将激光捕获微切片和微流体qPCR相结合，分析单细胞的转录曲线:阿片类药物依赖的系统生物学方法

摘要

该协议解释了如何使用激光捕获微解剖，以高精度和解剖特异性从杏仁核的中央核收集单个神经元、微胶质和星形细胞。此外，我们解释我们使用微流体RT-qPCR测量这些细胞转录的子集。

摘要

在解剖学相邻的单细胞中，深刻的转录异质性表明，通过细胞表型多样性可以实现强大的组织功能。研究生物系统网络动力学的单细胞实验以生物有意义的分辨率显示细胞和组织对各种条件的响应。在这里，我们解释了我们从解剖学特定位置收集单个细胞的方法，并精确测量其基因表达特征的子集。我们将激光捕获微切切（LCM）与微流体反向转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）相结合。我们还使用这个微流体RT-qPCR平台来测量肠道含量的微生物丰度。

引言

测量单个细胞的基因表达特征已证明组织内具有广泛的球型异质性。这种复杂性使我们对控制组织功能的生物网络的理解复杂化。我们小组和其他人士在许多组织和条件^{1、2、3、4、5、6}中探索了这种现象。这些实验不仅表明基因表达网络的调节是这种异质性的基础，而且单细胞分辨率揭示了组织功能的复杂性，而组织级分辨率却无法理解。事实上，只有一小部分细胞可能对特定条件或挑战做出反应，但这些细胞对整体生理的影响可能很大。此外，将多变量方法应用于来自多个细胞类型和组织的高维数据集的系统生物学方法可以阐明系统范围的处理效果。

我们将 LCM 和微流体 RT-qPCR 相结合，以获得此类数据集。我们在此采用这种方法，与通过荧光活性细胞分拣（FACS）和使用RNA测序（RNA-seq）测量其转录组进行采集单个细胞形成鲜明对比。LCM 优于 FACS 的优点是，单细胞的精确解剖特异性可以通过 LCM 相对和绝对进行记录。此外，虽然RNA-seq可以测量RT-qPCR的更多特性，但微流体RT-qPCR的成本较低，灵敏度和特异性^7.

在这个具有代表性的实验中，我们研究了阿片类药物依赖和纳曲酮沉淀阿片类药物戒断对杏仁核（CeA）和肠道微生物丰度⁴中大鼠神经元、微胶质和星细胞基因表达的影响。分析了四个治疗组:1）安慰剂，2）吗啡，3）纳曲酮，和4）戒断（图1）。我们发现，阿片类药物依赖并没有实质性地改变基因表达，但阿片类药物的退出诱导了炎症基因的表达，尤其是Tnf。星细胞是受影响最大的细胞类型。肠道微生物群受到阿片类药物戒断的深刻影响，这表明血小杆菌与细菌的比降低，这是肠道肌营养不良^8、9的既定标志。

研究方案

这项研究是根据托马斯·杰斐逊大学和德雷塞尔大学医学院动物护理和使用委员会（IACUC）的建议进行的。该协议得到了托马斯·杰斐逊大学和德雷塞尔大学医学院IACUC的批准。

1. 动物模型

1. 在成年雄性斯普拉格-道利大鼠中，插入两个75毫克慢释放的吗啡硫酸盐颗粒或两个安慰剂颗粒。
   1. 适当使用长袍和手套进行小型无菌手术。如有必要，用剪子切碎大鼠的多sum。
   2. 在动物的眼中涂上兽医药膏。用大约20s的西罗拉内吸入麻醉大鼠。麻醉是由意识丧失证实的。
   3. 用珠子消毒钝剪刀在大鼠多香中切口，用珠子消毒探头将真皮从身体壁中分离出来。用珠子消毒钳将颗粒插入真皮下。用无菌针头缝合切口。
      注:整个过程每只大鼠大约需要5分钟。每只老鼠都使用新鲜的无菌手套。
   4. 将大鼠放入隔离笼中，以便术后恢复。检查心跳和常规呼吸节律。观察老鼠，直到意识恢复。评估手术后疼痛。
   5. 评估大鼠8小时后和每12小时后恢复和感染。当大鼠从手术中完全康复时，大约24小时后，将大鼠与其余组人一起关在笼子里。
2. 在6天吗啡暴露后，给G和戒断组注射腹内纳曲酮（75毫克/千克）。
   注:在这个具有代表性的实验中有四个大鼠群（参见图1）。

2. 样品采集

1. 在颗粒插入后 6 天或纳曲酮注射后 24 小时收获大脑。
   1. 将动物放在异氟拉内腔中约30s，或直到失去知觉发生，表示缺乏运动和呼吸速率下降。
   2. 使用尖锐的断头台迅速斩首动物。
   3. 从动物的头骨中挖出大脑。
   4. 使用锋利的手持式剃须刀对被移除的大脑进行以下粗切口:首先，切掉小脑并丢弃。第二，用横向切口将脑干与前脑分离。第三，用中线下垂切口来分析前脑和/或脑干。
   5. 将前脑和脑干放入塑料组织嵌入模具中，在模具底部放置3-4厘米的最佳切割温度化合物（OCT）。用 OCT 覆盖样品的其余部分。
   6. 立即将带有 OCT 样品的塑料组织嵌入模具放入含有干冰和甲醇的浴缸中。不要让甲醇溢出到组织嵌入模具中。将嵌入模具与大脑样品放在甲醇冰浴中，直到组织收集完成（最大约10-15分钟）。
   7. 尽快将大脑样本放入-80°C冰柜中。
2. 同时采集肠道样品。
   1. 快速斩首后，用手术刀在动物的腹部进行中线切口。
   2. 找到cecum并切断其与上升柱的连接。
   3. 将头卡内卡内件挤压到 15 mL 锥形管中。
   4. 立即将锥形管放在干冰上，并尽快放入-80°C冰柜中。
      注:小肠内容物也可以使用与负对照相同的方法收集。

3. 切片

1. 使用冷冻剂切开的大鼠前脑切片。
   1. 从 -80°C 冰柜中取出带前脑的塑料嵌入模具，放入 -20°C 冷冻室。
   2. 从嵌入模具中取出 OCT 嵌入的前脑样品。如有必要，使用剃须刀垂直切割塑料嵌入模具的角。使用 OCT 将前脑安装，用于玫瑰色到冠状冠状切片。
      注:用于识别 CeA 的解剖地标包括光带和纹状终端（图 2B）。当大脑被切成玫瑰色到高卢时，视光带从视基星分支并跟踪背侧。当光学带的形态类似于大鼠脑图集-2.12 mm¹⁰时，可以在显微镜下查看测试切片。光学带和纹状体状形态可以在大鼠脑图集¹⁰中检查，以识别纹状物的bregma以及CeA是否环绕纹状物端子。
   3. 从六分直前脑松香切片10 μm厚的日冕部分，直到达到含有CeA的部分。
      注: 部分的宽度和高度约为 200 mm。
   4. 通过将10μm部分解冻安装在普通玻璃幻灯片上，收集包含 CeA 或首选大脑区域的 10 μm 截面。立即将玻璃滑板放在干冰上的金属盘上。尽快将带大脑部分的幻灯片放入-80°C冰柜中。
      注: 多个切片可以放置在同一张幻灯片上。如果在同一张幻灯片上对切片使用不同的细胞类型染色，则在切片之间留出约 100 mm 的污渍，以便疏水笔可用于在幻灯片上分离特定于细胞类型的抗体溶液。离开切片两侧的幻灯片边缘约 20 mm。

4. 免疫荧光染色

1. 使用免疫荧光染色所选择的脑细胞（如神经元、微胶质、星细胞等）的脑前脑部分。
   1. 从 -80 °C 冰柜中取出一个或多个带有 CeA 部分 10 μm 的幻灯片。
   2. 用75%乙醇固定滑轨30s。取出多余的液体。
   3. 用2%的牛血清抗原（BSA）在1x磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中块 30 s 的切片。用 PBS 清洗 1x。
   4. 在幻灯片中添加一种主要抗体溶液 2 分钟。
      注:主抗体溶液由2%的原抗体、1%的RNase出酶和96%的相同BSA PBS溶液组成，用于上述阻塞步骤（步骤4.1.3）。具有代表性的实验使用了抗NeuN抗体、抗Cd11+抗体和抗GFAP抗体，数量如下:3 μL原物、1.88μLRNA抑制剂和145.12μLBSA溶液。
   5. 将辅助抗体溶液添加到幻灯片 3 分钟。
      注:二次抗体溶液由1 μL山羊抗鼠488nm荧光标记（1:500）、2.5μLRNA抑制剂、1.3μLDAPI（1:10，000）和196.5μL组成，为2%BSA。

5. 乙醇和二甲苯脱水系列

1. 将滑片浸入75%乙醇30s。紧接着，将滑片浸入95%乙醇中30秒。紧接着，将滑片浸入100%乙醇中30秒。紧接着，将滑片浸入含有100%乙醇的第二个容器中30秒。
2. 在乙醇脱水系列之后，将滑片浸入新浇注的二甲苯中 1 分钟。紧接着，将滑片浸入第二容器的二甲苯中 4 分钟。
3. 从二甲苯浴中取出滑轨，让空气在黑暗中干燥 5 分钟。
4. 将滑轨放入干燥器中 5 分钟以进一步干燥。

6. 激光捕获微解剖

1. 如果被染色，请将幻灯片放入显微镜中，并使用解剖地标（即光学角质和纹状物）查找感兴趣的区域 （CeA）。
2. 使用荧光来识别感兴趣的区域中染色细胞类型及其核。如果执行单个单元格池采样，请选择一个单元格或多个单元格。使用 LCM 软件标记感兴趣的单元格。
3. 将 LCM 帽放在感兴趣区域的切片顶部。
4. 使用红外 （IR） 激光的测试镜头来调整红外激光强度、尺寸和持续时间，使 LCM 盖胶粘剂仅在所选单电池的面积上熔化。这可确保除了所选单元格之外，不会收集其他单元格。
   注:在这个具有代表性的实验中，10个相同细胞类型的细胞池被用作单个样本，以限制具有相同处理的样本之间基因表达中的细胞与细胞变异性。但是，该方法可用于真正的单细胞实验^1，3。
5. 选择要收集的单个单元格进行分析，使用 LCM 软件工具（图 2C）。选定的细胞必须位于CeA（或选择的大脑区域）的解剖区域，根据大鼠大脑图集和布雷格玛^10。细胞应至少从相邻的染色核3μm。
6. 发射红外激光以收集标识的单细胞。
7. 将盖放在质量控制 （QC） 站中并查看，以确保仅选择所需的电池。如果其他细胞被错误选择，当盖子留在QC站时，可以使用紫外线激光来摧毁不需要的细胞。
8. 拍摄细胞收集位置的组织部分的照片，以记录其解剖特异性。记录切片与布雷格玛的距离，如果适当使用大鼠脑图集作为参考^10。
9. 从QC站中取出LCM盖，将样品提取装置和移液器5.5μL的液塞缓冲液连接到样品上。
   注:赖解缓冲液由0.5μL的赖解增强剂和5μL的重新悬浮缓冲液组成。
10. 将 ExtracSure 装置安装到 0.5 mL 微离心管上，并在 75°C 下放在热板上 15 分钟。
11. 低速旋转样品和集碎缓冲液30s（0.01-0.02 x g），并将采集的样品放入-80°C冰柜中。

