺激。在一项有关喉肌再生的研究中，它已被应用和测试。该系统由1）两个双极电极神经袖口组成，用于刺激两种神经的引线:复发性喉神经（RLN）和上级喉神经（SLN）的内部分支;2） 两个EMG记录电极和引线为两个喉肌:后杏仁体（PCA）肌肉和胸腺素-侧杏仁体（TA-LCA）肌肉复合;和 3） 皮肤插座使用连接电缆将所有植入的引线端子连接到外部记录前置放大器和刺激器。导线引线为铁氟龙涂层、多丝状、316 型不锈钢。它们盘绕在清醒动物的身体运动过程中可以拉伸，以防止铅断裂和电极迁移。该系统在无菌手术期间植入。之后，在第二次手术中进行RLN转断之前进行基线EMG记录，以研究肌肉再生。在整个研究中，在麻醉动物中进行多次生理训练，以获得反映喉肌再生状态的唤起和自发的EMG活动。该系统结构紧凑，在研究过程中无感染，且高度耐用。这种植入式系统可以为麻醉或自由移动的动物提供一个需要长期记录或神经刺激的研究可靠平台。

引言

EMG 记录是一种有用的技术，用于测量骨骼肌在神经电刺激或运动单元自发燃烧激活时产生的电活动。监测EMG信号可用于评估神经肌肉传播和肌肉生物力学^1。EMG记录在描述神经损伤^后,3,4,肌肉重新摄氏的质量和幅度方面也起着^{重要作用。}然而，在整个重新化期间，无法通过侵入性方法实现多个 EMG 记录。因此，植入式装置已设计及开发，用于神经肌肉系统^{,,,6、7、8、9、10、11、12、137,8}的重复、慢性刺激^11,12和13记录。⁶⁹¹⁰本文的目的是描述一种用于制造和植入稳定系统的协议，以便从喉部获得可靠的按时间顺序排列的EMG数据。

该系统应用于喉肌再生研究。提供喉部概况（图1）。感觉和运动部件之间的精确协调对于呼吸、开票和气道保护期间适当的肌肉运动至关重要。PCA肌肉，位于后喉，是声乐折叠的唯一绑架者。这种肌肉在灵感中自发激活，以增加吸入的腺区面积。TA-LCA 复合体是声乐折叠的主要引物。激活此肌肉复合物与另一个加引器（即间体肌）的折叠进行振动和声音生成，并在吞咽过程中关闭褶皱以进行气道保护。

此外，运动神经元纤维在RLN中内化绑架者和加感肌肉。绑架者和加引器肌肉可以区分基于运动单位组成^{14，15。14,}PCA 肌肉在高卡普和/或缺氧条件¹⁶期间表现出更多的射击，因为存在吸气运动单元。相反，反射性凝血闭合（RGC）运动单元，通过激活喉黏液内的感觉受体，反身地关闭腺体，存在于TA-LCA肌肉复合体中。上级喉神经（SLN）的内部分支携带喉部¹⁷中感觉受体的发泡纤维。虽然开票主要是一种加带功能，但绑架者和加感器马达单元都参与这种高度进化的喉部行为。

图1:喉部解剖。还显示了此可植入系统的组件。SLN = 卓越的喉神经;RLN = 复发性喉神经;PCA = 后杏仁肌;TA-LCA = 胸腺素 - 侧杏状肌复合体;星展银行 = 深度脑刺激。这个数字是经威利²⁷号许可转载的。请点击此处查看此图形的较大版本。

对RLN的伤害可能导致声褶瘫（VFP），这会损害绑架和加带功能，由于喉肌变性14，18，19。^14,18,19随后，RLN神经纤维的再生和肌肉的再生通常发生。然而，重新生成是一个随机的过程，在大多数情况下会导致定向错误、不适当的肌肉重新连接。这被称为合成，其中自发激活绑架者和加引对手是错误的，并产生无效，甚至矛盾的运动的声乐折叠14，19，20，21。^14,19,20,21使用同步，失去的关键功能是声褶皱绑架，导致通风不足。虽然有正在进行的尝试治疗喉部同步因子由1）阻止肉毒杆菌^22，23,23或2）电刺激性开口与植入心脏起搏器^{24，25，,25}有没有临床干预，可靠地防止同步因子^26。然而，有证据表明，在低频重新授信过程中PCA肌肉的电调节促进适当的神经肌肉重新连接，并尽量减少同步发生。目前正在进行研究，以阐明基本机制^2。

本文的重点是描述一种简单、廉价的慢性神经刺激和EMG记录植入系统。该系统可用于研究PCA肌肉的低频电调理对其后续再授的特异性的影响。该系统获得的EMG信号可以反映随着时间的推移喉肌再生的质量和数量。

研究方案

这项研究已获得范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并根据《实验室动物护理和使用指南》（马里兰州贝塞达国家卫生研究院）进行。该系统包括五个植入组件和一个外部电缆。

1. 两个双极 RLN 刺激电极袖口，每个带有一对线圈导线和端子引脚

1. 对于每根袖口引线，使用铁氟龙涂层、多丝、316 型不锈钢丝（绝缘直径为 0.0078"或 0.198 mm）。使用卷绕装置或采购预制卷材引线，将 70 厘米长的导线切割并卷入 12 厘米长的弹簧中。如有必要，拉伸弹簧以增加每个植入部位的长度。保持卷绕导线的末端在 3 mm 和 10 mm 长度处笔直，并使其脱绝缘。
2. 将镀金铜母销焊接到卷绕引线的 3 mm 端上。
3. 要准备神经袖口，请从一卷管子中切割 5 mm 的硅胶管段（OD = 0.156"，ID = 0.094";或 OD = 3.96 mm，ID = 2.39 mm）。
4. 要将引线插入管中，请使用 25 G 皮下针刺穿管道壁，从末端穿过 1.5 mm 的管壁，并靠近内壁。将铅的 10 mm 端回填到针尖中。取出针头将脱绝缘部分放入管中。弯曲回管外的裸线端，并在进入管的点扭曲到导线上。
   注:使用操作显微镜执行这些步骤。探头可以放入管中，将导线与内壁弯曲。目标是定位导线的裸露部分，以便刺激可以输送到神经，而不会对神经造成机械损伤。
5. 使用相同的步骤从管的另一端插入第二个引线 1.5 mm。将入口点与第一个潜在顾客的切入点对齐。用针刺穿墙壁，使导线的裸部分沉积在靠近第一根导线对面的内壁附近。
   注:向下看管，两个刺激电极应形成45°"V"形状，这将跨越神经一旦到位，并确保电流通过神经从阳极到阴极。
6. 使用一对弯曲的剪刀，在进入电极点对面的管壁上做一个 S 形狭缝。
   注:然后，在手术过程中，可以打开袖口的螺旋唇，将电极之间的神经置于原位。
7. 使用弯曲的显微外科针将长度为 6-0 的单丝、不可吸收的缝合插入每端的袖口壁中，最终固定神经周围的袖口。
8. 应用医疗级 A 型硅胶，以重新隔离袖口外所有裸露的电线。

2. 两个双极性 SLN 刺激电极袖口，每个带有一对线圈导线和端子引脚

1. 以与 RLN 刺激电极袖口相同的方式组装 SLN 刺激电极袖口。但是，使用直径较小的（OD = 0.125"，ID = 0.062";或 OD = 3.18 mm，ID = 1.57 mm）管，因为神经的直径较小。

3. 两个 PCA 肌肉 EMG 记录电极，每个电极都带有线圈引线和端子引脚

1. 如步骤 1.1 中所做的那样，为 PCA 肌肉电极组装盘绕引线。
2. 将母销焊接到引线上，如步骤 1.2 中所做的那样。
3. 使用针引线插入袖口的相同策略将 PCA 肌肉引线的 10 mm 端插入深脑刺激 （DBS） 电极的尖端（步骤 1.4）。弯曲引线的末端以形成一个钩子，并夹住它，以提供总共 5 mm 的录制长度。
   注:在此应用中，PCA 肌肉及其重新内侧神经端子暴露于电调节下。刺激由植入式脉冲发生器 （IPG） 生成，并通过 DBS 电极输送到喉肌（图 1，内部）。该系统适应治疗性脑刺激（如帕金森病）。星展电极将入一个肌肉下袋，并固定在原位。如果不需要肌肉的电调节技术，PCA EMG 电极可以直接插入肌肉，并通过其钩子固定。

4. 两个 TA-LCA 肌肉复合 EMG 记录电极，每个电极都带有线圈引线和端子引脚

1. 组装 TA-LCA 肌肉电极的盘绕引线，如步骤 1.1 中所做的那样。
2. 将母销焊接到引线上，如步骤 1.2 中所做的那样。
3. 去除 5 毫米 x 10 毫米矩形件针织聚酯嫁接。用 20 G 皮下针在网中心打一个洞。将铅的 10 mm 端引入孔中，再突出 3 mm 线圈。"使用 6-0 单丝、不可吸收缝合将引线粘贴到网格上。
   注:这块网状物将用于锚定电极导致甲状腺软骨覆盖肌肉复合体。
4. 弯曲引线的末端以形成一个钩子，并夹住它，以提供总共 5 mm 的录制长度。

5. 用于电极和外部设备之间连接连接的皮肤插座

1. 利用单排母针条纹连接器制作插座。从条带上切割两块（每块 17.5 毫米长），每个块包含八个针孔。首先，用砂纸对每件制品的外表面进行粗加工，然后将它们与苯酚粘在一起，放在烟头上，制作双排连接器。将接头放入 60~80°C 水中，在烟头中放置 30 分钟，以便进行胶水硬化。
   注:这种双排装配格式将为左侧电极与右侧电极分配针孔提供方便。
2. 从条带上切割一块 25.6 mm 长度的片子，使连接器的面板（将突出在植入部位外用于皮肤锚定的部分）。用手术刀在面板中间切割一个 5.4 mm x 17.4 mm 矩形孔。
3. 将双排接头放在面板的矩形孔内，直到与面板表面齐平，而不会突出。如果接头不适合面板的矩形孔，则孔可以通过文件稍微放大。由于接头孔不对称，请将直径较大的接头边插入面板。
   注:因此，插入连接器相反边缘的母销与直径较小的孔将卡住并锁定到位。
4. 使用苯酚将接头和面板粘合在一起。将组件放入 60–80°C 水中，在烟头中放置 30 分钟，以便进行胶水硬化。
5. 在面板的每个角和面板的每一侧钻一个 1.3 mm 的孔，从两端的中间钻出总共六个孔。
   注:这些孔将用于缝合植入部位的最终皮肤贮器。
6. 切割 15 mm 长度的针织聚酯嫁接管，将装配包围在面板下方，使装配具有生物相容性。要将管固定到组件上，请使用皮下针将不锈钢导线穿过壁，沿其长度在三个同样间隔的位置（每个间隔 3.8 mm）。
7. 在接头的每个角放置同样间距的凹口，将导线固定在装配表面上。用一对钳子扭动每根导线的末端，将管子拧到装配体上，形成一条裙子。
8. 在贮器的一端的聚酯贴片上做永久标记。
   注:在植入手术期间，使用这个标记进行方向识别容器的玫瑰端。在玫瑰色方向上，两行（左侧和右侧）的以下引脚电极分配应如下:PCA EMG、TA-LCA EMG、空孔、空孔、RLN 阳极、RLN 阴极、SLN 阳极和 SLN 阴极。

6. 外部连接电缆到记录前置放大器和刺激器

注:在神经刺激-EMG 记录会话（第 8 节和第 10 节）期间，电缆用于在植入式皮肤贮器和外部设备之间连接。它由12根绝缘导线组成，用公针终止，插入皮肤贮器中的母针。该电缆由两部分组成:EMG记录插头和神经刺激线。需要一个记录插头，用于将低压 EMG 信号与从刺激引脚辐射的较高电压刺激伪影隔离开来。出于同样的原因，皮肤贮器每排的两个孔都无人居住，无法将记录销与刺激针分开。

1. 要制作 EMG 录制插头，请使用公条连接器（长度和宽度相同，但母连接器高度的一半）。切成两块，每个只包含两个孔。使用相同方法使用苯酚粘合剂固定两块，使双排连接器进入皮肤贮器（步骤 5.1）。将四根 EMG 记录导线放在电缆中，并将端子公销插入四个孔中的每个孔中，直到它们锁定到位，尖子伸出带边缘。
2. 使用骨水泥密封插头顶部以隔离线针接头。
3. 使用电缆中剩余的八根导线，在公针中终止，通过母针与神经刺激袖口进行单独连接。

7. 首次植入手术

1. 从有执照的农场获得一只1⁄2岁、20-25公斤、两性可得的一只20-25公斤的一只。在无菌植入手术前使动物适应。手术前自动扣所有设备。手术前10~12小时不保留食物。
2. 准备动物做手术。
   1. 剃掉动物的头部和颈部，用酒精和贝塔丁磨砂溶液清洁皮肤。通过静脉注射2⁄4mg/kg氯胺和佐拉西帕组合来麻醉动物，然后通过插管在氧气中注射3%异氟丙酮。
   2. 将动物放在手术台上，加热垫位于上部位置，并手术将动物披上窗帘。在整个手术过程中，至少每15分钟监测一次动物的心率、呼吸速率、体温和氧饱和度，以确保麻醉的中度平面的生理稳定性。
3. 使中线颈部切口从甲状腺切口到宫内。从食道中分离气管，露出软骨的劣质边界。
4. 将刺激袖口放在每个双边 SLAN 和 LN 上。使用随附的缝合线关闭每个袖口的嘴唇。
5. 在两侧的甲状腺软骨前表面用活检冲孔（直径4毫米）制作软骨窗。暴露两个 TA-LCA 肌肉复合物的横向方面。使用 23 G 针将 EMG 记录电极插入 TA-LCA 肌肉复合体中，将棒插入针尖。将电极聚酯贴片缝合到软骨上。
6. 将 DBS 电极及其配套钩线 EMG 记录电极放在每侧的 PCA 肌肉下方。使用内窥镜确认刺激对每个通道产生声带拐骗。用4-0个不可吸收的缝合将 DBS 电极固定到软骨上。
7. 通过母销将神经刺激-EMG 记录电极的所有导线插入插座。使用用六一形制成的插入工具将针脚压入孔中。用骨水泥密封插座的劣质表面，以隔离铅针结。
   1. 水泥硬化后，将贮器放在中线切口的玫瑰端，穿过皮肤，通过聚酯裙缝合至皮下组织。通过面板孔的缝合线将皮肤边缘连接到插座上。
      注:一个下颚的海他机有一个末端狭缝，导致一个反水槽孔。引线可通过狭缝定位进入孔，反水槽可放置在销头上。第二个钳口放在插座的另一侧。将海麻挤压将销压入其相应的插座孔中。
8. 在左颈部切开，露出梯形肌。执行解剖，使植入式脉冲发生器的植入性口袋处于亚肌肉口袋。隧道每个星展扫描器都潜入颈部切口，插入IPG。
9. 用缝合线关闭所有手术伤口。密切监测动物，直到手术完全恢复。
10. 定期向动物提供术后镇痛药（例如，丁丙诺啡:0.01~0.02毫克/千克），长达48小时。 给动物口服抗生素（例如，头孢子:10毫克/千克）至少3天。此后，动物单独饲养，并限制运动10天，以便正常伤口愈合和稳定植入装置。
    注:皮肤贮器应每天使用与组织兼容的防腐剂溶液进行清洁。此外，除 EMG 录制会话期间外，应定期将假公针插入皮肤插座的母针中。此操作将避免容器中碎片堆积，允许与外部电缆进行有效连接，并防止感染。

8. 基线神经刺激-EMG 记录会话

注:在植入手术（第 7 节）和神经切除手术（第 9 节）之前执行这些会话，在双边 RLN 完好无损时获得基线 EMG 信号。在标准神经刺激-EMG 记录会话（第 8 节和第 10 节）期间应用以下协议。

1. 在10~12小时手术前保留食物。用瓦塔胺和佐拉西帕组合麻醉动物（通过静脉注射初始加载剂量2⁄4mg/kg，然后通过i.v.线维持每小时0.4毫克/千克）。将动物放在加热垫上，放在上部位置，并将动物保持在适度的麻醉平面中。如步骤 7.2 所述，在手术过程中监测动物的至关重要性。
2. 通过喉镜插入带有 CCD 摄像机的零度刚性内窥镜，以可视化 glottis 水平的声势折叠运动。
3. 通过插入式和引脚将连接到实验室刺激器和 EMG 前置放大器的外部电缆连接到皮肤插座。将前置放大器的输出连接到数据采集设备和/或示波器，以显示、记录和测量 EMG 信号。
4. 分别将刺激（单方波脉冲、0.1~0.5 ms 持续时间、0.5~2.0 mA 振幅）分别传送到左和右 RLN，以记录每种条件下双边 TA-LCA 复合体和 PCA 肌肉产生的 EMG 响应。
5. 分别将刺激（单方波脉冲、0.1~0.5 ms 持续时间、0.5~2.0 mA 振幅）分别传送到左和右 SLN，以记录每种条件下双边 TA-LCA 复合体和 PCA 肌肉产生的 EMG 响应。
6. 通过动物的嘴提供与室内空气混合的CO_2，以诱导高卡皮酸，增加动物的呼吸努力。限制接触1分钟，在此期间将发生最大吸气电机单位招募。记录TA-LCA复合物和PCA肌肉在此超加量条件下的自发EMG活动。
7. 监测动物，直到从麻醉中完全恢复，并将动物送回设施。

9. 神经切除和阿纳托莫斯特的第二次手术

1. 在第一次手术后10-14天进行第二次手术。手术前将食物保留10~12小时。
2. 使用步骤 7.2 中描述的技术，麻醉动物、窗帘和监测生命。
3. 尽可能通过钝剖面拆下缝合线并重新打开中线切口。避免在解剖过程中损坏以前的植入。通过解剖公开双边 RLN。分离、横断面和肛门，用7-0单丝、不可吸收的缝合线来诱导双性喉部麻痹。
4. 用无菌盐水和根分霉素抗生素灌溉颈部切口。使用 3-0 可吸收缝合线关闭肌肉和皮下组织。用 3-0 不可吸收的单丝缝合线关闭皮肤。
5. 密切监测动物，直到手术完全恢复。
6. 提供镇痛药（例如，丁丙诺啡:0.01~0.02毫克/千克），术后可正常提供48小时。口服抗生素（例如，切福多西米:10毫克/千克）至少3天。限制动物锻炼10天，以便正常伤口愈合。

10. 双边RLN受伤后的神经刺激-EMG记录会议

1. 在前 3 个月内每周执行 1 次这些会话，然后每两周执行一次。请按照第 8 节中描述的协议进行这些会话。

结果

组件的示例如图2所示。图2A中从左到右分别有神经刺激袖口、TA-LCA记录电极、PCA记录电极和皮肤接口插座。这些组件的相对大小是可以欣赏的。皮肤贮器 （图 2B） 有两行孔，每个盘绕导线末端的母针（图 2D）插入。在植入手术期间，它们入到面板（箭头）的对面。插座有一个聚酯裙 （图 2C） 连接到其连接器侧壁.此裙设计用于通过结缔组织渗透将插座固定到位。每个铁氟龙涂层不锈钢EMG引线（图2E）在尖端脱绝缘（5毫米），形成一个钩状电极，用于肌肉记录。刺激袖口有两个电极螺纹在内袖口壁上。它们被分离的距离为2毫米（图2F），并形成"V"形状（图2G），以确保电流通过神经传递。

图 2:植入系统的组件。（A） 从左到右分别是神经刺激袖口、TA-LCA 记录电极、PCA 记录电极和皮肤接口插座。（B） 显示两排孔的皮肤贮器。（C） 显示连接到连接器侧壁的聚酯裙的插座。（D） 包含母针的线圈导线插入 B. （E） 铁氟龙涂层不锈钢 EMG 引线在尖端脱绝缘 （5 mm）， 形成钩状电极用于肌肉记录.（F） 刺激袖口有两个电极螺纹在内袖口壁上，由 2 mm 分隔。 （G） "V"形形成电极，以确保电流通过神经传递。这个数字已修改与权限^27。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 3显示了植入式皮肤容器以及外部设备的电缆如何与插座连接。需要注意的是，虚拟公针（未显示）插入插座的母针中，使其在录制会话之间没有碎屑。

图3:皮肤插座和接口电缆。（A） 前颈部植入的皮肤贮器，没有假男性针脚。（B） 图像描绘了在神经刺激-EMG 录制会话期间，来自外部设备的电缆的刺激引脚和 EMG 记录插头（箭头）如何与插座接口。这个数字已修改与权限^27。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 4显示了来自其中一个基线会话的 EMG 录制，其中 RLN 保持不变。

图4:从喉肌中记录正常内侧性。（A） 从 RLN 刺激产生刺激伪影（箭头）的 PCA 肌肉记录的示例，然后是一个大型的唤起 EMG 电位。（B） TA-LCA 肌肉复合体的示例记录，其中 SLN 刺激产生刺激伪影（箭头）。此处表示的是 （a） 短延迟单突肌响应和 （b） 长延迟多突复式 RGC 响应。（C） 在正常灵感期间从 PCA 肌肉记录的自发 EMG 活动的突发（箭头）。（D） 在 CO₂交付过程中增加吸气 EMG 活性。这个数字已修改与权限^27。请点击此处查看此图形的较大版本。

在从PCA肌肉（图4A）的录音中，RLN刺激产生刺激伪影（箭头），然后是一个大的唤起EMG电位。最大的RLN-唤起响应提供了良好的指数，正常内化的整体幅度，以及后续神经病菌后重新排位水平，无论运动单位类型如何。这是事实，因为RLN包含吸气和反射性闭合（RGC）电机单元的神经纤维。RLN 刺激招募这两种类型的单位。调用 EMG 运动单元活动在 20 ms 的时间段内进行校正和集成，以获得肌肉内化的定量测量。

在TA-LCA肌肉复合体（图4B）的录音中，SLN刺激产生刺激伪影（箭头）。此伪影后跟短延迟单突肌响应 （a） 和长延迟多突直性 RGC 响应 （b）。潜在的 （a） 是甲状腺功能减退肌的直接反应，因为这种肌肉由 SLN 的附近外部分支内化。此分支的杂散激活通常发生在神经袖口刺激内部分支期间，以激活 RGC 响应。甲状腺电位由TA-LCA电极记录，因为这种肌肉位于复合体附近。先前的研究表明，通过分割SLN的外部分支（Zealear，未发表的观察结果），可以有选择地消除内部分支刺激引起的甲状腺功能。最大 SLN-唤起 EMG 响应通过其 RGC 感官运动通路反映 TA-LCA 复合物的自然内化量级。在RLN神经病之前，PCA肌肉没有RGC内伸，因此不应从这个肌肉中检测到SLN电位。在神经截断和修复后，SLN-唤起电位反映了TA-LCA复合物的正确RGC重新化量和PCA肌肉不正确的RGC重新化。RGC 活动通过 20 ms 的整流和集成来量化，以捕获整个 RGC 波形。

在 （图 4C）， 自发 EMG 活动的突发（箭头） 记录从 PCA 肌肉在正常灵感期间.这种吸气 EMG 活性在 CO₂交付过程中增加，如图4D所示，扫描速度较慢。自发的PCA EMG活性提供了一个良好的估计，通过它原来的吸气摩托神经元这种肌肉的正常内化的大小。TA-LCA复合体没有吸气内化，因此不应从这些肌肉中检测到吸气电位。这是因为只有吸气运动装置才会在麻醉动物的最大吸气努力中绑架声带。在神经截断和修复之后，自发吸气电位反映了PCA肌肉正确重新化的程度和TA-LCA复合物不正确的重新化程度。吸气EMG活性的记录在8个时间段内被放大、纠正和整合。

讨论

本文介绍了制造一种新颖、经济且可植入的系统，用于刺激喉神经和长期记录喉部肌肉EMG反应所需的步骤。该协议并不复杂，可以产生一种可以紧凑，可以像老鼠一样小的动物中使用的植入物。有几个关键步骤需要强调。首先，导线应仔细均匀地盘绕，以防止铅脱绝缘、扭结或断裂。如果没有线圈机，则可以以商业方式获得预制盘绕引线。其次，将铅丝插入硅胶管以形成横跨神经的"V"策略对于促进通过袖口内的神经电流输送至关重要。如果两根引线都放在管的同一侧，则电极之间的电流可能会分流。引线定位在管内壁上，以避免神经切片损伤的可能性也很重要。

第三，在植入手术中，应仔细解剖喉部神经，以防止损伤。在植入的后期，当将销插入插座时，应用力施加到与孔对齐的销上，以防止销头突然弯曲。随后，骨水泥应彻底分布在贮器底部，以完全绝缘并防止通道之间的串扰。最后，预防感染对于确保植入物系统随时间的健全至关重要。它可以通过多种操作的组合来实现:在贮器中添加一条裙子，给抗生素服用抗生素，每天用与组织兼容的防腐剂溶液清洁伤口和贮器，以及将假公针放入容器的母针中，使其在会议之间清理碎屑。

该协议已被证明是成功的，在这个狗喉模型。但是，对于其他应用程序，可能会考虑某些修改或替代策略。例如，PCA 和 TA-LCA EMG 电极的脱绝缘传感尖端通过外部手段（聚酯移植物或 DBS 电极）固定在肌肉中。在不需要或执行外部锚定的应用中，仅电极的棒子就可以作为锚点。在这种情况下，铁氟龙涂层，不锈钢，单丝丝可能比多丝丝更可取，由于其更大的拉伸强度，提供一个在组织上更稳定的棒。但是，应该注意的是，多丝线可能不太容易断裂。制造和组装皮肤贮器的替代策略是使用生物相容性聚合物进行 3D 打印（例如，Stratasys 的 MED610）。这可能会简化制造过程。

在植入手术和动物恢复后，在RLN仍然完好无损下进行生理会话，以获得基线数据。在会话期间，在 RLN 刺激后，可能会出现来自喉肌的 EMG 信号。为了排除故障原因（表1），应首先确定是否存在声褶皱运动。如果存在，这意味着神经被袖口有效激活，但 EMG 引线有问题。在此情况下，用户应进一步查看 EMG 刺激伪影。如果 EMG 伪影不存在，则前置放大器的 EMG 输入中可能会出现不连续性。六十个周期噪声也会存在，振幅也很大。如果伪影较大，则从刺激引脚分流到记录引脚可能负责使通道前置放大器饱和并消除 EMG 响应。如果工件是正常的，则 EMG 引线可能脱离肌肉，无法检测到其活性。另一方面，如果声乐折叠运动不存在，那么神经就不会被激活。如果伪影不存在，刺激回路中可能存在不连续性，从而防止神经激活。如果工件看起来正常，神经可能在植入手术期间受伤，或者袖口可能从神经中移出。在 SLN 刺激期间，可以应用类似的策略来排除 EMG 信号缺失的原因。

刺激神经	目标肌肉	Ipsi边声折叠运动	刺激伪影	原因
RLN	PCA 和/或 TA-LCA	是的	不存在（存在 60 周期噪声）	EMG 输入到前置放大器的不连续性（例如引线、引脚、电缆）;
			大	接收器上的插断针和记录引脚之间的串扰
			正常	EMG电极的错位
		不	缺席	刺激回路的不连续性
			正常	1. RLN伤害;2. 袖口错位
SLN	TA-LCA	是的	不存在（存在 60 周期噪声）	EMG 输入到前置放大器的不连续性（例如引线、引脚、电缆）;
			大	接收器上的插断针和记录引脚之间的串扰
			正常	EMG电极的错位
		不	缺席	刺激回路的不连续性
			正常	1. SLN 或 RLN 伤害;2. 袖口错位

表 1:故障排除指南。

应该指出，该技术目前的应用有两个次要限制。首先，在插入插座时，母销突然弯曲，多次发生。幸运的是，引脚可以成功拉直并插入其孔中。如果销损坏不可修复，则需要更换引线及其整个部件。因此，备份组件应在手术前随时可用。其次，完成手术植入所需的时间很长（+10小时）。持续时间长部分反映了本研究所需的大量刺激和重新编码组件:四个神经、四个肌肉、一个贮器和一个IPG。如果使用这种技术需要的组件更少，植入时间应显著缩短（例如，大鼠舌头模型^28）。

这种技术方法引入了几个功能，这些功能比现有方法具有优势。引线的线圈是该系统最新颖、最重要的特点。尽管卷绕引线提供了许多好处，但通常不能用于非商业性动物实验。在植入过程中，卷绕引线可以扩展到所需长度。此外，它会伸展在清醒的，移动的动物，以防止电尖脱位或电线断裂后植入。此功能可确保植入物的使用寿命以及长期稳定的神经刺激和肌肉记录。此外，在贮器周围添加一条与组织相容的裙子可防止伤口接触此异物，并在无感染的情况下促进正常的纤维化和伤口愈合。以前没有这种裙子的研究导致早期感染和过早终止实验。最后，该植入系统结构紧凑，多渠道，允许从不同大小的动物模型中的众多神经肌肉结构获得有效数据。

这种技术方法已经调整，并成功地转化为老鼠模型。本研究旨在研究电调节对预防老年大鼠舌肌肉萎缩和功能障碍的影响。低光泽神经被植入袖口电极进行调理，舌头植入EMG记录电极^28。该技术还可用于其他研究应用。作为目前协议在动物喉部的延伸，电调节对促进选择性再授的作用目前正在研究在兔子面部肌肉。这项研究可能为预防贝尔麻痹患者的面部同步性提供基础，这是一种常见且使人衰弱的病症。这项技术的最终潜在用途是刺激和记录从清醒的，自由移动的动物。目前，这些数据是通过外部电缆从清醒的，无拘无束的老鼠^28。将来，这个经济系统也可以与远程记录刺激技术（例如遥测）相结合，以无线方式激活或探测神经肌肉系统。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 G x 1" Gauge hypodermic needle	BD	305175
23 G x 1" Gauge hypodermic needle	BD	305145
25 G x 1" Gauge hypodermic needle	BD	305125
3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL	Ethicon	J219H
3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene	Ethicon	8684G
4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene	Ethicon	8871H
6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene	Ethicon	8805
7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene	Ethicon	M8735
Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98%	ACROS	code 194790100	for dilution of modical adhesive silicone
Bone cement	Zimmer	1102-16	20g powder 10 mL liquid
Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl)	Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd	12496-0757-1
CCD video camera attached to the endoscope	Sony	MCC500MD
Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets)	Zoetis	5228
Data acquisition device , PowerLab 16/35	ADInstruments, Inc	5761-E
Deep-brain stimulation (DBS) electrodes	Abbott	6172ANS
Digital oscilloscope	Tektronix	DPO71304SX
Implantable pulse generator (IPG), Infinity	Abbott	6660ANS
Knitted polyester graft	Meadox Medical Inc	92220	20 mm in diameter
Medical Grade Polyethylene Micro Tubing	Amazon.com	BB31695-PE/13-10	OD 0.156", ID 0.094"
Metal female pin	Allied Electronics & Automation	220-S02-100
Metal male pin	CDM electronics	220-p02-1
Prefabricated coiled leads	Medical innovations Inc.
Silastic Laboratory Tubing	Cole-Parmer	2415569	OD 0.125", ID 0.062"
Silastic Medical Adhesive Silicone	Dow corning	Type A, 2 oz
Stainless steel monofilament wire	The Harris Products Group	type 316	0.008" (coated), 0.005" (bare)
Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm)	Sklar Instruments	96-1146
Strip connector	CDM electronics	2.6 x 11.6 x 101.5 mm	single row, round, through hole
Teflon-coated multi-filament stainless steel wire	Medwire	Part 316, ss7/44T
Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL	Zoetis	004866
Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon	Zoetis	540561
Zero-degree rigid endoscope	Karl Storz	8712AA