人类粪便标本中弯曲杆菌Jejuni在运输介质中确定检测和生存极限的培养方法

摘要

虽然弯曲杆菌的粪便培养不精确，但它仍然被认为是识别的黄金标准。介绍了确定人类粪便中C.jejuni运输介质检测和生存极限的方法，并与一种精度更高的新免疫测定进行了比较。

摘要

从人类粪便诊断弯曲杆菌为基础的肠道疾病的文化需要几天的时间，等待，征税医生和病人的坚毅。一种文化也容易产生假阴性结果，因为在标本处理过程中随机丧失生存能力，其他粪便菌群的过度生长，以及传统媒体上几种致病性弯曲杆菌物种的生长不良。这些问题会混淆患者治疗的临床决策，并限制领域回答有关弯曲杆菌生长和感染的基本问题。我们描述了一个程序，估计细菌数量的下限，可以检测到的培养物和量化C.jejuni在用于运输这种脆弱生物的介质中生存的方法。了解此信息后，就可以为诊断测试设置临床相关的检测阈值，并解决未研究的问题:非症状殖民化是否普遍，是否与其他肠道病原体共同感染是常见的，或者如果细菌负荷与症状或严重的后遗症相关。该研究还包括测试1，552个潜在采集的患者腹泻粪便标本，这些标本最初按传统培养分类，并通过新的酶免疫测定进一步测试。然后，通过四种分子方法筛选阳性和分片标本，以分配真阳性或真实阴性状态。这5种非培养方法对所有48种阳性和分片标本进行了完全的一致，而该培养物的识别错误为14（28%）。被培养者错误识别的样本包括13个假阴性和1个假阳性样本。此基本协议可用于多个弯曲杆菌，并将允许确定在人类中产生肠胃炎症状的弯曲杆菌的数量，并更新患病率。

引言

美国疾病控制和预防中心（CDC）最近公布的食源性疾病主动监测网络（FoodNet）监测计划报告2018年9723例实验室诊断弯曲杆菌感染病例^1.这意味着弯曲杆菌病例报告比 2015-2017 1 年增加了^12%。在全球范围内，弯曲杆菌是最常见的细菌肠道感染^2。然而，每年发生的基于弯曲杆菌的肠道疾病的数量被怀疑少报^3。这种低估是可以预测的，因为大多数患者只能恢复中度不适，没有治疗。然而，对于症状较重或有较高严重疾病风险的患者，以及寻求医疗护理的患者，粪便培养是评估弯曲杆菌是否是导致其苦恼的病原体的最常见方法^。

对于弯曲杆菌来说，凳子文化尤其麻烦。最常见的致病性有机体，C.jejuni，C.大肠杆菌，C.上升，和C.拉里，是微航空嗜血^5。这意味着细菌一旦暴露在空气中，就会以随机的、未知的速度死亡。因此，标本采集与培养设置之间的时间成为不受控制的变量，无法通过培养来检测可行的弯曲杆菌。

对于粪便标本的直接培养，弯曲杆菌的缓慢生长也是一个问题。弯曲杆菌菌落非常小，即使在48小时的孵育后，也很容易被粪便基质中的相互竞争的生物覆盖。含有抗生素的板，大多数菌株的C.jejuni和C.大肠杆菌是耐药广泛使用，因为抗生素抑制生长许多（但不是全部）竞争的粪便细菌，允许更好的可视化弯曲杆菌菌落^6。然而，其他弯曲杆菌物种，如C.拉里和C.上升状体对其中一些抗生素敏感，要么生长不良，要么根本不生长。这导致这些对抗生素敏感的物种⁷的弯曲杆菌感染报告不足。

有第三个原因，为什么弯曲杆菌的文化可能是不准确的。细菌，当压力，可能仍然可行，但可以成为"不可培养的^"8。根据定义，这意味着培养不会检测样品中的细菌。发生的频率尚不清楚^8。

鉴于这些潜在的文化问题，我们使用了多种比较参考方法，使错误的区域性结果不会使单个比较器测定结果显得不准确^。之所以选择培养方法（如弯曲杆菌-选择性板、输送介质、气体产生小袋），是因为它们在粪便^{标本培养的}临床实验室中广泛使用。

这里描述的培养协议是因为人们所知，人类粪便中文化所能检测到的弯曲杆菌jejuni数量最低。虽然已公布对家禽粪便¹¹中存在菌群形成单位（CFU）的估计，但这些结果不能等同于人类粪便，因为弯曲杆菌是鸡的共性，不会引起腹泻。需要这些基本信息来确定将对人类产生肠胃炎症状的弯曲杆菌的数量，并比较菌株或物种之间的毒性。

研究方案

1. 人工人类粪便标本中弯曲杆菌的枚举

注:所有步骤均使用无菌技术和材料在经过消毒的层流安全罩内的一次性保护片上执行。

注意:活弯曲杆菌具有传染性，可引起疾病，包括腹泻。每当处理细菌时，都戴上手套、实验室外套和安全眼镜。不要嘴移液。处理在适当的生物危害容器中接触细菌的所有材料。

1. 细菌种群培养的生长
   1. 根据制造商的说明，将C.jejuni（ATCC-33560）或大肠杆菌（ATCC 33559）（材料表）的菌株作为干燥或冷冻培养物，并补充或解冻细菌。 将再水化的细菌划到弯曲杆菌上 -特定的加盘，以启动培养。在37°C下将板48小时孵育在含有微氧大气气体产生小袋的厌氧罐中。
   2. 第二天，制备100 mL脑心输液（BHI）生长汤，含有0.5%的胰蛋白酶、0.5%蛋白酶肽、0.0125%的苯丙酸钠和0.0125%的硫酸钠。
   3. 通过松散地覆盖烧瓶并将其放入厌氧罐中，用小袋预减BHI汤，从而产生微航空环境。允许肉汤在37°C下过夜预减。类似地，在步骤1.1.10和1.2.2中预减少用于菌落的弯曲杆菌-特定板计数。
   4. 由于弯曲杆菌对空气很敏感，因此在接种肉汤之前收集所有材料，在处理培养物时不要乱七八达。准备接种时，将胎儿牛血清（FBS）添加到预减少的肉汤中，达到总体积的4%。保留 1 mL 的预降低肉汤，作为 600 nm （OD_600）光学密度测量的空白。
   5. 取出含有FBS的预减少肉汤3 mL，并使用肉汤刮掉含有弯曲杆菌培养剂的起始板。用消毒回路轻轻刮板，然后将细菌浆料转移到无菌管中。
   6. 用大约3 mL的细菌浆料对100 mL的预减少肉汤进行接种，并在含有气体产生袋的厌氧罐中以115 rpm的温和摇动在37°C下孵育。
   7. 以OD₆₀₀的浊度来监测细菌的光谱光度生长。使用保留的肉汤作为空白。如果打开厌氧罐，更换产生气体的小袋。
   8. 在 48~72 h 或 OD₆₀₀值达到 ±0.4 之前停止肉汤孵育。
      注:此 OD₆₀₀通常等同于 10⁷到 10⁸ CFU/mL。有关典型结果，请参阅表 1。
   9. 为了在纯库存培养中建立细菌数量，在900μL稀释缓冲液（材料表）中，对100μL的肉汤进行8个10倍稀释系列。首次稀释时，将 100 μL 的肉汤取出后，将烧瓶退回到带新鲜气体产生小袋的厌氧罐中，等待在尖峰粪池中使用。
   10. 使用无菌电镀珠将^10-5至^10-7稀释液的100 μL从步骤1.1.3开始，扩散至重复的预降低弯曲杆菌- 特异性板。使用稀释标签板，将其放入带有气体生成小袋的第二个厌氧罐中，并在 37 °C 孵育 48~72 小时。
       注:有关稀释方案和殖民地照片，参见图 1和图 2。
   11. 生长后，选择30~300个菌落的盘数。使用公式 1 确定库存汤培养的 CFU/mL计数:
       
