从高致病性H5N1病毒和禽流感病毒中生产含有包络糖蛋白的高蒂特感染性流感伪型颗粒

摘要

该协议描述了一个实验过程，以产生高蒂特传染性病毒伪型颗粒（pp），包络糖蛋白从两个流感A毒株，以及如何确定其传染性。该协议具有很强的适应性，可开发具有不同包络糖蛋白的任何其他类型的包络病毒的pps。

摘要

H5N1型禽流感病毒（H5N1）和H7N9偶尔直接传染给人类及其杀伤力，是严重的公共卫生问题，表明有可能发生疫情。然而，我们对病毒的分子理解还很原始，有必要研究其包络蛋白作为治疗靶点的生物特性，并制定控制感染的策略。我们开发了一个固体病毒伪型颗粒（pp）平台来研究禽流感病毒，包括其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）包络糖蛋白的功能分析，HA和NA的重组特性，受体，营养，中和抗体，诊断，感染，用于药物开发和疫苗设计。在这里，我们描述了一个实验程序，以建立从两种甲型流感菌株（HAPI H5N1和2013年禽流感H7N9）的包络糖蛋白（HA，NA）的pps。他们的一代是基于一些病毒的能力，如鼠白血病病毒（MLV），将包络糖蛋白纳入一个pp。此外，我们还详细介绍了这些 pps 如何用 RT-qPCR 进行量化，以及根据 HA 和 NA 的来源对原生病毒和不匹配病毒 pp 的感染性检测。该系统是高度灵活和适应性强，可用于建立病毒pps与包络糖蛋白，可以纳入任何其他类型的包络病毒。因此，该病毒粒子平台可用于研究野生病毒的许多研究。

引言

病毒粒子的使命是将其基因组从受感染的宿主细胞输送到未受感染的宿主细胞，并将其以具有复制能力的形式¹的形式输送到细胞质或细胞核中。这个过程最初由结合到宿主细胞受体触发，然后是病毒和细胞膜的融合。对于包络病毒，如流感病毒，尖峰糖蛋白负责受体结合和融合^1，2。病毒包络糖蛋白（例如，热原、抗原）涉及许多重要特性和事件，如病毒生命周期启动（结合和融合）、病毒发病机制、免疫原性、宿主细胞凋亡和细胞代谢、细胞内分泌途径以及物种间传播和重组^{1、3、4、5、6、7。}研究病毒包络糖蛋白将有助于我们了解病毒感染过程的许多方面。伪型病毒粒子（pp），也称为伪病毒或伪粒子，可以通过伪打字技术^8，9，10生成。这项技术已用于开发多种病毒的伪型颗粒，包括丙型肝炎^11、12、乙型肝炎^13、脉体口腔炎病毒（VSV）14、15和流感病毒16、17、18、19。该技术基于慢病毒或其他逆转录病毒的Gag-Pol蛋白。

假型病毒颗粒可以通过将病毒包络糖蛋白表达质粒、缺少包络基因的抗逆转录病毒包装质粒和单独的报告质粒转化为pp生产者细胞，从而获得三质粒系统。逆转录病毒由Gag蛋白组装而成，它从表达病毒包络蛋白¹的受感染细胞膜中发芽。因此，利用逆转录病毒Gag蛋白在表达流感HA和NA的细胞膜上产生芽是可能的。在我们以前的研究中，所有组合中的HAs/NA都是功能性的，能够在病毒生命周期^{16、17、18、20、21}中执行相应的功能。这些pps用于研究流感生物特性，包括血凝、神经氨酸酶活性、HA受体结合对流和传染性。由于HA和NA都是病毒生命周期中重要的表面功能蛋白，从不同流感毒株衍生的不匹配的HA和NA可以部分地证明它们之间的重组。在这里，我们通过使用三个质粒伪型粒系统组合两个HA和两个NA（源自HPAI H5N1病毒株和H7N9染色）来生成八种类型的流感pps。这八种类型的pps包括两个原生pps，H5N1pp，H7N9pp;两个不匹配的 pps，（H5_N9）pp，（H7+N1）pp;和4pps只含有单糖蛋白（HA或NA），H5pp，N1pp，H7pp，N9pp。所有野生流感病毒株的研究都应在生物安全3级（BSL-3）实验室进行。伪型病毒颗粒技术可用于在生物安全级别 2 （BSL-2） 设置中包装人工病毒。因此，pps 是研究流感病毒过程的一个更安全和有用的工具，具体取决于其两种主要糖蛋白:血凝素 （HA） 和神经氨酸酶 （NA）。

该协议描述了这些pps的生成与三质粒共转染策略（在图1概述），如何量化pps和感染性检测。pp生产涉及三种质粒（图1）。编码逆转录病毒Gag-Pol蛋白的gag-pol基因从逆转录病毒包装试剂盒中克隆，并插入pcDNA 3.1质粒，并命名为pcDNA-Gag-Pol。编码绿色荧光蛋白的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因从pTRE-EGFP载体克隆，插入pcDNA 3.1质粒，称为pcDNA-GFP。在克隆过程中，通过引信添加包装信号（*）序列。HA和NA基因被克隆成pVRC质粒，分别命名为pVRC-HA和pVRC-NA。最后一个质粒编码融合蛋白，可以替换为任何其他感兴趣的融合蛋白。我们的伪打字平台包括两个糖蛋白表达质粒:pVRC-HA和pVRC-NA。这可以简化在BSL-2设置中不同病毒株之间的重新分类研究。

研究方案

1. 第1天:细胞培养和播种

1. 在 60 mm 培养的 60 mm 培养皿中培养人类胚胎肾 （HEK） 293T/17 细胞，使用 Dulbeco 的改性必需介质 （DMEM） 辅以 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 100 U/mL 青霉素-链霉素 （DMEM 完整介质， DCM） 在 37°C， 5% 二氧化碳 （CO₂） 培养箱中，直到约 80% 的汇合。
   注:建议使用HEK 293T/17低通道单元。
2. 用5 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）1x小心清洗细胞。
   注:HEK 293T/17 单元的手动处理必须非常温和，因为它们很容易分离。
3. 去除PBS，用1mL 0.25%胰蛋白酶-乙烯二乙胺四乙酸（EDTA）溶液分离细胞。将培养皿置于37°C、5%CO2培养箱中不超过5分钟，直到细胞分离。
4. 通过添加 5 mL 的 DCM 来停用胰蛋白酶。通过上下多次移液，将细胞分散到单细胞悬浮液中。
5. 将细胞悬浮液转移到预冷却的15 mL离心管中。在4°C下以250 x g离心收集细胞5分钟。
6. 尽可能多地去上清。用 6 mL 的 DCM 培养基重新悬浮细胞颗粒并计数细胞。使用 DCM 培养基将细胞稀释至 1 x 10⁶细胞/mL。
7. 将细胞播种到6孔板中，每孔细胞悬浮液为1 mL。轻轻拍打板，均匀地分配细胞。在37°C，5%CO2培养箱中孵育板过夜（14-16小时）。

2. 第2天:利波菲特介导的四粒体共发性

1. 在倒置光显微镜下检查细胞形态和密度。理想情况下，细胞在转染时应约85%的结对。用每孔1mL无血清DMEM培养基替换培养基，然后将板放回培养箱。
   注:HEK 293T/17 单元的手动处理必须非常温和，因为它们很容易分离。
2. 对于要转染的每个培养细胞，将转染试剂的8μL稀释至150μL的体积，并带有减少血清介质（管1）。在室温（RT，约20°C）下轻轻混合并孵育5分钟。
   注:对于每个转染样品，准备两个编号为1和2的1.5 mL微离心管。
3. 在管2中，将2.5μg的质粒DNA稀释成150μL的减量血清培养基。
   注:在管2中，稀释每个质粒DNA，如表1所示。质粒编码囊泡性口腔炎病毒（VSV）G糖蛋白（质粒pLP-VSVG）被用作阳性对照，因为VSV能够感染广泛的细胞范围。缺乏流感包络糖蛋白（μenv pps）的阴性控制颗粒是使用pcDNA-Gag-Pol和pcDNA-GFP质粒产生的。
4. 孵化5分钟后，将稀释后的DNA与稀释的转染试剂结合。轻轻混合，在RT再孵育15分钟。
5. 将DNA-脂质复合物添加到含有细胞和无血清培养基的相应井中。通过来回摇动板轻轻混合。
6. 在37°C、5%CO2培养箱中孵育4~6小时后，取出培养基，用2 mL的DMEM代替。在37°C，5%CO2培养箱中孵育另外36~48小时。
   注:替换为无血清和无抗体的DMEM。在此协议中，可以使用两个 HA 和两个 NA 生成八种类型的 pps（如表 1所示）。

3. 第3天:易感细胞播种

1. 对于感染性测定，在96孔盘中，将每种类型的易感细胞分1×10⁴细胞。
   注:使用两种类型的靶细胞执行本文中的感染性测定:阿尔韦拉尔衍生的人类细胞系（A549细胞）和马丁-达比白条肾（MDCK）细胞。MDCK细胞广泛用于流感研究，可以很好地控制。此步骤是灵活的。可根据研究要求使用任何其他目标细胞系。
2. 在37°C，5%CO2培养箱中孵育板过夜（14-16小时）。

4. 第4天:伪型病毒颗粒收集、定量和感染性测定

1. 伪型病毒粒子集合
   1. 检查介质的颜色。理想情况下，它应该是浅粉色或略橙色。在 440–460 nm 下使用倒置荧光生物显微镜检查细胞。
   2. 在36~48h转染后，通过0.45 μm聚烯酰胺（PVDF）膜过滤器，通过消除细胞碎片来收获pps。
   3. 将 pps 划分为小体积等分。
   4. 将 pps 储存在 -80 °C。
      注: 可以在此处暂停该协议。然而，这是不鼓励的，因为在冷冻和解冻后，pps的传染性将急剧下降。
2. 伪型病毒颗粒定量
   1. 将 20 μL 的纯化 pps 转移到 1.5 mL 无核糖核酸 （RNase） 的微离心管中。
   2. 加入1 μL 0.24 U/mL苯甲酸酶。在37°C孵育1小时，消除任何DNA和RNA污染。
      注:靶RNA，通常降调控的巨细胞病毒（CMV）-GFPRNA，包装在pps中，可以避免苯甲酸酶核酸化降解。
   3. 将样品冷冻在-70°C，使苯酶核酸酶灭活。
   4. 加入2μL蛋白酶K.在50°C孵育30分钟，以消化包络蛋白并释放CMV-GFPRNA。在100°C处使蛋白酶K灭活3分钟。
   5. 使用通用探头一步式RT-qPCR套件，使用前引物5'-AACAAAGCTGGCTCTTTT-3'、反向引物5'-GGGTCTCAGATGATATAC-3'和探头，通过实时定量逆转录（qRT）-PCR量化pps5'-FAM-CCCCCAAAAAAAGACACACAC-TAM-3'，在实时PCR热循环器上。在感染前使RNA拷贝数的pps正常化。
3. 感染性测定
   1. 根据 qRT-PCR 数据将每种类型的 pps 稀释到 4 x 10⁵个副本/mL（pp 规范化）。
   2. 将托西-苯丙氨酸氯甲基-酮（TPCK）-胰蛋白酶添加到含有H7N9 HA的pps中，最终浓度为40微克/mL。在37°C孵育1小时，形成其功能亚单位HA1和HA2。
      注: 没有必要用TPCK-胰蛋白酶处理含有H5的pps，因为它们在HA1-HA2裂解部位有多个精氨酸和裂解残留物。这个多基本裂解位点可以通过无处不在的细胞蛋白酶切割。
   3. 以 1:1 的比例（体积/体积）将标准化 pp 与 DMEM 培养基（无血清）混合。
   4. 将含有易感细胞的板带到生物安全柜。
   5. 吸出上清液，用0.1 mL的预预热PBS清洗细胞一次。
   6. 将 0.1 mL 的 pps-DMEM 混合物添加到一口井中。将每种类型的pps的感染性测试三次到一个易感细胞系（图2概述）。
   7. 在 37°C、5% CO₂培养箱中孵育 96 孔板 4~6 小时。
   8. 吸气上清液，用 0.1 mL 的 DCM 替换。
   9. 在 37°C、5% CO₂培养箱中孵育 96 孔板，再育成 24-36 小时。

5. 第5天或第6天:感染性检测

1. 将 96 孔板带到生物安全柜中。
2. 吸出上清液，用0.2 mL的预预热PBS清洗细胞1x。
3. 用0.1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液去除PBS并分离细胞。
4. 将培养皿置于37°C，5%CO2培养箱中3分钟，直到细胞分离。
   注意:避免孵育超过5分钟，因为这将导致细胞结块。
5. 通过添加 0.4 mL 的 DCM 来停用胰蛋白酶。
6. 通过上下移液几次，将细胞分散到单细胞悬浮液中。
7. 将细胞悬浮液转移到冷冻的1.5 mL微离心管中。
8. 使用荧光活化细胞分拣 （FACS） 确定 GFP 报告报阳性细胞。
   注:要确定GFP报告阳性靶细胞的比例，请使用对照样本（pps-未经处理的A549细胞或MDCK细胞）设置流细胞仪门，然后计算每个样本10，000个细胞的GFP报告阳性细胞。

结果

根据上述一般程序，我们生成了 10 种类型的 pps，结合两组 HA/NA 或 VSV-G 糖蛋白或无包络糖蛋白（如表 1所示）。其中七种具有传染性。含有无包络糖蛋白或仅含有NA的pps在这里没有表现出任何感染力。图1概述了流感pp的生产工艺。pps的透射电子显微图（例如，H5N1pp）如图3所示。这些pps的传染性测定结果如图4所示。七?...

讨论

在此协议中，我们描述了在BSL-2设置下产生流感病毒伪型颗粒（pp）的方法。报告员质粒 pcDNA-GFP 被合并到 pps 中，可用于在感染性测定中通过 FACS 对 pps 进行量化。我们选择了两种类型的易感细胞系，因为它们在流感研究中被广泛使用。MDCK细胞将很好地控制这些研究中使用的可变永生的人类细胞。

该协议基于逆转录病毒MLV，它可以合并GFP报告器，并在细胞膜上产生芽。这项技...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Millipore	70664	Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)	Corning	3599	Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)	Costar	3516	Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)	Gibco	11965092	A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum	Excell	FND500	fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)	Beckman coulter	cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells	ATCC	CRL-11268	A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope	Olympus	BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope	Olympus	CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019	Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit	NEB	E3006L	Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	ATCC	CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Axygen	MCT-150-C	33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF	Millipore	SLHV033RS	an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058021	The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	430791	a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K	Beyotime	ST532	Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm)	Corning	430166	Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin	Sigma	T1426	This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056