生产近红外敏感、核心壳疫苗输送平台

摘要

本文介绍了用于生产新型疫苗输送平台"多泡"的协议，以实现延迟突发释放。聚酯（乳酸共糖酸）和多丙酮用于形成多泡，小分子和抗原用作货物。

摘要

疫苗交付战略可以限制货物接触有机溶剂，同时实现新的释放概况，对于提高全球免疫覆盖率至关重要。这里引进了一种新型的注射、紫外线固化和延迟突发释放-使疫苗输送平台，称为多泡。货物被注入聚酯基聚泡，形成于10%的碳基纤维素为基础的水溶液。本文包括保持多泡球形和优化货物放置和保留的协议，以最大限度地提高多泡内的货物量。为确保安全，使用中子活化分析对多泡中的氯化溶剂含量进行了分析。释放研究以小分子作为货物在多泡内进行，以确认延迟的爆裂释放。为了进一步展示货物按需交付的潜力，将金纳米棒混合在聚合物壳中，以实现近红外激光活化。

引言

免疫覆盖率有限导致300万人死亡，具体由疫苗可预防疾病^引起1。储存和运输条件不足导致功能性疫苗的浪费，从而导致全球免疫接种减少。此外，由于未遵守要求的疫苗计划而不完全接种疫苗也会导致疫苗覆盖率有限，特别是在^{发展中国家。}在接受强化注射的建议期间内，需要多次看望医务人员，从而限制完全接种疫苗的人口比例。因此，有必要为控制性疫苗的交付制定新的战略，以规避这些挑战。

目前开发疫苗交付技术的努力包括基于乳液的聚合物系统^3，4。3,然而，货物往往暴露在更多的有机溶剂，可能会导致聚集和变性，特别是在蛋白质为基础的货物^{5，6,的背景下}。我们开发了一种新型的疫苗输送平台"多泡"，可以潜在地装着多个货舱，同时最大限度地减少暴露于溶剂^{7中的货物数量}。例如，在我们的多泡芯壳平台中，一个直径为 0.38 mm （SEM） 的货物口袋被注入 1 mm 多泡的中心。在这种情况下，暴露于有机溶剂的货物表面积约为0.453 mm²。在考虑球体（微粒）的包装密度后（货物库），可放入仓库的微粒（直径为10 μm）的实际体积为0.17 mm³。一个微粒的体积为5.24x10-8 mm^3，因此可以容纳仓库的颗粒数量为+3.2x10⁶颗粒。^-8如果每个微粒有 20 个直径为 0 . 25 μm的货物口袋（由于液），则暴露于有机溶剂中的货物表面积为 1274 mm²。因此，与微粒中有机溶剂暴露的货物相比，多泡内的货库暴露于有机溶剂的表面面积要少2800倍。因此，我们的聚酯平台可能会减少暴露于有机溶剂的货物数量，否则会导致货物聚集和不稳定。

聚泡基于相分离原理形成，有机相中的聚酯被注入水溶液，形成球形气泡。水相中的货物可以注入多泡的中心。通过将不同的货物与聚合物壳混合，可以在多泡体中实现另一个货舱。在这个阶段，多泡将是可塑的，然后将被固化，导致一个坚实的多泡结构与货物在中间。选择球面多泡而不是其他几何形状，以增加多泡内的货物容量，同时最小化多泡的整体大小。选择在中心有货物的多泡来演示延迟爆裂释放。多泡体还与近红外（NIR）-敏感（即启用辐射）剂（即金纳米棒（AuNR）结合使用，导致多泡温度升高。这种效应可能促进更快的降解，并可用于控制未来应用中的动力学。在这篇论文中，我们描述了我们形成和描述多泡的方法，实现从多泡的延迟突发释放，并将AuNR纳入多泡中，导致NR激活。

研究方案

1. 多卡普罗基酮三聚丙酸酯 （PCLTA） 合成

1. 干燥 3.2 mL 的 400 Da 多丙酮 （PCL） 三重奏在 50 °C 下过夜，在打开的 200 mL 圆形底部烧瓶和 K_2CO3在玻璃小瓶中 90°C。
2. 将三叶草与 6.4 mL 二氯甲烷 （DCM） 和 4.246 g 碳酸钾 （K₂CO_3）混合在砷下。
3. 在27.2 mL的DCM中混合2.72 mL的氯化丙烯，并在5分钟内滴入烧瓶中的反应混合物中。
4. 用铝箔盖住反应混合物，在室温下保持24小时不受干扰。
5. 24 小时后，使用真空下的 Buchner 漏斗上的滤纸过滤反应混合物，以丢弃多余的试剂。
6. 从步骤1.5沉淀滤料，该步骤在1:3（vol/vol）中含有二乙醚中的内切聚合物，并在30°C时旋转，以去除二乙醚。

