从3维球体培养中分离出类似干细胞的细胞

摘要

我们使用人类原发性前列腺上皮细胞，报告一种新的无生物标记方法，通过基于球体的标签保留测定，对干细胞进行功能表征。介绍了 BrdU、CFSE 或远红色 2D 细胞标记的分步协议;三维球形形成;通过免疫细胞化学进行标签保留干细胞鉴定;和隔离由FACS。

摘要

尽管成人干细胞研究取得了进展，但从组织标本中鉴定和分离干细胞仍然是一个重大挑战。虽然常驻干细胞在成人组织中具有利基约束，但它们进入无锚三维（3D）培养的细胞周期，并经历对称和非对称细胞分裂，产生干细胞和祖细胞细胞。后者迅速增殖，是处于不同谱系承诺阶段的主要细胞群，形成异质球体。使用原发正常的人类前列腺上皮细胞（HPrEC），开发了一种基于球体的标记保留测定，允许在单个细胞分辨率下识别和功能分离球形启动干细胞。

HPrEC 或细胞系与 BrdU 一起培养 10 天，以允许将其纳入所有分裂细胞的 DNA，包括自更新干细胞。洗涤开始转移到3D培养体5天，在此期间，干细胞通过不对称分裂自我更新，并启动球形形成。虽然相对静止的女儿干细胞保留了带有BrdU标记的亲子DNA，但女儿后代迅速增殖，失去了BrdU标签。BrdU可以用CFSE或远红亲染料替代，允许FACS进行活干细胞分离。干细胞特性通过体外球形形成、体内组织再生测定和记录其对称/不对称细胞分裂来确认。下游分子和生物研究，包括RNA-seq、ChIP-seq、单细胞捕获、代谢活性、蛋白酶分析、免疫细胞化学、有机体形成和体内组织再生，可以严格探究分离的标记保留干细胞。重要的是，这种无标记的功能干细胞分离方法从新的癌症标本和来自多个器官的癌细胞系中识别干细胞样，表明其广泛适用性。它可用于识别癌症干细胞样生物标志物，筛选针对癌症干细胞的药物，并发现癌症中新的治疗靶点。

引言

人类前列腺含有具有分泌功能的明上皮，其基础细胞以及不寻常的神经内分泌细胞成分。上皮细胞，在这种情况下，产生于罕见的前列腺干细胞群，在体内相对静止，并作为修复系统，以维持腺平衡在整个生命^1。尽管取得了许多进展，前列腺干细胞的鉴定和功能分离仍然是该领域的一大挑战。干细胞生物标志物，包括基于细胞表面标记的方法，结合流式细胞测定，通常用于干细胞研究^2、3、4。然而，由于标记组合和抗体特异性^5，6的函数，富集和分离的结果差异很大，对分离细胞的身份提出了疑问。另一种广泛使用的干细胞富集方法是三维（3D）球体培养^2，3，4。虽然常驻干细胞在体内相对静止，具有利基约束，但它们在3D基质培养（对称和非对称）中经历细胞分裂，产生干细胞和祖细胞，迅速繁殖，向血统承诺^7，8。形成球体是一种异质混合物，含有干细胞和祖细胞，处于不同谱系承诺阶段，包括早期和晚期祖细胞。因此，使用整个球体的测定不是干细胞独有的，使得独特的干细胞特性的鉴定没有定论。因此，创建检测以识别和分离其女儿后代的前列腺干细胞至关重要。为此，目前协议的目标是建立一个检测系统，以便有效地识别和分离人类前列腺组织的干细胞，然后对其生物功能进行强有力的下游分析。

长期5-溴-2'-脱氧尿碱（BrdU）标签保留被广泛用于体内和体外血统追踪干细胞基于其长期倍增时间^9，10。本文描述的前列腺干细胞鉴定和分离的目前方法基于其相对静止特性和在混合上皮种群中的标签保留特性。此外，根据不朽的链DNA假说，只有干细胞可以进行不对称细胞分裂。干细胞代表含有较老父母DNA的子细胞，而祖细胞（即一个承诺子细胞）则接收新合成的DNA。上述独特的干细胞特性被利用在原发培养物的亲子干细胞中执行BrdU标记，然后在转移到3D无锚球体培养物后跟踪其标签。虽然大多数原发性前列腺上皮细胞在二维培养中保留基底和中转扩增表型，但也有罕见的多能干细胞补充和维持上皮平衡，这在转移到^3、12时形成球形或完全分化的有机体，具有相应的培养基。在我们目前的协议中，通过使用HPrEC前列腺球体或基于前球的BrdU、CFSE或远红保留性检测，然后进行荧光活化细胞分拣（FACS），我们在单细胞¹³级识别球体中保留标签的干细胞。

重要的是，我们进一步确认了在早期球体中贴片细胞的干细胞特性，与具有血统承诺的祖细胞相比。这些包括干细胞不对称分裂、体外球体形成能力和体内组织再生能力、自噬活性升高、核糖体生物发生增强和代谢活性下降。随后，进行了RNAeq分析。观察到在标签保留球体细胞中表达的不同基因，这些基因可作为人类前列腺干细胞的新型生物标志物。这种基于球体的标签保留方法可应用于癌症标本，以类似地识别少量癌症干细胞，从而提供转化机会来管理治疗耐药人群¹³。下面介绍以人类原发性前列腺上皮细胞（HPrEC）为例，采用基于前层的标签保留测定。

研究方案

所有细胞处理和介质制剂均应在 II 类生物安全柜 （BSC） 中采用无菌技术进行。

1. 二维HPrEC细胞的培养与维护

1. 在室温 （RT） 下，用 2 mL 的 2.5 μg/cm²纤维内丁溶液涂抹 100 mm 培养皿。吸出溶液，让培养皿在BSC中晾干45分钟。 Fibroinin涂层培养皿可在4°C下储存2~4周。
2. 将9 mL的前列腺上皮细胞生长培养基（例如PrEGM）加入纤维素涂层100毫米培养皿中，并在37°C的_CO2培养箱中保持菜肴温暖。
3. 在37°C水浴中解冻一小瓶冷冻的HPrEC细胞（2 x 10 5/mL），并在10mL的温暖介质中重新悬浮细胞。
4. 在RT.吸气器下将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
5. 彻底重新悬浮在1 mL的温暖培养基培养基的细胞。种子细胞通过移液1mL的细胞悬浮液直接进入纤维素涂层100毫米培养皿，含有9 mL的预加热介质（介质和细胞的总体积为10 mL）。在 37°C 下将培养皿放回_CO2培养箱中。
6. 每 2 天补充一次介质。为此，请小心吸出所有介质，并添加 10 mL 的新鲜加热介质。
7. 在大约 5 天内，确保文化融合为 +70-80%。在37°C下孵育3mL为0.05%胰蛋白酶/EDTA的细胞进行酶消化5分钟。
8. 加入含有10%FBS的3 mL热PBS，停止消化。
9. 将细胞收集到50 mL的离心管中，在500 x g下以500 x g离心5分钟，在RT.吸气器下吸气并丢弃上清液。
10. 将细胞颗粒重新悬浮在30 mL的温暖介质中，并将其均匀地放入三个新的纤维素涂层 100 mm 培养皿中，用于下一段。
    注:原发性HPrEC细胞可通过+3~5倍，而不改变其基底上皮细胞特性。上皮表型通过基底上皮细胞标记物细胞角蛋白5和p63的表达与免疫细胞化学/免疫荧光（ICC/IF）测定进行测试。

2. 使用 BrdU、CFSE 或远红色亲染料标记 HPrEC

注: 单元格可以继续步骤 2.1 或步骤 2.2，然后按照步骤 3.1 中所述转移到 3D 前层培养。

1. 使用 BrdU 的细胞的单标记
   1. 培养 2 x 10⁵ HPrEC 细胞在纤维素涂层 100 mm 培养皿与 10 mL 的热介质包含 1 μM BrdU。培养细胞10天（超过两个通道），以确保所有细胞，包括前列腺干细胞和祖细胞的标签。
   2. 10天后，小心地吸出含有BrdU的PrEGM培养基，用5mL的温PBS清洗细胞。重复 1x。
   3. 执行酶消化使用0.05%胰蛋白酶/EDTA的步骤1.7-1.8中所述。在RT.吸气器下，在500 x g下将细胞离心5分钟，然后丢弃上清液。
   4. 在500 μL的冷膜（1:1）基底膜基质/介质中重新悬浮BrdU标记的颗粒细胞（5 x 10^4），并转移到3D前膜培养物（步骤3.1中所述）5天，以便在球形形成期间（+6细胞周期）中进行BrdU洗涤。
2. 使用 BrdU 和 CFSE 或远红色亲染料对细胞进行双重标记
   1. 如果需要为活细胞进行共标记，请从步骤 2.1 开始使用 BrdU 孵育预标记细胞 10 天，并在第 10 天使用 5 μM CFSE 或远红活细胞荧光亲染料进行共标记 30 分钟。
   2. 小心吸出含有BrdU和CFSE或远红亲染料的介质。用5 mL的温暖PBS清洗细胞。重复洗涤 1 次。
   3. 使用步骤 1.7~1.8 中所述使用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 进行酶消化。在RT处将细胞在500 x g下离心5分钟，取出并丢弃上清液。
   4. 在500 μL的冰冷（1:1）基底膜基质/介质中重新悬浮共标记的细胞（5 x 10^4），并转移到3D前膜培养物（见第3.1节所述），允许在球形形成期间进行BrdU和CFSE或远红洗涤（+6细胞周期）。
3. 执行球体中的标签保留细胞（第 5 天前球）的检测，如步骤 4.1、4.2、4.3 或 5 中所述。
   注: 卡博基氟辛二乙酸二乙酰酯 （CFSE） 和远红是长效荧光亲染料，并很好地保存在标记细胞中。活细胞中的细胞内酯酶会粉碎醋酸酯组，这些醋酸酯组激活了现在膜不渗透的绿色或红色荧光分子。

3. 三维基底膜培养系统中的球层形成

1. 三维基底膜基质系统中的球层培养
   1. 在4°C下解冻基底膜基质过夜，并在使用前保持冰。
   2. 轻轻地将1mL的冰冷基底膜基质加入同等体积的冷培养基。通过上下移液慢慢混合，避免气泡。
      注:用100μL的溶液预涂12口孔培养板井的底部。这将最大限度地减少通过矩阵并成长为单层的细胞的数量。
   3. 在500μL的总体积中重新悬浮5 x 10⁴ HPrEC细胞在冰冷的（1:1）基底膜基质/培养介质混合物中。
   4. 每口井底部边缘的液干500 μL。
   5. 旋转板，将混合物均匀地分布在井的边缘。将板置于 37°C 的 CO₂培养箱中 30 分钟，使基质凝固。
   6. 一旦基质凝固，每口井用1mL的热培养基覆盖。请勿干扰地下室膜基质环。小心地瞄准移液器尖端，将培养基分到井的中心。
      注:将培养基培养基加热到37°C时，必须加热到凝固的基底膜基质。基底膜基质在暴露于冷/冷介质下时会失去完整性并溶解。
   7. 每2天补充一次介质。小心吸出 +500 μL 的废介质，并加入 500 μL 的新鲜温培养基。
   8. 使用倒置显微镜监测前球的形成和生长5~7天。
2. 前球的传递
   1. 通过仔细吸走尽可能多的介质，从基质中收获前球。避免干扰或拾取凝固基质的浮动部分。
   2. 加入1 mL的消生溶液（基底膜基质:以1:2的比例消解）。通过上下多次移液彻底混合。
   3. 在 37°C 的 CO₂培养箱中孵育培养板 30 分钟。
   4. 拍摄位于培养盘底部的球体图像，用于球体数计数和尺寸测量。
   5. 将球体混合物收集到 15 mL 管中。在 RT 将悬浮液在 500 x g下离心 5 分钟，以颗粒球体。吸气并丢弃上清液。
   6. 通过用500μL的0.05%热胰蛋白酶/EDTA消化，将悬浮液转移到1.5 mL微离心管中，将球体分散到单个细胞中。
   7. 在37°C的_CO2培养箱中孵育微离心管5分钟。
   8. 停止含有10%FBS的500μL热PBS的胰蛋白酶作用。通过1mL注射器将消化的球悬浮液与26G针5x分离成单个细胞。
   9. 将悬浮液在500 x g下离心5分钟，在RT处将细胞颗粒。吸出上清液并丢弃。
   10. 将细胞颗粒重新悬浮在1 mL的温暖培养培养基中，并通过40μm孔径尼龙细胞过滤器进行过滤。
   11. 将细胞悬浮液在500 x g下离心5分钟，在RT.吸气器下颗粒细胞并丢弃上清液。
   12. 在 3D 基底膜基质中将细胞颗粒悬浮在 1 mL 的冰冷 （1:1） 基底膜基质/培养基质和亚培养基质中，用于前层的第二通道。

4. 通过免疫荧光染色鉴定BrdU保留前列腺干细胞

1. 在前列腺干细胞2D成像中，生长出附着的前列腺球，然后是免疫荧光（IF）染色。
   1. 如步骤 3.2.1~3.2.3 所述，通过消沉消化收获前球。在500 x g的1.5 mL微离心管中将球体离心5分钟。丢弃上清液。
   2. 在 1 mL 的温暖培养介质中重新悬浮球体。
   3. 在37°C培养箱中，在200μL的培养基箱中，在8个井室中孵育每井50个前腔，以允许球体的附着和生长。
   4. 在第 2 天，吸出并丢弃培养基。用 200 μL 的 PBS 清洗出露的球体 5 分钟。
   5. 将球体固定在200 μL/孔的冷冷甲醇-20°C20分钟。
   6. 用 200 μL/井的 PBS 清洗球体 5 分钟，重复 2 倍。
   7. 在 RT 时，200 μL/2N HCl 的酸性洗涤球，30 分钟。
   8. 用 200 μL/井的 PBS 清洗球体 5 分钟，重复 3 倍。
   9. 在PBST中加入含有5%正常山羊血清的100μL阻断溶液（PBS与0.25%Triton X-100），并在RT孵育30分钟。
   10. 吸出阻断溶液，将含有2%正常山羊血清和原生小鼠抗人类BrdU抗体的100μL的PBST加入到每个井中，并在4°C的加湿盒中孵育过夜。
       注:小鼠IgG抗体用作阴性对照。
   11. 吸气并去除原抗体溶液。用 200 μL 的 PBS 清洗球体 5 分钟，重复 2 倍。
   12. 在每个井中加入含有2%正常山羊血清和二次山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体（1:500）的100μL的PBST，在黑暗中在RT孵育2小时。
   13. 吸气并去除二级抗体溶液。用 200 μL 的 PBS 清洗球体 5 分钟，重复 3 倍。
   14. 使用包含 DAPI 的含水安装介质的 ±25-40 μL 安装滑轨。
   15. 使用荧光显微镜和彩色数码相机获取彩色球体/细胞的图像。
2. 前列腺干细胞3D成像的前列腺球体的全装IF染色
   注:对于整个安装 IF 染色，使用 1.5 mL 微离心管处理前球。
   1. 如步骤 3.2.1~3.2.3 所述，通过消沉消化来收获前球。在500 x g的1.5 mL微离心管中将球体离心5分钟。吸气上清液并丢弃。
   2. 在RT处用1mL的4%甲醛重新悬浮和固定球体20分钟。将球体在500 x g下离心5分钟。吸气上清液并丢弃。
   3. 通过在 PBS 的 1 mL 中重新悬浮颗粒来洗净球体。将球体在500 x g下离心5分钟。吸气下清液并丢弃。重复 1x。
   4. 酸通过将颗粒重新悬浮在 2N HCl 的 1 mL 中 30 分钟来洗涤球体。
   5. 用1 mL的PBS清洗球体5分钟，在500 x g下离心5分钟。吸气上清液并丢弃。重复 3 次。
   6. 在PBST中重新悬浮±15~30球体，在100μL中含有5%正常山羊血清的阻断溶液（PBS含有0.25%Triton X-100），在RT孵育30分钟。
   7. 要去除堵塞溶液，将球体在500 x g下离心5分钟，然后丢弃上清液。
   8. 在含有2%正常山羊血清和原小鼠抗人BrdU抗体（1:200）的100μL的PBST中重新悬浮球体，并在4°C孵育过夜。
   9. 通过在 PBS 的 1 mL 中重新悬浮颗粒来洗净球体。将球体在500 x g下离心5分钟。吸气下清液并丢弃。重复 1x。
   10. 在含有2%正常山羊血清和继发山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体（1:1，000）的PBST100μL中重新悬浮球体，并在RT孵育2小时。
   11. 通过在 PBS 的 1 mL 中重新悬浮颗粒来洗净球体。将球体在500 x g下离心5分钟。吸气下清液并丢弃。重复 1x。
   12. 在含有 DAPI 的 30~50 μL 水安装介质中重新悬浮球体。为了防止球体扁平化，将它们分配成由 35 mm 无涂层培养皿（带盖玻璃底）制作的井中。然后在文化盘中添加一个盖玻片，覆盖井。
   13. 使用透射光倒置荧光共聚焦显微镜获取整个球体 Z 堆栈图像。使用具有自由格式绘图功能的成像软件将这些 Z 堆栈图像转换为 3D 图像。
       注:小鼠IgG抗体用作阴性对照。
3. 成对细胞分析（4天协议）
   1. 将 BrdU 标记的球体培养到第 5 天。
   2. 第1天:从基底膜基质中收获球体，具有1 mL的消沉消化。在1.5 mL微离心管中，按500 μL的温0.05%胰蛋白酶/EDTA分散到单个细胞中，如步骤3.2.1~3.2.11所述。
   3. 在1mL的温暖培养基中重新悬浮细胞。
   4. 在8个井室滑动中盘散的单个细胞（每口300~500个），在200μL/孔培养基中过夜培养，以便进行连接。
   5. 第2天:在培养基中改变200μL的2μM细胞沙星D培养基，并在37°C下孵育过夜，以允许一个细胞分裂在晚期元相暂停至失一相。
   6. 第3天-4天:吸气并丢弃介质。在-20°C下将200μL/孔冰冷甲醇中的细胞固定20分钟。按照步骤4.1.5~4.1.14中所述的BrdU免疫染色方案进行修复。
   7. 使用荧光显微镜拍摄配对细胞的图像。确保两个核之间的距离小于30μm。根据BrdU保留，确定成对的干细胞为正在对称或不对称细胞分裂。
      注:BrdU标签保留前列腺干细胞进行对称分裂，产生两个子干细胞，保留同等数量的BrdU，而经历不对称分裂的干细胞产生一个子干细胞保留所有BrdU和其他失去BrdU标签的女儿后代细胞。

5. 通过FACS分类分离CFSE标签保留前列腺干细胞

1. 第5天:收获CFSE标记的第5天，在3D培养的6孔培养板中生长，用2 mL的消膜（基底膜基质:以1:2的比例分离）取代介质。上下移液几次，彻底混合。
2. 在37°C的_CO2培养箱中孵育板30分钟，以消化基质。
3. 将球体混合物收集到15 mL离心管中。在RT处将球体在500 x g下离心5分钟。吸气下清液并丢弃。
4. 在500μL的温0.05%胰蛋白酶/EDTA中重新悬浮球形颗粒，并转移到1.5 mL微离心管中。
5. 在37°C下孵育_CO2培养箱球体5分钟，加入含有10%FBS的500μL热PBS。
6. 球体通过1mL注射器与26G针5x完全分离球成单个细胞。
7. 在RT.吸气器下，在500 x g下将细胞离心5分钟，然后丢弃上清液。
8. 在含有1μg/mL丙酸（PI）的热培养基中重新悬浮细胞，以染色死细胞。在 RT 孵育 1 分钟。
9. 在RT.吸气器下，在500 x g下将细胞离心5分钟，然后丢弃上清液。
10. 在1mL的温暖培养基中重新悬浮细胞。在RT.吸气器下，在500 x g下将细胞离心5分钟，然后丢弃上清液。
11. 在500μL的温暖培养基中重新悬浮细胞，并通过35μm孔径细胞滤网卡帽过滤，将细胞收集到5mL聚苯乙烯圆形底管中。
12. 使用单通道 FACS 分析仪执行胰蛋白酶分散的 CFSE 标记前皮球细胞的分析。
13. 门分段CFSEHi、CFSE^Med和CFSE^Lo细胞的亚群。使用负控和正控制进行浇注。
    注:与非保留细胞相比，FACS排序的CFSE标签保留前列腺干细胞（见Hu等人^13）可以通过绿色荧光显微镜及其更大的细胞大小来确认。这种较大的细胞大小是前列腺干细胞相对于祖细胞群的特性。这可能与其他组织类型不同。

结果

原发正常人前列腺上皮细胞被放入纤维素涂层培养皿中，细胞生长在二维培养中保持（图1a）。当转移到具有基底膜基质的3D培养中时，分化的上皮细胞慢慢消失。只有前列腺干细胞才能在无锚培养物中存活，并在5天内形成球形（图1b）。

在2D培养中前列腺上皮细胞的双重标记，随后在3D培养中形成球形，?...

讨论

使用多种干细胞表面标记的流式细胞测定是干细胞研究常用的方法，尽管缺乏特异性和选择性^1，5，6。虽然3D培养系统中的球形形成是从原发上皮细胞（包括HPrEC）中丰富稀有干细胞群的另一种有用方法，但产生的球体仍然是茎和祖细胞^2、3、4的异质混合物。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
1 mL tuberculin syringes	Bectin Dickinson	BD 309625
1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile
100 mm culture dishes	Corning/Falcon	353003
12-well culture plate	Corning/Falcon	353043
15 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352097
22 x 22 mm coverslips, sq	Corning	284522	For MatTek 35 mm culture dish
24 x 50 mm coverslips	Corning	2975245
26G x 1.5 inch hypodermic needle	Monoject	1188826112
2N HCl
35 mm culture dish with cover glass bottom	MatTek Corp	P35G-0-10-C	Glass bottom No. 0, uncoated, irradiated
40 µm pore nylon cell strainer	Corning	352340
5% CO2 culture incubator, 37 °C	Forma
50 mL centrifuge tubes	Corning/Falcon	352098
5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap	Corning	352235	35 µm nylon mesh
6-well culture plates	Corning	353046
8-well chamber slides	Millipore Sigma	PEZGS0816
Aqueous mounting medium containing DAPI	Vector Laboratories	H-1200	A nuclear fluorescent dye
Biological safety cabinet, Level 2 certified
BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine)	Sigma-Aldrich	B5002	1 mM stock solution in DMSO
Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf
Centrifuge for 15 mL tubes	Beckman Coulter		Allegra 6
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)	Thermo Fisher Scientific	C34554	5 mM stock solution in DMSO
cytochalasin D	Thermo Fisher Scientific	PHZ1063
Dispase 1U/mL	StemCell Technologies	07923
FACS CellSorter MoFlo XDP	Beckman Coulter	s
Far-Red pro-dye	Thermo Fisher	C34564	5 mM stock solution in DMSO
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	For coating 100 mm culture dishes
Fluorescent microscope with color digital camera	Carl Zeiss		Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11029
HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)	Lifeline Cell Technology	FC-0038	Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen
ice bucket and ice
Inverted microsope with digital camera
Matrigel, low growth factor, phenol-red free	Corning	356239
Methanol	Corning	A452-4
Mouse anti-BrdU antibody	Cell Signaling	5292S
Mouse IgG antibody (negative control)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Pipettors and tips, various sizes
PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)	Lifeline Cell Technology	LL-0041
Propidium Iodide (PI)	R & D Systems	5135/10	10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark
Serological pipets, various sizes
Software for sphere counting and size measurements
Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Water bath, 37 °C
z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope