冠状血管生成体模型

摘要

冠状血管生成体外模型可用于发现冠状血管生成细胞和分子机制。正月线和内卡组织体外外培养物在响应VEGF-A时表现出强劲的生长，并表现出与体内类似的COUP-TFII表达模式。

摘要

在这里，我们描述了一个体外培养测定，以研究冠状血管生成。冠状血管喂养心肌，是临床上重要的。这些血管的缺陷代表严重的健康风险，如动脉粥样硬化，这可能导致心肌梗死和心脏衰竭的患者。因此，冠状动脉疾病是全世界死亡的主要原因之一。尽管它具有临床重要性，但如何再生受损的冠状动脉进展甚微。然而，最近在了解冠状血管发育的细胞起源和分化途径方面取得了进展。使研究人员能够荧光标记后代细胞、跟踪后代命运和想象体内后代的工具和技术的出现，有助于理解冠状血管的发展。体内研究很有价值，但在速度、可访问性和实验设计的灵活性方面却有局限性。或者，准确的冠状血管生成体外模型可以规避这些限制，使研究人员能够快速灵活地询问重要的生物学问题。缺乏适当的体外模型系统可能妨碍了理解冠状血管生长细胞和分子机制的进展。在这里，我们描述了一个体外培养系统，从心内膜（SV）和内膜（Endo）生长冠状血管，这是许多冠状血管产生的两个祖组织。我们还确认，这些文化准确地概括了一些已知的体内机制。例如，我们表明，SV培养中的血管生成芽与体内观察到的类似，对COUP-TFII的表达进行低调节。此外，我们显示VEGF-A，一个众所周知的血管生成因子在体内，有力地刺激血管生成从SV和Endo培养。总体而言，我们设计了一个精确的体外培养模型来研究冠状血管生成。

引言

心脏的血管通常被称为冠状血管。这些血管由动脉、静脉和毛细血管组成。在开发过程中，先建立高度分支毛细血管，然后改造成冠状动脉和静脉^{1、2、3、4、5。}这些初始毛细血管由在上皮管、正肠（SV）和内卡（Endo）组织^{1、6、7、8}中发现的内皮祖细胞构建而成。SV是胚胎心脏的流入器官，内核是心脏流明的内衬。在SV和Endo中发现的内皮原细胞建立大部分的冠状血管，而外皮心肌贡献了相对^{小部分2。}冠状血管毛细血管网络从先前存在的前体细胞在心脏中生长的过程称为冠状血管生成。冠状动脉疾病是全世界死亡的主要原因之一，然而，这种病却缺乏有效的治疗方法。了解冠状动脉生成的详细细胞和分子机制，对于设计修复和再生受损的冠状动脉的新颖有效的疗法非常有用。

最近，我们对冠状血管如何发展的认识激增，部分是通过开发新的工具和技术实现的。特别是，在体内系系标签和先进的成像技术在发现冠状血管^{9、10、11、12}的细胞起源和分化途径方面非常有用。尽管这些在体内工具的优点，但在速度、灵活性和可访问性方面还是有局限性的。因此，强大的体外模型系统可以补充体内系统，以高通量的方式阐明冠状血管生成细胞和分子机制。

在这里，我们描述了冠状动脉成因的体外模型。我们开发了一种体外外培养系统，从两个祖组织SV和Endo生长冠状血管。通过这个模型，我们表明体外组织外植培养体生长冠状血管芽时，刺激生长介质。此外，在血管内皮生长因子A（VEGF-A）刺激时，外植培养物与对照生长迅速，这是一种高效力的血管生成蛋白。此外，我们发现，来自SV培养的血管生成芽经历静脉分化（COUP-TFII表达的丧失），这种机制类似于体内的SV血管生成^。这些数据表明，体外外植物培养系统忠实地恢复了体内发生的血管生成事件。总之，此处描述的血管生成体外模型非常适合以高通量和可访问的方式探测冠状血管生成细胞和分子机制。

研究方案

该协议中所有动物的使用遵循鲍尔州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的准则。

1. 建立小鼠饲养者和检测阴道塞的及时怀孕

1. 建立一个与野生型雄性小鼠和雌性小鼠的小鼠繁殖笼。确保繁殖小鼠的年龄在6-8周之间。设置一对（1雄和1女）或作为三人（1雄和2雌）繁殖。
2. 第二天早上检查阴道塞。使用倾斜的金属探头通过将深塞插入阴道开口来检测深塞。指定阳性阴道塞的早晨为胚胎日 0.5 （e0.5）。
   注:阴道塞可以是表面的（很容易看到，参见图1）或深（不易看到）。存在深塞将阻止探头的完全插入，而缺少插头将允许完全插入，而不会产生阻力。
3. 保持怀孕时间，直到胚胎达到e11.5，收获胚胎。为了在收获胚胎之前确认怀孕，记录雌性小鼠的体重在e7.5和e11.5之间。
   注:母亲体重的每日增加将表明怀孕成功，而体重不变表明怀孕失败。

2. 从怀孕小鼠身上采集胚胎

注:在开始之前，一定要有以下设备和试剂:CO₂安乐死室，70%乙醇，纸巾，常规钳子，细钳子，剪刀，1x 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS），10 厘米无菌培养皿，容器与冰，穿孔勺子，解剖立体显微镜。

1. 将一只e11.5怀孕的老鼠放在一个干净的CO₂安乐死室中，以牺牲它。关闭造型室的盖子，防止鼠标逸出。
2. 将鼠标固定在安乐死室后，打开 CO₂。确保根据 IACUC 建议调节 CO₂的流速（即每分钟 10-30% 位移）。小鼠完全安乐死后，进行宫颈脱位，以确保死亡。
3. 用70%乙醇喷洒鼠标。用钳子将皮肤抬过腹部，用剪刀做小切口，并横向延长切口。将切口前放大到隔膜，露出含有胚胎的子宫角（图2）。
4. 通过抓住子宫并自由切割，拉出胚胎串（子宫角 + 胚胎）。将胚胎串放入冰冷的无菌1x PBS中。
5. 通过在立体显微镜下逐一剥离子宫肌肉、蛋黄囊和羊水，从子宫角分离出单个胚胎（图3A-F）。使用穿孔的勺子将清洁的胚胎转移到含有冰上无菌1x PBS的培养皿中。确保让胚胎保持寒冷。

3. 将心脏与e11.5胚胎隔离开来

注:在开始之前，一定要有以下设备和试剂:常规钳子、细钳子、1x 无菌PBS、10厘米无菌培养皿、6 厘米无菌培养皿、带冰的容器、穿孔勺子、解剖立体。

1. 在立体显微镜下设置一个新的培养皿，带有冰冷的无菌1x PBS。将胚胎从第2.5步转移到培养皿中，以解剖心脏。
2. 使用钳子取出胚胎的头部。首先，用一只手挤压钳子之间的头部，然后用闭合钳刮掉头部（图4A-C）。
3. 取下头部后，用一只手将胚胎的腹部用钳子抱住胚胎，使其腹腔侧向上定向（图4D）。
4. 另一只手，首先用细钳子在膜片上方稍微上方的胸部进行小切口，打开胚胎的胸壁。然后，通过插入封闭的钳子和通过打开钳子撕裂胸壁，非常仔细地扩大切口。确保不要太深，这会损害心脏。在钳子的帮助下，保持胸壁敞开，露出胸腔中的心脏和肺（图4E）。
5. 使用细钳，轻轻移动心脏前部 （90°）， 并暴露背带主动脉/静脉。通过捕捉心脏底部的背动脉/静脉，将心脏/肺前拉出（图4F-H）。
   注:在拉出心脏/肺时要温柔，以避免位于心脏背侧SV的撕裂。
6. 用冷的1x PBS冲洗心脏/肺以去除血细胞。
7. 重复步骤 3.1-3.6 以从剩余的胚胎中取出心脏/肺。确保将分离的心脏/肺留在冰上。

4. 将 SV 和心室与 e11.5 胚胎小鼠心脏隔离

1. 将带有心脏/肺的培养皿从步骤 3.7 放在立体显微镜下，以隔离 SV 和整个心室。使用细钳子逐个从肺根上剥下肺部的叶瓣。
2. 将心脏定向到其背侧，在不撕裂 SV 的情况下，去除前 SV 周围的心房和相邻组织。从心脏中取出左右的安体，按住心脏底座，并用细钳将其刮掉（图5B）。使用类似的技术移除 SV 周围的相邻组织（图 5C）。
   注:请记住，正确的中庭连接到 SV，因此请小心只移除中庭。
3. 要隔离 SV，首先将心脏的背侧朝上（因为 SV 位于背侧），并通过用钳子轻轻地将心脏握在心室，使心脏保持在此位置。
   注:SV是胚胎心脏的流入器官，位于心脏背侧心膜之间。
4. 拆下 SV，小心地将其从连接处的心脏上剥离，或者用细钳将 SV 放在附件底部，用闭合钳将其刮掉（图 5D，E）。
5. 使用无菌转移移液器将分离的 SV 转移到新的 6 厘米培养皿中，在冰上使用冰冷的无菌 1x PBS，并将 Petri 盘标记为 SV。
6. 要分离整个心室，在取出 SV 后从心脏中取出流出道（主动脉和肺干干）（图 5F，G）。
7. 使用无菌转移移液器将整个心室转移到含有无菌1x PBS的新的6厘米培养皿中，并将Petri盘标记为心室。将分离的 SV 和心室放在冰上。
8. 重复步骤 4.1-4.7，将 SV 和心室与剩余的心脏隔离。

5. 使用插入和细胞外基质涂层设置组织培养板

注:在开始之前，请确保有以下设备和试剂:商用细胞外基质溶液（ECM;例如，马特里格尔）、8.0μM聚乙烯二苯二甲酸酯（PET）培养剂、24孔板、37°C、5%CO₂培养箱。

1. 让 ECM 溶液在冰上解冻。将 ECM 溶液保存在冰上，以避免凝固。
2. 将PET膜培养插件（孔径=8.0μm，过滤面积=0.3厘米^2，滤径=6.5毫米）放入井内非组织培养处理24孔板。将板分别标记为 SV 或心室，用于 SV 或内心血管生成测定。
   注:同时执行两种培养物时，将 SV 和心室的插入器设置在单独的板中。确保为所有实验样品和控制装置设置足够的井。
3. ECM 溶液解冻后，立即将预冷却基底介质中的 ECM 1:2（即 EBM-2 基底介质，参见材料表）稀释到足够体积（100 μL/插入 x 刀片数）。
   注:例如，如果有六个刀片，则总体积将为 100 μL x 6 = 600 μL。 将 200 μL 的 ECM 添加到 400 μL 的基础介质中。
4. 直接在膜顶部加入 100 μL 新稀释 ECM 的刀片。在37°C下孵育板至少30分钟，使ECM凝固。
   注:必须在层状流动组织培养罩下进行，以避免污染。

6. SV 和整体心室文化

注:在开始之前，一定要有以下设备和试剂:70%乙醇，转移移液器，立体显微镜，钳子，层状流动组织培养罩，微血管内皮细胞补充试剂盒（材料表），基底介质，1x无菌PBS）。图 6显示了 SV 和心室区域性的工作流。

1. 解冻冰上补品套件的内容。通过在认证的层流组织培养罩下将补充试剂盒的所有内容添加到 500 mL 的基础介质中，准备完整的介质。将介质混合好，并分配成 50 mL 等号。
2. 用70%乙醇对立体显微镜底部和周围工作区域进行消毒。
3. 从步骤 5.4 获取组织培养板。在移液器的帮助下，小心地从插入膜顶部的步骤 4.7 中转移外植株。在立体显微镜下，借助清洁钳子，将外植器置于刀片的中心，以确保它们不会卡在插入器的角落或连接到侧壁上。
4. 放置外植株并居于刀片后，小心地从刀片中取出任何多余的 PBS 并关闭板的盖子。
5. 在层压流动组织培养罩下，在刀片顶部加入100 μL的预热完整介质，在井中加入200 μL，以培养空气-液体界面上的外植株，使插入机的基底表面与介质接触，但顶部表面暴露在空气中。
   注:如果使用不同尺寸的刀片/孔板，请确保调整体积以获得液-液体接口。
6. 将 300 μL 的 PBS 添加到 24 个孔板未使用的孔中，并盖上盖子。在37°C、5%CO₂培养箱中孵育板，并将培养物生长5天。
7. 在接下来的几天里，在倒置的光学显微镜下定期观察培养物，以评估外植培养物的状态。确保外植株表现出收缩性跳动，并且所有外植株都附着在嵌入 ECM 的膜底部。注意任何漂浮的外植物。
   注:外植的周期性收缩表示它们还活着。应在分析中省略浮动外植株。
8. 在评估文化状况后，将文化板块放回孵化器，继续种植文化长达5天。

7. 使用 VEGF-A 处理培养物（积极控制）

注:在开始之前，一定要有以下设备和试剂:层状流动组织培养罩、1x PBS、基底介质+1%胎儿牛血清（FBS）、基底介质+ VEGF-A、移液器和移液器尖端。

1. 准备基础介质 = 1% FBS 和基底介质 + VEGF-A。
   1. 要准备基础介质 = 1% FBS，请先确定所需的控制井数。例如，如果有三口控制井，则 300 μL/井 x 3 = 900 μL 是所需的总体积。将 9 μL 的 FBS 加入 891 μL 的基础介质中，使基底介质 = 1% FBS。
   2. 要制备基础介质 – VEGF-A，请首先确定需要 VEGF-A 介质的井总数。如果有三口井，则 300 μL/井 x 3 = 900 μL 是总体积，50 纳克/井 x 3 = 150 ng VEGF-A。将150纳克的VEGF-A加入900μL的基础介质中，使基底介质 = VEGF-A。
      注: 以比计算更大的体积组装此解决方案，以确保每个实验的较小等号数量足够多。
2. 第 2 天，从两个腔室（插入件和井）中取出介质。通过在刀片中加入 100 μL 和将 200 μL 添加到井中，用 300 μL 的 1x PBS 清洗培养物。牢固地旋转板几次并拆下 PBS。
3. 加入300 μL基底介质 = 1%FBS（100 μL到刀片中，200 μL进入井中），使培养物饿死24小时。
4. 第3天，饥饿后，将300μL的基底介质= 1%FBS（100 μL放入插入和200μL进入井中）放入控制井和基底介质+ VEGF-A（50纳克/井）中。
5. 治疗后，继续培养培养在培养箱中的文化。

8. 固定和免疫染色

注:在开始之前，请确保具有以下设备和试剂:4%甲醛（PFA）、1x PBS、初级和二级抗体、摇床、PBS （PBT） 中的 0.5% 非离子表面活性剂。

1. 在培养的第六天，在室温 （RT） 下，去除介质，用 1x PBS 清洗培养物。
   1. 通过在井中加入 200 μL 4% PFA 溶液，在刀片中加入 100 μL，修复培养物。在摇动时将培养物固定在 4 °C 中 20 分钟。
   2. 固定 20 分钟后，从烟罩中的培养物中取出 PFA，然后通过将 200 μL 添加到井中，在刀片中加入 100 μL，用 1x PBS 清洗培养物。
   3. 在摇动时重复进行 3x、10 分钟。然后继续进行免疫染色。
      注:RT 的台面上执行所有洗涤步骤。
2. 稀释阻断溶液中的主要抗体（抗VE-Cadherin，抗ERG1/2/3）（5%驴血清，0.5%PBT）。加入300 μL的原抗体溶液（底部井200μL，插入100μL）。在摇动时，在4°C下通宵孵育原抗体中的培养物。
   注:抗VE-Cadherin用于标记内皮细胞膜，抗ERG 1/2/3用于标记内皮细胞核，以可视化内皮细胞的血管生成芽。
3. 第二天，洗涤和摇动培养板10倍在0.5%PBT，每10分钟更换一次PBT。
4. 稀释二级抗体（驴抗大鼠Alexa Fluor 488和驴抗兔AlexaFluor 555）在阻断溶液。加入步骤8.2中的继发抗体300μL，在摇动时在4°C下孵育培养物过夜。第二天，在PBT中洗涤继发抗体10倍，每10分钟更换一次PBT。
   注:洗涤至少10倍，但更多的洗涤更好。处理完成后，可以使用 1x PBS 存储区域性，直到它们安装到幻灯片上。

9. 将区域性安装到幻灯片、成像和分析上

注:在开始之前，请确保具有以下设备和试剂:精细钳子、滑轨、安装介质，带 4°，6-二胺-2-苯胺酚 （DAPI）、盖玻片和共聚焦显微镜。继抗体染色后，使用以下步骤将培养物安装到幻灯片上进行成像。

1. 使用细钳从刀片上小心地剥下膜，然后通过放下膜侧面向上放置外植培养物将其转移到滑轨上。将复制的样本放入相同的幻灯片中，并将幻灯片标记为控件或 VEGF-A。将几滴带有 DAPI 的安装介质直接添加到膜上，用盖玻片盖住滑轨。
   注:放置盖玻片时，一定要避免气泡。
2. 用透明指甲油密封滑轨边缘，让干燥。
   注:幻灯片可以存储在 -20°C 中，用于长期存储。
3. 使用共聚焦显微镜进行图像幻灯片。
4. 执行分析以测量血管生成生长的长度。通过测量内皮细胞（Ve-Cadherin®/ERG 1/2/3+）之间的距离，从心室培养物中ERG 1/2/3+细胞的内边界和SV培养物中SV外植中心延伸的距离，量化血管生成外生长长度。
   1. 要使用 FIJI/ImageJ 执行定量，请先下载 FIJI 软件。
   2. 打开 FIJI 中的图像文件:转到文件 |打开 |文件夹 |文件名 |打开。
   3. 转到分析 |设置测量值 |选择"周长"。
   4. 从主窗口中选择直线工具。
   5. 按照步骤 9.4 中的建议，在芽的长度上画一条线。
   6. 转到分析 |测量.
      注: 长度测量值显示在新窗口中。
   7. 在表示至少三个随机选择的视场的图像中执行量化。平均芽长度测量值，并将其报告为均值 = 标准差。

结果

SV血管生成在体内最引人注目的特点之一是，它遵循一个特定的途径，涉及细胞去分化和再分化事件，发生在定型的时间和位置^1。当最初的SV细胞生长到心脏心室时，它们停止产生静脉标记，如COUP-TFII（图7）。随后，冠状芽采取两种迁移路径，要么在心脏表面或心肌深处。水面船只最终成为静脉，而入侵的船只变成动脉和毛细血管<...

讨论

成功生长SV和内部原组织冠状血管的一些最关键的步骤是:1） 正确识别和隔离SV组织，用于SV培养;2） 使用e11~11.5年龄之间的胚胎心室，获得准确的恩多培养;3） 在整个解剖期间保持无菌状态，并始终保持组织冷;和4） 保持外植附在ECM涂层膜上，以避免组织漂浮在介质中。

首先，分离SV组织可能具有挑战性。重要的是要认识到，SV位于隐藏在肺卵管内的左右心的背侧。因此，很?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 20 MM Tissue Culture Dish	Fisher Scientific	877222	Referred in the protocol as Petri dish
24-well plates	Fisher Scientific	08-772-51
8.0 uM PET membrane culture inserts	Millipore Sigma	MCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555	Fisher Scientific	A31572	Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488	Fisher Scientific	A21206	Secondary antibody
Angled Metal Probe	Fine science tools	10088-15	Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibody	Abcam	Ab92513	Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibody	Fisher Scientific	BDB550548	Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tank	Various suppliers	N/A
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13998223	For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosope	Leica	S9i	Leica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156	Endothelial cell growth basal media
ECM solution	Corning	354230	Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots Kit	Lonza	CC-4147	Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007003IR
FiJi	NIH	NA	Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine Forceps	Fine science tools	11412-11	Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors	Fisher Scientific	13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	SH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hood	Fisher Scientific	various models available
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1200	Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy/Fisher	50-980-494	This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoon	Fine science tools	10370-18	Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165	PeproTech	450-32
Standard forceps, Dumont #5	Fine science tools	11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamber	Easysysteminc	EZ-1785	Euthanasia chamber