       库存中的 CFU/mL = 所选（重复）分析板上的菌落平均 = （mL 镀层 x 板的稀释） [方程 1]
       
2. 精心设计的临床粪便标本的制备与枚举
   1. 在步骤 1.1.10 中准备分析计数的板后，立即从股票汤和弯曲杆菌-负粪池 （NFP） 中制备 10 个连续 2 倍稀释液，制作第二组股票汤稀释。例如，通过将等量的肉汤和 NFP（例如，每个肉汤和 NFP）混合，准备第一次稀释，并通过将指定的肉汤和 NFP 混合物的指定体积转移到具有同等指定体积 NFP 的管中进行后续稀释。在粪便池中加入一个不含弯曲杆菌的汤控制板，以帮助识别非弯曲杆菌菌落。
      1. 使NFP从去识别，腹泻患者监测标本或健康的供体大便，以前测试，发现是弯曲杆菌- 阴性的方法，如弯曲杆菌酶免疫测定和16S rRNA qPCR。
   2. 在重复的预减少弯曲杆菌 - 特异性加盘上，每个弯曲杆菌/凳子稀释的 T 条纹 10 μL。将板放在厌氧罐中，用产生气体的包，在37°C孵育48~2小时。
   3. 目视地检查条纹板的殖民地，类似于那些来自纯弯曲杆菌培养物的菌落。
      注: 第三象限通常是找到这些象限的地方。有关稀释方案和菌落大小、颜色和形态的图像，请参阅图 1和图 2。
   4. 选择多个弯曲杆菌- 像菌落和格拉姆染色。使用带有油浸透镜的显微镜，检查一个细条纹区域，以检测克阴性弯曲、螺旋或雪茄形状的小细菌。
      注:弯曲杆菌是克拉姆阴性，需要基本fuchsin作为反面（而不是典型的沙夫拉宁）被准确可视化。可以看到经典的鸥翼细菌，但不是要求。有关代表性显微图，请参阅图 2。
   5. 如果特定稀释处的重复板中的任何一个存在 1 个或更多弯曲杆菌菌落，则认为稀释粪便培养为正。
   6. 考虑最后一个稀释，其中包含一个可见的弯曲杆菌- 像克阴性菌群的文化检测极限。使用公式 2计算精心设计的临床粪便标本中正稀释的 CFU/mL:
      
      粪便样本中的 CFU/mL = 分析 CFU/mL = 具有最后正聚落的稀释[方程 2]
      
      注: 有关典型结果，请参阅表 2。

2. 储存在运输介质中的弯曲杆菌的生存能力测定

1. 将 1 mL的弯曲杆菌培养（步骤 1.1.8） 与 1 mL 的 NFP 混合，并在 NFP 中制备 10 个重复的双倍串行稀释剂。进一步稀释每个稀释在Cary-Blair介质中额外稀释1:4，就像运输介质中制备的临床标本被处理一样。
2. 将 20 个稀释管和负控制储存在卡里-布莱尔介质中，在 2+8 °C 的 96 小时盖管中，并计算在 0 和每 24 小时发生的每次稀释的菌落。对于菌落计数，对肉汤进行取样:粪管，并设置粪便培养，以重复计算每个稀释的菌落计数。
3. 每天板10 μL部分的排便在弯曲杆菌 - 选择性加和孵育在37 °C48小时，如上文所述的步骤1.1.9×1.2.7。
4. 如上文所述（步骤1.1.9~1.11）对原始细菌库存（从步骤1.1.8起或新鲜生长的肉汤）进行同步分析板计数。计算原始细菌储存的CFU/mL（公式1），计算运输介质粪便样本中的细菌浓度及其稀释度（公式2）。

3. 用于验证文化结果的非文化检测

1. 使用酶免疫测定（EIA），给予最小的假阳性结果^12，并根据包装插入说明执行验证培养结果。
2. 使用分子检测，可以检测16S rRNA基因或其他基因的广泛范围弯曲杆菌物种^13。确认分子测定与C.upsaliensis或C.lari等在标准含抗生素的agar¹⁴上生长不良的物种有反应。按照制造商的说明从粪便样本中提取DNA并进行测试。
   注:16S安培蛋白的双向DNA测序可用于确认正样中弯曲杆菌的种类。物种特定的PCR（参见目标基因表3）也可用于识别存在于分体或阳性标本¹⁵中的物种。

结果

在相互竞争的粪便菌群中识别弯曲杆菌菌落需要敏锐的视力和相当大的判断力。虽然估计来自病人的标本含有10⁶⁺¹⁰⁹ CFU/mL 16，17，但研究出由培养者探测到的最小菌落数量。然而，患者样本不能定量使用，因为没有独立的方法来建立准确的细菌数量。为了克服这一限制，使用一种细菌库存同时进行两次测量。一项试验用于从粪便基质中库存细菌的序列稀释对弯曲杆菌菌落进行目视检测，模拟临床标本;另一种用于分析，以量化用于尖峰的细菌储存培养物中的CFU/mL（图2A）。

不会定义弯曲杆菌的检测阈值。这是可以预料的，因为每个粪便基质是复杂和独特的，细菌的生长是可变的。成功的一个关键参数是确定竞争粪便菌群之间的精确大小菌落。图2C和图2D显示了尖头培养的代表性板。不添加弯曲杆菌的负控制板对于帮助识别其他粪便菌群非常重要。Gram染色许多候选者也训练眼睛，以区分正确的光泽菌落和中间粉红色的fuchsin染色克阴性细菌，并确认细菌在选定的菌落的形态（图2B）。使用5个C.jejuni和2个C.大肠杆菌汤进行了7个独立实验，并给予了重叠的阈值，范围从0.3×5 x 10⁶ CFU/mL跨越。有关典型数据，请参阅表 2。检测限值平均为2 x 10⁶ C. Jejuni和1.2 x 10⁶ CFU/mL的C.大肠杆菌。这表明，培养物可能检测出#1⁄2 x 10⁶C. jejuni或C.大肠杆菌每克粪便标本的标准抗生素含弯曲杆菌- 特异性琼脂使用许多临床实验室。有多个具有不同抗生素的专用美洲狮，它们可能为菌群检测提供不同的阈值。本文所述的方法应鼓励更多的定量和比较研究，以提高文化的准确性，扩大新媒体的多功能性。例如，在第一个^10-5板和144个菌落的第二个^10-5板计数152个殖民地。两个板块之间的平均值是148个殖民地。这些板接种了0.1 mL（100 μL）的^10-5稀释，按方程1等于148 x 10⁶ （14.8 x 10⁷） 纯培养库存的CFU/mL。当粪便稀释时，培养物以1:1的比例被刺入负粪池。因此，通过公式 2，粪便曲线上的第一个点（板"a"）对应于 14.8 x 10⁷除以 2，等于 7.4 x 10⁷ CFU/mL。这个"a"管用于制造9个额外的稀释。在图1中，最后一个带有一个可见的克负菌落的稀释与弯曲杆菌一样的形态在板"g"。这在本示例中的粪便培养阈值相当于 1.1 x 10⁶ CFU/mL。

尽管持续生存能力是文化准确性的关键，但在处理和将标本从患者运送到诊所到参考实验室时，保持弯曲杆菌的生存能力是有问题的。典型的储存是在普通盖管中冷藏样品，暴露在空气中，没有特殊大气。运输介质中的标本（也称为保存样本）被认为具有更好的存活率，但很少有报告提供定量数据^18。

再次使用上述分析和精心设计的样本方法相结合，在运输介质中获取C.jejuni的可行性和生存时间估计。细菌汤用于在粪便基质中制备10个重复的2倍至1024倍的样品稀释剂。分析计数发现初始肉汤的浓度为4.8 x 10⁷ CFU/mL。在 0 天制造的板上，C. jejuni被检测到（2 天后），在板上条纹 32 倍稀释，相当于 1.5 x 10⁶ CFU/mL。然而，在冷藏Cary Blair粪便样品24小时后制成的盘子上，只有2倍稀释（相当于2.4 x 10⁷ CFU/mL）才长出了可见的菌落。研究停止时，96小时没有进一步丧失生存能力。这种生存能力的丧失相当于16倍（94%）在不到24小时内失去可培养的生物体，表明即使冷藏，在卡里布莱尔介质的粪便小于10⁷ CFU/mL C.jejuni可能错过文化。

与培养结果相反，EIA 在初始时间点和整个 4 天的测试期间检测到C. jejuni在 256 倍稀释时的存在。使用尖峰粪便样本的 EIA 的C. jejuni检测阈值为 8.4 x 10⁴ CFU/mL。这个阈值低于粪便培养，并允许更敏感和稳定地检测C.jejuni。

为了测试培养在实际临床环境中检测弯曲杆菌的能力，1，552个临床粪便标本具有6个程序:粪便培养、一种新的弯曲杆菌免疫测定和4种分子方法。所有样品均按预期方式收集，最初按美国3个实验室的传统培养分类，然后由EIA进行交叉核对。任何培养阳性或EIA/培养-分片标本然后通过分子方法¹²筛选。根据5种非培养方法的结果，为标本分配了真实阳性或真实阴性状态。这5种非培养方法对所有48种阳性和鉴文标本完全一致，而文化鉴定错误为14（28%）。被培养者错误识别的样本包括13个假阴性和1个假阳性样本。

图1:同时制备分析和尖峰粪便样本的方案。请点击此处查看此图形的较大版本。

图2:从纯和粪便培养物中鉴定C.杰朱尼菌落。（A） 72小时孵育后，从纯细菌培养中产生的C.jejuni菌落的照片。（B） C. jejuni的克状染色来自纯细菌培养，浸油 400 倍放大倍率。（C） C. 杰朱尼- 阳性尖峰粪便培养在48小时孵育后的照片.（D） 放大框中的面积 （C）， 放大倍数 10 倍。白色箭头表示针尖大小克阴性C. jejuni殖民地。黑色箭头表示一个稍大、克阳性的殖民地，而不是C.jejuni。请点击此处查看此图形的较大版本。

文化	OD600 × T0	OD600 = T 最终1	最终 CFU/mL
C. 杰朱尼	0.146	0.321	1.28 x 107
大肠杆菌	0.245	0.508	4.50 x 108

表1:大肠杆菌股的典型生长和CFU/mL。 ¹C. 杰朱尼文化在48小时的孵育后停止。C. 大肠杆菌培养在孵育54小时后停止。

	用于尖峰粪便样本的稀释管	弯曲杆菌-类似殖民地的数量	克拉姆负菌落数1	文化是积极的？	已计算的尖峰样本的 CFU/mL
C. Jejuni （1.28 x 108 CFU/mL 库存）	（2 倍） a	密集	nd2	是的	6.40 x 107
	（4 折） b	20€	nd	是的	3.20 x 107
	（8 倍） c	4-10	nd	是的	1.60 x 107
	（16 倍） d		nd	是的	8.00 x 106
	（32 倍） e		nd	是的	4.00 x 106
	（64 倍） f	1-3	1 的 2	是的	2.00 x 106
	（128 折） g		2 的 3	是的	1.00 x 106
	3（256 倍） h		1 的 2	是的	5.00 x 105
	（512 倍） i		0 的 1	不	2.50 x 105
	（1024 倍） j	0	nd	不	NFP
大肠杆菌（4.50 x 108 CFU/mL 库存）	（2 倍） a	密集	nd	是的	2.25 x 108
	（4 折） b		nd	是的	1.13 x 108
	（8 倍） c	50€	nd	是的	5.63 x 107
	（16 倍） d	30€	nd	是的	2.81 x 107
	（32 倍） e	10€	nd	是的	1.41 x 107
	（64 倍） f	3-8	nd	是的	7.03 x 106
	（128 折） g		nd	是的	3.52 x 106
	3（256 倍） h	1-3	1 的 3	是的	1.76 x 106
	（512 倍） i		0 的 1	不	8.79 x 105
	（1024 倍） j	0	nd	不	NFP

表2:尖峰粪便样本板上的典型菌落数。¹克负菌落在弯曲杆菌状菌落中，^{第 2}个 = 未确定^，3粗体类型的数据表示最后一次正稀释。

物种	基因靶点
C. 杰朱尼	hipO
大肠杆菌	cadF
C. 上升	cpn60
C. 拉里	cpn60
C. 赫维提库斯	cpn60
C. 胎儿	cpn60
C. 霍肠病	cpn60
C. 康西斯	cpn60

表3:可用于检测单个弯曲杆菌物种qPCR的基因。

讨论

这里描述的培养方法是建立在简单，广泛使用的技术和材料在大多数实验室^10。分析和精心设计的样本相结合，为粪便培养物提供了临床相关检测阈值的新信息。此外，通过5次单独测定对培养结果的裁定加强了弯曲杆菌粪便培养错误识别患者样本很大一部分的结论。EIA 和分子测定作为对照组非常有用，因为它们都基于不同的原理（抗原与抗体与DNA扩增相互作用），而且重要的是，它们不依赖于细菌的生存能力。请注意，用于这些研究的EIA测定已经得到了很好的验证，并已证明完全同意4个分子测试^12。

弯曲杆菌的培养特别麻烦，敏感性报告范围从60-76%19，20，从它30%的失败率未能检测真阳性标本在这里可见。当培养数据为阴性时，人员可以预期控制EIA和分子测试通常会产生阳性结果。

协议中最关键的步骤是确定相互竞争的粪便菌群之间的针点菌落。在接近检测阈值时，具有交替零和非零聚位计数估计值（例如，2、0、1、0、0）并不罕见。必须认识到，培养阈值将是一系列浓度，而不是特定的 CFU/mL。然而，对1×10⁶ CFU/mL粪便作为培养检测下限的估计与报告相比，受感染的人类每克粪便²¹下泄10⁶至10⁹个弯曲杆菌。抗生素或加盘的变化和个别粪便标本中不可避免的变化无疑会改变阈值。此协议应支持增长介质的改进。

关于培养检测限制的第一个信息，使得为诊断测试设定临床相关阈值成为可能，并奠定了解决弯曲杆菌未研究的无症状运输^22、23问题，或者如果细菌负荷与症状或严重后遗症相关的问题所需的微生物基础。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaerobic 3.5L Jar	Thermo Fisher	HP0031A
AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar	Hardy Diagnostics	AG701
Bacto Brain Heart Infusion	BD Biosciences	237500
Bacto Protease Peptone	Life Technologies Corp	211684
Basic Fuchsin	Fisher Scientific	B12544
BBL Trypticase Peptone	Life Technologies Corp	211921
C. coli Type strain	ATCC	33559
C. jejuni Type strain	ATCC	33560
CampyGen gas generating system sachet	Thermo Fisher	CN0025A
Campylobacter QUIK CHEK	TechLab, Inc.	T5047 / T31025
Cary-Blair transport medium	Fisher Scientific	23-005-47
Coli Roller Sterile plating beads	Millipore Sigma	71013
Dilution Buffer	Anaerobe Systems	AS-908
Fetal bovine serum	Equitech-Bio, Inc	SFBM30
Sodium bisulfite	Sigma-Aldrich	243973
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Spectrophotometer cuvettes	USA Scientific	9090-0460