用于生成多细胞三维球体的 CD 实验室平台

摘要

我们提出了一种运动动力离心微流体装置，可以培养细胞球体。使用该装置，单细胞或多种细胞类型的球体在高重力条件下可以很容易地共同培养。

摘要

三维球体细胞培养法在细胞实验中可以获得更有用的结果，因为它比二维细胞培养更好的模拟活体细胞微环境。在这项研究中，我们制造了一个电机驱动的实验室在CD（光盘）平台，称为离心微流体基球体（CMS）培养系统，以创建三维（3D）细胞球体实现高离心力。此设备可改变旋转速度，生成从 1 x g到 521 x g的重力条件。CMS系统直径6厘米，微井100400μm，由计算机数控机在聚碳酸酯模具中用聚二甲基硅氧烷成型。CMS 系统通道入口的屏障墙使用离心力将细胞均匀地分布到芯片内。在通道的末端，有一个滑动区域，允许细胞进入微井。作为证明，球体是由人类脂肪衍生干细胞和人类肺成纤维细胞在高重力条件下使用该系统的单一培养和共同培养产生的。CMS系统使用一个简单的操作方案来生产同心、Janus 和三明治等不同结构的共栽球体。CMS系统将可用于细胞生物学和组织工程研究，需要单细胞或多种细胞类型的球体和有机体培养。

引言

与二维（2D）细胞培养（例如，常规培养皿细胞培养）相比，使用三维（3D）球形细胞培养法在体内微环境中模拟生物更容易，从而产生更生理上逼真的实验结果¹.目前可用的球形形成方法包括悬滴^技术2、液体覆盖^技术3、卡博基甲基纤维素^技术4、磁力微流体^技术5、使用生物反应^器6.尽管每种方法都有其自身的优点，但还需要进一步提高可重复性、生产率和生成共培养球体。例如，虽然基于磁力的微流体^技术5相对便宜，但必须仔细考虑强磁场对活细胞的影响。球体培养的好处，特别是在研究中细胞分化和增殖，已经报告在几项研究7，8，9。

离心微流体系统，也称为CD实验室（光盘），可用于轻松控制内部流体和利用基板的旋转，因此已用于生物医学应用，如免疫^测定10，用于检测生化标记物¹¹的色度测定、核酸扩增 （PCR） 测定、自动血液分析系统¹²和一体离心微流体装置^13。控制流体的驱动力是旋转产生的向心力。此外，只需在这个单 CD 平台中，即可完成混合、val 和样品拆分的多种功能。然而，与上述生化分析方法相比，将CD平台应用于培养细胞，特别是球^体14的试验较少。

在这项研究中，通过单一培养或人类脂肪衍生干细胞（hASC）和人肺成纤维细胞（MRC-5）的单培养或共培养，展示了离心微流体基球体（CMS）系统的性能。本文详细介绍了我们小组的研究^方法15。因此，在CD上的球形培养实验室平台可以很容易地复制。介绍了一种CMS生成系统，包括CMS培养芯片、芯片支架、直流电机、电机安装和旋转平台。电机支座为 3D 打印，印有丙烯酰胺苯乙烯 （ABS）。芯片架和旋转平台是数控（计算机数控）与PC（聚碳酸酯）一起加工的。通过编码基于脉冲宽度调制的 PID（比例积分-衍生物）算法，电机的转速从 200 rpm 控制在 200 到 4，500 rpm。其尺寸为 100 mm x 100 mm x 150 mm，重量为 860 g，易于操作。使用CMS系统，可以在1 x g到521 x g的各种重力条件下生成球体，因此在高重力下细胞分化促进的研究可以从2D^{细胞16、17}扩展到3D。球体。各类细胞的共生也是有效模拟体内环境的^{关键技术。}CMS 系统可以轻松生成单一培养球体，以及各种结构类型（例如同心、Janus 和三明治）的共培养球体。CMS系统不仅可用于简单的球形研究，还可用于3D有机体研究，以考虑人体器官结构。

研究方案

1. 离心微流体基球体 （CMS） 培养芯片制造

1. 通过数控加工为 CMS 培养芯片的顶层和底层制作 PC 模具。图1给出了芯片的详细尺寸。
2. 以 10:1 （w/w） 的比例将 PDMS 底座和 PDMS 固化剂混合 5 分钟，并在干燥器中放置 1 小时以去除气泡。
3. 将 PDMS 混合物倒入 CMS 培养芯片的模具后，再去除气泡 1 小时，并在 80°C 的热室中固化 2 小时。
4. 将它们放入真空等离子清洗器中，表面朝上粘结，并将其暴露在空气辅助等离子体中，功率为 18 W，为 30 s。
5. 将 CMS 培养芯片的两层粘结，并将其置于 80°C 的加热室中 30 分钟，以增加粘附强度。
6. 在 121 °C 和 15 psi 的高压灭菌器中对 CMS 培养芯片进行灭菌。

2. 细胞制备

1. 在水浴36.5°C下将含有5×10 5+1+1+1+16^hASCs或MRC-5s细胞的1 mL解冻2分钟。
2. 将 1 mL 的 Dulbeco 改性鹰介质 （DMEM） 添加到小瓶中，并与 1，000 μL 移液器轻轻混合。
3. 使用移液器将 15 mL 的预加热至 36.5 °C 的培养皿放入直径为 150 mm 的培养皿中，然后从小瓶中加入细胞。
4. 1 天后，吸出 DMEM 并更换为 15 mL 的新鲜 DMEM。随后，每 2 或 3 天更改一次介质。
5. 要从培养皿中分离细胞，向培养皿中加入4 mL的胰蛋白酶，并将其置于36.5°C的培养箱中，在5%的CO₂中放置4分钟。

3. 单一栽培球形形成

1. 将 2.5 mL 的 4% （w/v） 普乐 F-127 溶液放入 CMS 培养芯片（图 2A）的进口孔中，同时以 500-1，000 rpm 转速旋转芯片，然后使用 CMS 系统（图 2B） 以 4，000 rpm 旋转芯片 3 分钟。
   注: 在芯片旋转时，软体涂层可防止细胞附着到入口。确保空气没有滞留在微井中。
2. 在5%CO₂的36.5°C下，在36.5°C中孵育充满普鲁尼克溶液的CMS培养芯片。
3. 取出绒毛溶液，用DMEM冲洗剩余的绒面溶液，在干净的工作台上干燥12小时。
4. 将 2.5 mL 的 DMEM 添加到 CMS 培养芯片中，以 ±4，000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟，以预润芯片内部。
5. 停止旋转并拉出 100 μL 的 DMEM，为注入细胞悬浮液腾出空间。
6. 通过移液，通过移液 3~5x 进行移液，均匀分配细胞，加入包含 5 × 10⁵ hASC 或 8× 10⁵ MRC-5s 的细胞悬浮液 100 μL。
7. 以 3，000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟，通过离心力捕获每个微井中的细胞。
   注: 转速过高可能导致细胞通过溶液弹出孔逃逸。
8. 在36.5°C、>95%湿度和5%CO2下在培养箱中培养细胞3天，在1，000~2，000rpm下旋转。每天改变文化媒介。

4. 共栽球形形成

1. 同心球形形成
   1. 添加第一个单元，2.5 × 10⁵ hASC，并在 3，000 rpm 转速下旋转芯片。3分钟后，加入第二个细胞，4×10⁵ MRC-5s，在3000rpm转速下旋转芯片3分钟。通过移液共注入100μL的细胞悬浮液。注入细胞时，将转速调至 500-1，000 rpm。
   2. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO₂下，在 1，000~2，000 rpm 转速下旋转培养培养培养培养箱中的细胞。同心球体在 24 小时内创建。对于长期文化，每天改变文化媒介。
2. 贾努斯球形形成
   1. 在芯片以 500~1，000 rpm 转速旋转时，通过移液添加包含第一个细胞的 100 μL 电池悬浮液，2.5 × 10⁵ hASC。然后，以 3，000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
   2. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO₂下孵育芯片，在 1，000~2，000 rpm 转速下旋转 3 小时。
   3. 在芯片以 500~1，000 rpm 转速旋转时，通过移液添加包含第二组细胞的 100 μL 细胞悬浮液，4 × 10⁵ MRC-5s。然后，以 3，000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
   4. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO₂下，在 1，000~2，000 rpm 下旋转培养培养培养培养箱中的细胞。Janus 球体在 24 小时内创建。对于长期文化，每天改变文化媒介。
3. 三明治球形形成
   1. 在芯片以 500~1，000 rpm 转速旋转时，通过移液添加包含第一个细胞的 1.5 × 10⁵ hASC 的 100 μL 细胞悬浮液。然后，以 3，000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
   2. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO₂下孵育芯片，在 1，000~2，000 rpm 转速下旋转 3 小时。
   3. 当芯片在 500~1，000 rpm 转速下旋转时，通过移液添加包含第二个细胞的 100 μL 细胞悬浮液，3 × 10⁵ MRC-5s。然后，以 3，000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
   4. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO₂下孵育芯片，在 1，000~2，000 rpm 转速下旋转 3 小时。
   5. 在芯片以 500~1，000 rpm 转速旋转时，通过移液添加包含第三个细胞的 1.5 × 10⁵ hASC 的 100 μL 细胞悬浮液。然后，以 3，000 rpm 转速旋转芯片 3 分钟。
   6. 在 36.5 °C、>95% 湿度和 5% CO₂下，在 1，000~2，000 rpm 转速下旋转培养培养培养培养箱中的细胞。三明治球体在12小时内产生。对于长期文化，每天改变文化媒介。

5. 细胞染色

1. 将细胞荧光染料加热至室温（20°C）。
2. 每瓶加入20μL无水二甲基硫氧化物（DMSO），以产生1 mM溶液。
3. 使用 DMEM 将荧光稀释至 1 μM 的最终工作浓度。
4. 将荧光添加到细胞悬浮液中，并使用移液器轻轻重新悬浮。
5. 在36.5°C下孵育20分钟，湿度大于95%，CO₂为5%。

结果

直径为6厘米的CMS培养芯片（图2）按照上述方案成功制造。首先，芯片与顶层和底层分开，然后通过等离子体粘接粘合在一起。通过分离芯片，可以轻松收集生成的球体。CMS 培养芯片的通道包括入口端口和中央、滑动和微井区域（图 3）。细胞、介质和压孔溶液通过直径为 5 mm 的入口孔注入。注射的细胞通过在入口端口区域中重新悬浮3~5倍均匀分布。?...

讨论

CMS 是一个封闭的系统，所有注入的细胞进入微井时无浪费，使其比传统的基于微井的球形生成方法更高效、更经济。在 CMS 系统中，介质每 12~24 小时通过一个吸孔进行更换，该吸孔设计用于移除芯片中的介质（图 3A）。在介质吸入过程中，由于介质与微井壁之间的表面张力，几乎没有任何介质从微井内部逸出。用户可以通过用手指在芯片的微井区域附近按压，轻松移除被困...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021