2. 多泡的形成

注:在去电化 （DI） 水中注入聚合物会导致多泡迁移到小瓶底部，导致底部变平。使用 10% （wt/vol） 碳氧甲基纤维素 （CMC） 填充玻璃瓶，以避免多泡扁平化。

1. 在 DI 水中准备 10% （wt/vol） CMC 溶液。
2. 使用 1 mL 传输移液器将 0.92 mL 玻璃瓶填充 0.8 mL 10% CMC。
3. 在 DCM 中混合 1000 mg/mL 的 14 kDa PCL，在 1:3（vol/vol）中合成 PCLTA，总体积为 200 μL，或在氯仿中制备 200 μL 1000 mg/mL 的 5 kDa 聚（乳酸糖酸）二酸）二酸（PLGADA）。
4. 将2-羟基-4+-（2-羟基乙基）-2-甲基丙丙酮（光启动器）与聚合物（PLGADA或PCL/PCLTA）混合物混合在0.005:1（卷/伏）。
5. 将 200 μL 聚合物混合物加载到安装在注射器泵上的 1 mL 玻璃注射器中，该注射器泵连接到内径为 0.016 英寸的分配不锈钢管。
6. 使用微电机控制聚合物管的向前和向后运动，将聚合物注入玻璃瓶中的 10% CMC 中，形成多泡。
7. 在254纳米波长的紫外线（UV）下治疗多泡，在2W/cm²下治疗60 s。
8. 在0.010 mBar真空和-85°C下，闪冻液氮中的多泡液并冻干过夜。
9. 使用钳子将多泡与干燥的 CMC 分离，用 DI 水清洗多泡，以去除任何残留的 CMC。请注意，其他聚合物可用于修改，以改变释放动力学。

3. 多泡直径的调制

1. 使用 1 mL 传输移液器将 0.92 mL 玻璃瓶填充 10% CMC。
2. 将 PCL/PCLTA 与 1000mg/mL 14kDa PCL 混合，合成 PCLTA。将光启动器与聚合物混合物混合在 0.005:1（vol/vol）中。
3. 将聚合物混合物装入安装在注射器泵上的 1 mL 玻璃注射器中，该注射器泵连接到内径为 0.016 英寸的分配不锈钢管。
4. 使用微电机控制聚合物管的向前和向后运动，将聚合物注入玻璃瓶中的 10% CMC 中，形成多泡。
5. 要获得不同直径的多泡，将点胶速率从 0.0005 变化到 1 μL/s。
6. 用直径不同的多泡拍摄小瓶的图像。
7. 使用 ImageJ 量化多泡的直径，并使用小瓶的大小作为比例。

4. 将货物居中于多泡

1. 使用 K₂CO 3 调节 PCL/PCLTA_粘度:
   注:PLGADA 的粘度不必使用 K₂CO_{3 进行改度，} 因为 5 kDa PLAGDA 的粘度为 1000 mg/mL，足以使货物居中。
   1. 在PCLTA反应后以不同浓度加入K₂CO_3（ 在PCLTA反应后分离），包括0mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40毫克/mL和60毫克/mL。
   2. 使用流变法将剪切速率从 0 更改到 1000 1/s，测量溶液的动态粘度。
   3. 手动将货物注入中间（参见步骤 4.2 以准备货物混合物），这些多泡是使用不同浓度为 K₂CO₃ 的 PCL/PCLTA 溶液形成的多泡（步骤 4.1.1）。通过观察步骤_4.1.1中的哪种溶液可导致货物在中间保留，确定 K 2 CO₃ 的最佳浓度。
2. 用CMC将货物居中（已显示出小分子的可行性）
   1. 将货物与 5% （wt/vol） CMC 混合在旋转器中过夜，以提高货物的粘度。
   2. 在多泡中手动注入 2 μL 的货物混合物，并在 2 W/cm 2 下以 254 nm 波长进行 60 s 的 UV^固化。
   3. 闪光将液氮中的多泡冷冻30 s，在0.010 mBar真空和-85°C下冻干过夜。
   4. 使用钳子将多泡从干燥的 CMC 中分离，用 DI 水清洗以去除任何残留的 CMC。
   5. 将多泡切成两半，并使用共和显微镜对两半进行图像，以确保货物居中（参见步骤 6，用于激发和发射波长）。

5. 货物配方

注:多泡制剂可以装点各种货物类型，包括小分子、蛋白质和核酸。

1. 根据先前的研究，在蛋白质货物的情况下，使用辅料，包括聚乙二醇^{（PEG）6，}聚氯基酮（PVP）和糖聚合物^6， 以提高蛋白质在聚泡配方中的稳定性。
2. 根据步骤 2 中的协议形成多泡。
3. 通过将 17.11 g 的海激素添加到 625 μL 的 HIV gp120/41 抗原中，准备抗原溶液。
4. 在多泡中间手动注射1μL抗原溶液。
5. 打开第 0 天、第 7 天、第 14 天和第 21 天的多泡，并记录抗原的荧光，其激发和发射波长分别为 497 nm 和 520 nm。
6. 使用酶链接免疫吸附剂测定（ELISA）确定抗原的功能，并使用5%的脱脂牛奶作为阻断缓冲液。

6. 货物放行

注:小分子或抗原可用作货物类型

1. 小分子
   1. 在37°C、50°C为PLGA多泡和37°C、50°C、50°C、70°C（PCL/PCLTA多泡）中，用中基磷酸盐孵育多泡。
      注:我们建议在高于体温的测试中，之所以能模拟多泡在PCL和PLGA内激光照射金纳米棒（奥纳）时达到的温度（50°C）;和 b） 加速 PCL（50°C，70°C）的降解过程。
   2. 在每个时间点，收集超自然剂，并更换400μL的新鲜PBS。
   3. 使用板读卡器量化收集的超级纳的荧光强度。
      注:使用 416 nm/514 nm 的 ex/em 进行 acriflavine。
2. 抗原
   1. 在37°C的400μL中用中维牛白蛋白血清（BSA）-488孵育多泡，在37°C时孵育50°C，在37°C时孵育50°C，在PCL/PCLTA多泡中孵育50°C。
   2. 在每个时间点，收集超自然剂，并更换为400μL新鲜PBS。
   3. 使用板读卡器量化收集的超级纳的荧光强度。对于 BSA-488，请使用 497 nm/520 nm 的 ex/em。
      注:不应在70°C下对PCL/PCLTA多泡进行释放研究，以避免将抗原暴露在极端温度下。

7. 毒性

1. 使用中子活化分析 （NAA） 量化多泡中的氯含量
   1. 在 0.010 mBar 真空和 -85 °C 下，使用冻干 2、4、6、20 和 24 h 的多泡进行本研究。
   2. 测量 5-9 毫克多泡，并把它们放在 LDPE 辐照小瓶上。
   3. 准备来自国家标准与技术研究所（NIST）可追溯校准解决方案的1000克/mL氯校准解决方案。
   4. 使用1兆瓦Triga反应器以9.1×10^{12/cm 2 μ}s的中子流速对每个样品进行中子辐照。
   5. 将多泡转移到未辐照小瓶中。
   6. 使用 HPGe 探测器在 360 秒衰变间隔后获取 500 s 的伽马射线光谱。
   7. 使用堪培拉工业的 NAA 软件来分析数据。
2. 使用 NAA 量化从多泡中释放的氯含量
   1. 在 37 °C 的 400 μL PBS 中孵育过夜（在 0.010 mBar 真空和 -85 °C） 中冻干的多泡。
   2. 在孵育后的第1周、第2周和3周收集超级钠。
   3. 使用与上述步骤 7.1 中所述方法相同的方法，使用 NAA 分析超钠的氯含量。

8. S.等人的AUNR^合成

1. 通过混合 250 μL 10 mM 氯尿酸 （HAuCl 4）、7.5 mL 的 100 mm 甲基溴 （CTAB） 和 600 μL 的 10 mM 冰冷溴酸 （NaBH₄） 来制备 AuNR 播种溶液。₄
2. 通过将 40 mL 的 100 mM CTAB、10 mM HAuCl₄的 1.7 mL、250 μL 的硝酸银 （AgNO_3）和 270 μL 的 17.6 mg/mL 抗坏血酸混合到管中，制备生长溶液。
3. 在 1200 rpm 下将 420 μL 的种子溶液与生长溶液大力混合 1 分钟。然后让混合物不受干扰，反应16小时。
4. 在8000克g下离心10×去除混合物中的过量试剂，然后丢弃上流剂g。

9. 索利曼、M.G.等人对奥纳的疏水^{性 9}

1. 使用 1 mM 氢氧化钠 （NaOH） 将 1.5 mL 的合成 CTAB 稳定 AUNRs 的 pH 调整为 10。
2. 在 400 rpm 的转速下，用 0.1 mL 0.3 mM 甲基化 PEG （mPEG） 硫醇搅拌溶液。
3. 在 500 rpm 的氯仿中将 PEGylated AunRs 与 0.4 M 多二胺 （DDA） 混合 4 天。
4. 移出含有疏水性AUNR的顶层有机层，并在4°C储存，直到将来使用。

10. 多泡的尼查活化

1. 将聚合物（PLGADA 或 PCL/PCLTA）溶液与疏水性奥纳混合在 1:9（卷/伏）。中。
2. 在0.005:1（卷/伏）中将光启动器添加到聚合物-AUNR混合物中。
3. 通过将聚合物-AuNR混合物注入0.92 mL玻璃瓶中，用10%的CMC（wt/vol）形成多泡（参见步骤2）。
4. 在2 W/cm 2下，以254纳米波长治疗60 s的多^泡。
5. 在液氮中闪冻30 s，在0.010 mBar真空和-85°C下冻干过夜。
6. 使用钳子分离干燥的多泡，用 DI 水清洗以去除任何残留的 CMC。
7. 在37°C下孵育400μL PBS中的多泡。
8. 每周一、周三和周五，使用 801 nm NIR 激光在 8A 下激活多泡，5 分钟。
9. 在激光激活之前和之后拍摄多泡的前瞻性红外 （FLIR） 图像，以获得温度值。
10. 根据FLIR图像中的温度值计算激光激活之前和之后的温度差异。

结果

使用SEM和NAA广泛描述多泡。货物成功居中，导致延迟爆裂释放。由于多泡中存在AUNRs，多泡也成功地被激光激活。

多泡表征
在没有CMC水溶液中注入的多泡由于与玻璃瓶底部接触而导致多泡变平（图1A，B）。当使用 5% 基于 CMC 的水溶液代替 DI 水时，观察到部分扁平化（

讨论

当前技术和挑战
基于乳化的微颗粒和纳米粒子通常被用作药物输送载体。虽然从这些装置释放货物的动力学已经进行了广泛的研究，控制爆裂释放动力学一直是一个^{重大挑战11。}由于货物接触过量的水性和有机溶剂，基于乳液的系统也限制了货物的多功能性和功能性。由于货物变性和聚合的可能性，基于蛋白质的货物通常与微粒子和纳米粒子^不兼容

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution	Thermo scientific	34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone	TCI AMERICA	H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab17152
Acryloyl chloride	Sigma Aldrich	A24109-100G
Acriflavine	Chem-Impex International	22916
Anhydrous ethyl ether	Fisher Chemical	E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates	Invitrogen	A13100
Bromosalicylic acid	Acros Organics	AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)	Millipore Sigma	80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)	MP Biomedicals	ICN19400480
Chloroform	Fisher Chemical	C2984
Coating buffer	Abcam	ab210899
Dichloromethane (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Diethyl ether	Fisher Chemical	E1384
Dodeacyl Amine	Acros Organics	AC117665000
Doxorubicin hydrochloride	Fisher BioReagents	BP251610
L-ascorbic acid	Acros Organics	A61 100
Legato 100 Syringe Pump	KD Scientific	14 831 212
mPEG thiol	Laysan Bio	NC0702454
Nonfat dry milk	Andwin Scientific	NC9022655
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Phosphate saline buffer	Fisher BioReagents	BP3991
(Poly(caprolactone)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poly(caprolactone) triol	Acros Organics	AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate	CMTec	280050
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein	Abcam	ab49054
Silver nitrate	Acros Organics	S181 25
Sodium borohydride	Fisher Chemical	S678 10
Tetrachloroauric acid	Fisher Chemical	G54 1
Trehalose	Acros Organics	NC9022655
Triethyl amine	Acros Organics	AC157910010