7. 单细胞微流体RT-qPCR

1. 96.96 动态阵列芯片单细胞mRNA预放大
   1. 结合正向和反向mRNA qPCR基因引出剂，用于在底漆池中被测定的所有基因的预扩增（每个引底漆500 nM浓度）。例如，在80μL加120μL的DNA悬浮缓冲液中，1 μL的100μM底漆。
      注:用于代表性实验的引底序列可在奥沙利文等人⁴中找到。
   2. 在新的 96 x 96 PCR 板中，在每个孔中添加 1 μL 5x VILO。
   3. 从储存在-80°C的样品中取出LCM单细胞样品，短暂解冻，以低速（0.01-0.02 x g）短暂离心，并将5.5μL的碎块单细胞样品添加到PCR板中。每个样本都添加到自己的井中。
   4. 将带样品的 PCR 板和 VILO 放入热循环器中，在 65 °C 加热 1.5 分钟。在 4 °C 下以 1，300 x g旋转板 1 分钟，并将板放在冰上。
   5. 将0.15 μL的10xcDNA合成主混合物、0.12μL T4基因32蛋白和0.73μL的DNA悬浮液添加到每口井。
   6. 将 PCR 板放入热循环器中，运行以下协议:25 °C 5 分钟，50 °C 30 分钟，55 °C 25 分钟，60 °C 5 分钟，70°C 10 分钟，4°C 结束。
   7. 在每个井中加入 7.5 μL 的 Taq 聚合酶主混合物。
   8. 将底漆池的1.5 μL（见上文）添加到每个井中。
   9. 将 PCR 板放入热循环器中，并运行以下预放大方案:95 °C 10 分钟，然后是 22 个循环的 96°C，5 秒，60 °C 4 分钟。
   10. 将0.6μL的外生酶I反应缓冲液10倍、1.2μL外生酶I和4.2μL的DNA悬浮液添加到每口井。
   11. 将 PCR 板放入热循环器中，并运行以下协议:37 °C 30 分钟，80 °C 15 分钟。
   12. 在每个井中加入 54 μL 的 TE 缓冲液。在5分钟内将 PCR 板旋转 1，300 x g，如果立即继续下一步，则储存在 4°C 下。如果等待超过 12 小时等待下一步，则储存在 -20°C。
2. 准备 96.96 动态阵列芯片的样品板。
   1. 在新的 96 孔 PCR 板中，将 0.45 μL 的 20 倍 DNA 结合染料和 4.55 μL 的低 ROX 母混合添加到每个孔中。
   2. 在每个孔中加入3μL的预放大样品，以1，300 x g旋转PCR板，然后将板放在冰上。
3. 为 96.96 动态阵列芯片准备测定板。
   1. 在新的 96 井 PCR 板中，在每个孔中加入 3.75 μL 的 2x GE 检测加载试剂和 1.25 μL 的 DNA 悬浮液缓冲液。
   2. 在每个对应的井中加入2.5μL的10μMqPCR底漆。将 PCR 板旋转 1，300 x g 5 分钟。
4. 加载并运行 96.96 动态阵列芯片。
   1. 用控制线液对芯片进行注底。
   2. 将芯片放入国际金融公司控制器 HX 中，并运行 Prime （136X） 脚本。
   3. 将PCR样品板中的样品6μL加入96.96动态阵列芯片中的相应样品孔中。
   4. 将PCR测定板样品的6μL加入96.96动态阵列芯片中的相应检测井中。
   5. 使用针头在 96.96 动态阵列芯片的井中弹出任何气泡。
   6. 将 96.96 动态阵列芯片放入 IFC 控制器 HX 并运行负载混合 （136x） 脚本。
   7. 从 IFC 控制器 HX 上取下芯片，剥去保护贴纸，并将 96.96 动态阵列芯片放入微流体 RT-qPCR 平台。运行 GE 快速 96 x 96 PCR 协议（30 个周期）。
      注:通过多种方法评估结果的RNA质量和有效性，包括通过凝胶电泳进行测定验证、熔融温度曲线、样品和测定复制以及标准稀释系列图。此外，转录结果可以通过大脑反流的独立方法（包括西式斑点和免疫荧光测定）进行验证。

8. 用微流体RT-qPCR测量细菌丰度

1. 按照粪便DNA提取试剂盒的指示提取细菌DNA。
2. 使用qPCR估计细菌DNA浓度。
3. 将提取的细菌DNA添加到新的PCR板中。加入1 μL提取的细菌DNA和9μL的DNA悬浮液。
4. 准备 48.48 动态阵列芯片的测定板（参见步骤 7.2.1-7.2.2）
5. 准备 48.48 动态阵列芯片的样品板（参见步骤 7.3.1-7.3.2）
   1. 在新的 96 孔 PCR 板中，将 0.45 μL 的 20 倍 DNA 结合染料和 4.55 μL 的低 ROX 母混合添加到 48 口井中。
   2. 从含有细菌DNA的PCR板中加入3μL样品到48口井中，以1，300 x g旋转PCR板5分钟。储存在4°C。
6. 加载并运行 48.48 动态阵列芯片（请参阅步骤 7.4.1-7.4.7）。

结果

单细胞的选择在视觉和分子上都得到了验证。从视觉上看，细胞形态在细胞采集之前被查看。然后，在QC站观察采集的细胞，细胞核染色（DAPI）与单细胞选择标记荧光重叠。图 2A显示了包含 CeA 的缺鼠前脑的幻灯片的代表性图像。后续图像 （图 2B-D） 显示了单细胞的选择及其从组织中取出进行转录分析...

讨论

单细胞生物学证明了细胞表型的异质性和组织功能的鲁棒性。这些发现使人们对宏观和微观尺度生物系统的组织提供了见解。在这里，我们描述了两种方法的组合，LCM和微流体qPCR，以获得单细胞转录测量，提供解剖特异性和转录精度在相对较低的成本（图1）。我们小组采用系统生物学方法，经常测量同一动物中的多个组织。我们认为这些方法在确定生物系统在转录一级如?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000802-R	NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-48.48	NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-Cd11β Antibody	Genway Biotech	CCEC48	Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System	Arcturus	NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	11753500	Lysis buffer solution components
DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Sample Extraction Device	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube	ThermoFisher Scientific	N8010611
GFAP Monoclonal Antibody	ThermoFisher Scientific	A-21294	Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A28175	Seconadry Antibody
IFC Controller	Fluidigm	NA	NA
RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher Scientific	11754250	Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein	New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
TaqMan PreAmp Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA