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摘要

这项工作描述了一个半高通量协议，允许在一次一夜的运行中同时对80-100 C.elegans胚胎的胚胎发生进行3D延时成像。此外，还包括图像处理和可视化工具，以简化数据分析。这些方法与自定义报告菌株相结合，有助于详细监测胚胎生成。

摘要

在胚胎发育过程中，胚胎学是系统分析细胞命运规范和形态遗传事件的首要系统。一个挑战是胚胎生成在大约13小时的时间内动态展开;这个半天的时间尺度限制了可以成像的胚胎数量，限制了实验的范围。在这里，我们描述了一个半高通量协议，它允许在一次夜间运行中，以中等时间分辨率、从多达 14 个不同条件对 80-100 个胚胎进行同步 3D 延时成像。该协议非常简单，任何实验室都可以通过具有点访问能力的显微镜进行实施。该协议的效用通过用它来成像两个定制的菌株来演示荧光标记，这些荧光标记经过优化，以可视化细菌层规范和形态生成的关键方面。为了分析数据，构建了一个自定义程序，该程序在所有通道、z 步长和时间点中从更广泛的视野中裁剪单个胚胎，并将每个胚胎的序列保存到单独的 tiff 堆栈中。该程序包括用户友好的图形用户界面 （GUI），通过隔离、预处理和统一定向单个胚胎来简化数据处理，为可视化或自动分析做好准备。还提供了一个 ImageJ 宏，该宏将单个胚胎数据编译为多面板文件，在每个时间点显示每个胚胎的最大强度荧光投影和亮场图像。本文描述的协议和工具通过使用它们来描述胚胎发育的特征，在击倒40个先前描述的发育基因之后;此分析可视化了以前用的分着的发育表型，并揭示了新的表型。总之，这项工作详细介绍了半高通量成像方法，以及裁剪程序和 ImageJ 可视化工具，当与表达信息荧光标记的菌株结合使用时，可以大大加快分析实验胚胎发育。

引言

胚胎是机械细胞生物学的重要模型系统，分析细胞命运规范和形态遗传事件，推动胚胎发育1、2、3、4，5，6，7，8，9。 迄今为止，胚胎中细胞级事件和细胞命运规范的大部分特征都是通过相对高的时间分辨率一次进行成像实验（即每10-100s采集一次）表达的胚胎来实现的。荧光标记。尽管这种方法非常适合从秒到几十分钟的事件，但这种方法在技术上对较长过程的特征进行了限制，从小时到天的顺序。从第一次裂解到伸长结束的胚胎发育大约需要10小时。在这个时间尺度，半高通量的方法，将允许同时降低时间分辨率成像（即，在5-20分钟的时间间隔获得）更大的胚胎组，从不同的条件，将开辟一个新的实验范围;例如，进行系统的大规模筛选工作，并分析足够数量的胚胎，以便比较分子扰动的后果。

在这里，我们描述了一种半高通量方法，用于监测C.elegans胚胎的产生，该方法可在一次夜间运行中，在80-100个胚胎中同时进行3D延时成像，从多达14个不同的条件下进行发育。该协议易于实施，任何实验室都可以使用具有点访问功能的显微镜进行操作。此协议中的主要步骤如图1所示。简而言之，胚胎从表达荧光标记的幼体成人中解剖，并将年轻胚胎（2-8细胞阶段）转移到384孔板的孔中进行成像。在这种形式下，相对较小的井尺寸将胚胎漏斗到狭窄的区域，这有助于识别含有多个胚胎的场，以便进行延时成像。为了保持胚胎群的大致同步发育，解剖在冷冻介质中进行，板在冰上保存，这阻止了长达一小时的解剖时间窗口的重大发育。将板转移到显微镜上，胚胎在温度控制室中过夜，间隔20分钟，使用60倍油浸1.35 NA透镜，在2μm步数中收集整个z-范围。50个场，每个包含1-5个胚胎，在一个夜间运行成像。根据所需的实验，可以通过按比例减少成像场的数量来增加时间分辨率（例如，以 5-10 分钟间隔成像）。

有了这个协议，即使是一次通宵运行也能生成大量数据（分布在 50 个领域的 80-100 个胚胎），而大型实验在数据分析方面可能很快变得难以管理。为了便于处理、可视化和简化此数据的分析，构建了一个程序来裁剪和定向胚胎并执行预处理步骤（可选），以及一个用于编译数据以简化查看的 ImageJ 宏。这些程序可用于处理使用传统方法收集的图像，因为它们独立于成像方法，只需要单个亮场平面。第一个程序采用包含多个胚胎（GUI 选项或源代码embryoCrop.py）的 4D 场，或包含多个胚胎（screenCrop.py）的多个 4D 场，紧密裁剪胚胎，并在前后配置中定向它们。这些程序还为用户提供了执行背景减法、漂移校正和衰减校正的选项。生成的文件是统一的预处理，严格裁剪每个胚胎的tiff堆栈，可以修改为自动图像分析。为了简化查看每种条件的所有胚胎，编写了 ImageJ 宏（OpenandCombine_embsV2.ijm），该宏将给定条件中的所有胚胎组装到单个 tiff 堆栈中，并阵列显示景场图像和最大强度投影颜色（RGB）覆盖，并排，每个胚胎。在一对定制菌株中敲除40个先前描述的发育基因后，通过它们来描述胚胎发育的特征，这些基因得到了验证，这些基因表达荧光标记，这些标记经过优化，以可视化细菌层的关键方面规格和形态生成10，11。半高通量胚胎成像协议和图像处理工具共同作用于实现更高的样本数实验和旨在了解发育过程的大规模筛选工作。此外，这些菌株还将为检查分子扰动对胚胎生成的影响提供一种有效的方法。

研究方案

1. 为半高通量成像准备C. elegans胚胎

注:该协议的这一部分的目标是将半同步（2至8细胞阶段）的C.elegans胚胎（从合适的标记菌株（图2）解剖到玻璃底384孔板中进行成像。其他板格式也可以工作，但384孔板是首选，因为小井大小限制胚胎传播到相对较小的区域，这有利于识别含有多个胚胎的场进行延时成像。大致同步胚胎可确保捕获一个领域中每个胚胎的整个发育过程。

  1. 准备5⁄10 mL 0.1 mg/mL的盐酸四甲盐碱（TMHC）麻醉剂溶解在冰冷M9介质（0.45 M Na2HPO4+7H2O，0.11 M KH2PO4， 0.04 M NH4Cl） 期间使用解剖和成像。这种介质包括麻醉剂，以确保移动孵化的幼虫不会在早期发育阶段破坏胚胎的成像。
    注:如果使用裁剪和可视化工具分析使用标准甘草垫安装方法获得的数据，请跳到下面的第 3 节。
  2. 将制备溶液的70 μL加到玻璃底384孔板的单个孔中，每个孔有一口;避免板的外侧两行，以防止边缘效应。
    注:使用粘合 PCR 板箔覆盖周围井非常有用（参见图 1D所示），这可保留相邻井，以便将来进行实验，并便于在解剖显微镜下找到适当的孔。一旦溶液被异引，在整个解剖过程中将板和剩余的溶液保持在冰上。
  3. 产生口移器，将胚胎从凹陷滑梯（其中肉汁的母体被解剖）转移到井中。将毛细管移液器（25 μL 校准移液器）拉到火焰上并断裂以生成细锥形端（图 1D）。每个条件都需要一个移液器，以防止交叉污染;使用后丢弃移液管。
  4. 使用细钳子将10个肉汁成人在解剖范围内转移到150 μL的冰冷的TMHC溶液中，并为每个情况的凹陷幻灯片。使用钳子和手术刀，解剖蠕虫释放胚胎。
  5. 将拉毛细管移液器装入移液器随附的吸气器附件中，并将所有 2 到 8 细胞级胚胎转移到制备板的单个孔中（图 1D）。避免转移晚期胚胎和解剖碎片。在解剖范围内检查，如果存在胚胎聚集体，口腔上下移液或用移液尖敲打胚胎团块以分散。
    注:为了防止交叉污染，清洁解剖设备，并在两次之间移动时使用新鲜的口腔移液器。解剖之间将盘子存放在冰上。
  6. 一旦所有条件的蠕虫被解剖，胚胎被放置在适当的井中，在600 x g下旋转384孔板1分钟，以固定胚胎。
  7. 用乙醇浸泡的抹布擦拭板的底部，清除所有残留物，并将板放在配有板架的共聚焦显微镜上，置于温度控制的环境中。
    注:遵循的步骤详细介绍了使用实验室设置的方法;请修改采集条件，以适应实验需要和设备。此处，使用配备微透镜增强双 Nipkow 旋转盘、512 x 512 EM-CCD 摄像机、高精度自动 XY 级（指定分辨率 0.1 μm）和电动 z 轴控制（指定分辨率 0.1 μm）的共聚焦扫描仪盒。该系统保存在16°C的房间里，在隔夜成像期间将显微镜温度保持在21至23°C之间。
  8. 要识别具有合适胚胎的场，请使用 10x 0.4 NA 目标和合适的成像软件对每口井进行预扫描。最佳场将包含多个早期胚胎，该胚胎与其他胚胎处于同一焦点平面，理想情况下相邻胚胎之间的接触最小。标记适当区域的位置。
  9. 要选择成像场，请切换到 60x 目标，并在每次访问时调整焦平面以适当分割胚胎。每口井有1⁄4个场被成像，在14个井中共有50个场，每个场可以包含1到5个胚胎。总体而言，从每种条件下选择4至15个胚胎进行高分辨率成像。
    注:此步骤的一个关键变量是使用足够的机油;将油放在目标上，在每个井中的访问点，将油分散到所有井的表面，然后在选择油田之前向目标再涂上一滴油。
  10. 使用 60x 1.35 NA 目标对所选字段进行成像，以 2 μm 的间隔以 2 μm 的间隔获取 18 z 部分，每次 10 小时。使用胚芽层和形态生成报告菌株的成像条件如下:亮场，90%功率，25ms，增益20%;488 nm，100% 功率，200 ms，60% 增益;568 nm，45% 功率，150 ms，60% 增益。
  11. 成像完成后，在开始夜间成像后，通过执行低放大倍率（10x 0.4 NA 物镜）全井明场扫描[20~24 h]来评估胚胎杀伤力。

2. 胚胎杀伤性评分

  1. 使用运行后的10x扫描场，通过计算每口井的孵化蠕虫和未孵化胚胎来评估胚胎杀伤力和幼虫缺陷。
  2. 将未孵化的胚胎列为胚胎致命。从致命性计数中排除已逮捕的一至四细胞阶段胚胎，因为年轻的解剖胚胎有时无法完成蛋壳形成（如果美氏体 II 尚未完成），渗透性缺陷可能导致前两个期间的渗透并发症部门。
  3. 分数部分孵化或完全孵化的蠕虫与身体形态或行为缺陷，如倾倒或瘫痪，作为"异常幼虫"。

3. 自动裁剪 （图 3A）

注:该软件被安置在两个位置:（1） Zenodo拥有用户友好的软件12版本，不需要任何编程专业知识。（2） Github包含我们embryoCropUI.py的源代码，screenCrop.py软件13，这需要熟练使用 Python。有关下载和操作两个版本的程序的详细说明，请参阅下文。

  1. 使用胚胎裁剪UI可执行版本（用户友好版本）进行自动裁剪
    1. 要使用胚胎克罗维程序，首先从泽诺多（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）12下载程序。
      1. 下载该程序的 MacOS 或 Windows 格式版本（请注意，MacOS 版本需要 MacOS X10.11 或更高版本）。
      2. 下载说明文件（GUI_指令_zenodo_repoV2.docx），为测试和使用胚胎裁剪UI程序提供分步说明。
      3. 下载 test_files.zip 以测试程序在平台上是否正常运行（请参阅说明）。
    2. 下载后，解压缩并导航以查找胚胎裁剪UI 可执行文件 （...]胚胎裁剪UI_WINDOWS_胚胎克罗普UI_胚胎裁剪UI.exe）或 （...]胚胎克罗普 UI_MacOS_胚胎克罗普UI_胚胎克罗普.exe）。双击启动（或选择"打开"终端）并运行胚胎裁剪UI可执行文件。
    3. GUI 可执行文件一次裁剪一个 4D 视场。在左上角，选择打开的按钮以加载要裁剪的特定字段（多点）。如果裁剪具有多个维度（即 z、时间、通道）的 tiff 系列，则仅加载文件夹中系列中的第一个图像（每个文件夹一个 tiff 系列）。
    4. 加载图像后，指定以下信息:z-切片数、（Z）、时间点数 （T）、通道数 （C）、对应于 DIC 或亮场的通道（first=1、秒 =2 等）。
    5. 选择要在图像上运行的其他处理。该程序提供漂移校正、背景减法和衰减校正。
    6. 指定背景减法和衰减校正的参数，以指导 GUI 提示符中的处理工作。对于"背景减法"，定义最大要素大小以反映有意义的信号大小;不应将此要素大小视为背景，并且必须是奇数值。输入 0-1 的值以进行衰减校正。衰减校正值反映原始强度的百分比，该强度保持在被成像对象的最远深度。
      注:背景减法和衰减校正必须一起运行。
    7. 指定图像收集顺序（即通道-z-time （czt） 或 z 通道时间 （zct）。
    8. 根据正在使用的相机指定图像的每像素微米。
      注:如果像素大小未正确定义，则会出现图像裁剪不良。
    9. 选择左下角的"运行"。将在与未裁剪文件夹相同的路径中创建一个标记为"裁剪"的新子文件夹;裁剪后的版本将保存在此位置。根据文件大小，裁剪应在数秒到几分钟内完成。
  2. 使用screenCrop.py自动裁剪 （批处理版本替代上述胚胎作物GUI;仅限精通 Python 的用户)10,13
    1. 要使用screenCrop.py，Python 软件版本用于以批处理格式裁剪较大的数据集，从 Github 克隆或下载源代码（github.com/renatkh/embryo_crop.git）。
    2. 阅读有关配置适当虚拟环境的说明，并遵循所述的文件命名系统;两者都在 Github 存储库中的README文件中详细说明:https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md。
    3. 一旦环境变量和命名约定得到正确建立，打开parameters.py，screenCrop.py选择编辑器。
    4. 要在不接触源代码的情况下修改可调整参数，请编辑parameters.py文件。
      注:还可以直接更改screenCrop.py标头中的参数。
      1. 如果使用parameters.py配置文件，请将use_配置设置更改为 True。如果在screenCrop.py中使用直接编辑，请将use_配置设置保留为 False。
      2. 在parameters.py文件中找到以下信息，并进行修改以适应所需的成像参数和文件结构:
        1. loadFolder（第9行）:更改为存储文件的驱动器（例如，Z:/、D://等）
        2. 日期（第 7 行）:更改为包含映像会话文件的文件夹。这在 CSV 跟踪文件中称为"实验文件夹名称"（请参阅说明）。
        3. 跟踪文件（第 11 行）:更改为存储实验信息的 CSV 文件的路径。
        4. z（行 13）:设置为 z 平面数。
        5. nT（第14行）:设置为时间点数。
        6. nWells（第19行）:设置为使用的井数。
        7. 点访问（第 20 行）:设置为最大点访问数（每口）。
        8. 在第 10 行中查找当前由"CV1000/"占用的位置，并输入文件路径中使用的外部文件夹。为避免出现问题，请使用以下约定:"XXXXXXX/"。
        9. 在第 12 行中，输入用于存储裁剪数据的纵横比数据的有效文件路径。
        10. 在第 15、16、17 和 18 行中输入True/False，用于图像是否经过以下处理:
          1. 输入真或假，用于第 15 行的漂移校正。
          2. 输入真或假，用于第 16 行的背景减法。特征大小必须根据不同的标记应变和像素大小进行经验确定。在此处的配置中，特征大小定义为 Germ-Layer 应变的 41 和形态发生应变的 201。背景减法必须与衰减校正同时进行。
          3. 输入真或假，用于第 17 行的衰减校正。
          4. 输入 True 或 False，用于第 18 行的前后旋转。
    5. 完成所有更改后，即可开始裁剪。为此，请切换到screenCrop.py并在工具栏中选择播放图标，在下拉菜单中选择"以"运行为> Python 运行"。
    6. 由于大型数据集（50 点访问 18 z 步长、3 个通道、31 个时间点）可能需要几个小时才能完成，因此可在控制台窗口中跟踪裁剪进度。裁剪完成后，在保存之前，一个小窗口将显示裁剪图像的预览。对于每个图像，有 3 个选项:
      1. 保存:如果图像被正确裁剪且没有切断感兴趣的区域，则按空格键保存图像。
      2. X:如果图像似乎已切断感兴趣区域，请按X;图像将在名称前面保存一个 X，以将其与其他图像分开。
      3. 删除:如果图像未正确裁剪或胚胎不令人满意，请按D删除裁剪的图像。
        注: 图像将保存到"加载文件夹"中名为"裁剪"的子文件夹（在程序的第 9 行中定义）。

4. 可视化 （图 4）

注: OpenandCombine_embsV2.ijm10，12是一个 ImageJ 宏，它将从特定应变和条件的所有图像中构造一个易于查看的 tiff 文件。需要安装FIJI/ImageJ14，15。 此宏根据我们的文件结构运行;将需要对其进行修改以与其他文件结构一起工作。有关正确文件结构和重要注意事项的详细说明，请参阅 Zenodo 存储库上的GUI_指令_zenodo_repoV2.docx文件的末尾。在映像之前，请完整阅读这些说明，以正确命名和构造文件，以便最好地与该宏接口。作为参考，我们的文件位置结构如下所示:
Z:\裁剪\目标\应变\Emb_目标_Emb_15数字唯一标识符_W_#F_t_#_Z_#_C_.tif
即 Z:\裁剪\EMBD0001_GLS_EMB1_EMBD0001_Emb1_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

  1. 从泽诺多（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）下载Openand 合并_embsV2和GUI_指令_zenodo_repoV2.docx。
  2. 准备以下信息:
    -图像文件夹的存储位置（裁剪后）。
    -要处理的特定条件（即 EMBD0002）的图像文件夹名称）。这在上述示例中称为"目标"
    -一个 15 位字母数字唯一标识符，特定于给定的隔夜实验 — 此标识符是数据采集文件夹名称（即 20140402T140154），唯一标识符嵌入到单个 tiff 文件名 （EMBD0002_Emb1}} 中20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1）当天拍摄的每个胚胎。宏使用此标识符检查在同一日期获取的胚胎，并可以将具有单独日期的重复条件组装到单独的 ImageJ 文件中。
  3. 打开 ImageJ，并将宏文件Open 和组合_embsV2.ijm拖放到 ImageJ 栏，或直接打开宏。
  4. 打开宏后，找到第 3 行和第 4 行。根据以下步骤输入（第 4.2 节）中收集的信息:
    1. 在第 3 行 （RNAL） 中，输入要处理的图像的目标名称。在以下结构新阵列（"XXXXXXXX/"）中输入每个目标;包括报价。要同时运行多个条件，请用逗号分隔，并将所有目标名称保留在括号内（即newArray（"EMBD00000/"，"EMBD0001/"，"EMBD0002 /"）。
    2. 在第 4 行（日期）中，在引号中输入 15 位字母数字唯一标识符，例如 newArray（"20140402T140154"）。
  5. 按宏窗口左下角的"运行"。将出现一个窗口，该窗口将启动一个提示，以导航到包含裁剪的图像文件夹的外部文件夹（在 4.4.1 中指定）。
  6. 一旦选中，将显示另一个窗口，这将允许规范成像参数。
    1. 输入通道数、Z 切片数、标记已编译图像所用文本的字体大小以及每个通道的颜色。
    2. 检查所有通道中的开/关自动对比度。
  7. 指定所有参数后，单击窗口底部的"确定"。 复合文件将开始组装;这将需要几分钟，每个条件，才能完成。
  8. 完成后，根据需要查看未打开的文件。可以关闭这些文件而不保存，因为宏已经将文件保存到新创建的文件夹，该文件夹以下列方式命名:外部文件夹名称（在第 4.5 节的提示符中指定） = "-fiji 处理-输出"（即 Z:*裁剪-fiji-处理输出_EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif）。

结果

在描述分子扰动对C.elegans胚胎发育的影响时，一个重大挑战是，胚胎从第一次裂解到20°16的伸长结束大约需要10小时。一种半高通量方法，其中可以同时成像大量胚胎，这种方法对于此时间尺度的事件非常有用，因为它允许同时对多个条件进行成像，并为每个条件提供足够的组合大小，从而实现定量分析 （图 1A.

讨论

这项工作描述了一套工具和方法，开发，使更大规模的努力，以分析基因在胚胎发育在C.elegans的功能。我们的半高通量方法允许在一次实验中以 20 分钟分辨率对胚胎发育进行 3D 延时成像，用于 80-100 个胚胎。虽然此协议可以适用于任何所需的标记菌株，但此工作演示了使用两种定制菌株来监测胚胎生成过程中事件的方法的潜力:（1） 胚层报告菌株，其中组织特定启动子驱动荧光组蛋白的表...

披露声明

没有

致谢

S.D.O.得到了美国国家普通医学研究所赞助，加州大学圣地亚哥分校机构研究和学术职业发展奖（NIH/IRACDA K12 GM068524）。A.D.和K.O.得到了路德维希癌症研究所的支持，该研究所也为他们提供了用于支持这项工作的研究资金。我们感谢安德鲁·奇斯霍尔姆在这个项目的早期阶段的建议，罗纳德·比格斯在最初方法开发阶段后为这个项目做出了贡献，戴夫·詹金斯和安迪·肖为小分子发现提供支持和访问组的高含量成像系统。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Aspirator Tube AssemblyDrummond Scientific2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager SoftwareYokogawa Electric CorpIncluded with CV1000
Conical Tube (15 mL)USA Scientific1475-0501
CV1000 MicroscopeYokogawa Electric CorpCV1000
Depression slide (3-well)Erie Scientific1520-006
Dissection MicroscopeNikonSMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJIOpen Sourcehttps://imagej.net/Fiji
M9 BufferLab Preparedhttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)USA Scientific1615-5500
Microseal F-foil SealBio-RadMSF1001
NGM PlatesLab Preparedhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass BottomGreiner Bio-One781855
Tetramisole HydrochlorideSigma AldirchT1512-10G
Tweezers, Dumont #3Electron Microscopy Sciences0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)Olympus1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)Olympus1-U2B832

参考文献

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