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摘要

本文介绍了评估皮洛卡平诱导癫痫小鼠记忆损伤的实验程序。该协议可用于研究癫痫相关认知衰退的病理生理学机制，这是癫痫最常见的合并症之一。

摘要

认知障碍是叶癫痫最常见的合并症之一。为了在癫痫动物模型中重述癫痫相关认知衰退，我们产生了由皮洛卡平治疗的慢性癫痫小鼠。我们使用这些癫痫小鼠为三种不同的行为测试提供了一个协议:新对象位置 （NL）、新对象识别 （NO） 和模式分离 （PS） 测试，分别用于评估地点、对象和上下文的学习和记忆。我们解释了如何在运动场测试后，为NL、NO和PS测试设置行为装置并提供实验程序，该测试测量动物的基底运动活动。我们还描述了NL、NO和PS测试在评估癫痫小鼠记忆功能的其他行为测试方面的技术优势。最后，我们讨论了癫痫小鼠在熟悉会话期间未能与物体进行良好接触的可能原因和解决方案，这是成功进行记忆测试的关键步骤。因此，该协议提供了有关如何使用小鼠评估癫痫相关记忆损伤的详细信息。NL、NO 和 PS 测试简单、高效的检测，适用于评估癫痫小鼠中不同类型的记忆。

引言

癫痫是一种慢性疾病，其特征是自发性复发性发作11、2、3。2,3由于重复性癫痫发作可引起大脑11、2、32,3的结构和功能异常，异常发作活动可引起认知功能障碍，这是最常见的癫痫相关合并症4,4、5、6。,6与慢性癫痫发作事件相反，这些发作是短暂的和短暂的，认知障碍会持续到癫痫患者的生活中，从而恶化他们的生活质量。因此，了解癫痫相关认知衰退的病理生理学机制非常重要。

各种癫痫实验动物模型被用来证明与慢性癫痫相关的学习和记忆缺陷787，8，9，10，11，12。,9,10,11,12,例如，莫里斯水迷宫、上下文恐惧调理、孔板、新型物体位置（NL）和新颖的物体识别（NO）测试经常被用来评估叶癫痫（TLE）的记忆功能障碍。由于海马是TLE显示病理学的主要区域之一，因此通常优先选择能够评估海马依赖记忆功能的行为测试。然而，鉴于癫痫发作可以诱发异常海马神经发生，并促成癫痫相关认知衰退10，测试变性新生儿神经元功能的行为范式（即空间模式分离，PS）8，13也可以提供有关癫痫记忆损伤细胞机制8,13的宝贵信息。

在本文中，我们演示了针对癫痫小鼠的一组内存测试 NL、NO 和 PS。测试简单且易于访问，不需要复杂的系统。

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研究方案

所有实验程序均经韩国天主教大学伦理委员会批准，并根据《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号）进行。

1. 新颖对象位置测试 （NL）

  1. 在皮洛卡平注射4-6周后准备癫痫C57BL/6或转基因小鼠。
    注:急性癫痫发作是由腹内（IP）皮洛卡平注射引起的，遵循我们上次报告14中详述的协议。
  2. 在行为测试开始前一天，将癫痫小鼠从繁殖室转移到行为室。让老鼠在一夜之间习惯至少12小时。
  3. 在行为室里，将单个小鼠分成新的笼子，用于单壳体。将每个动物的信息写在笼子卡片上，并在行为测试中将动物放在同一个笼子里。多个笼子可以使用推车同时传输。
  4. 第二天，在清晨开始3天的居住课程（H1+H3）。使动物在家庭笼子里的光线不足30分钟。
  5. 准备外尺寸为 44 x 44 x 31 厘米、内部尺寸为 43 x 43 x 30.5 厘米的开放场箱。在习惯（H1）的第 1 天，在开放场框的中心放置一个照明计，并将照度调整到 60 勒克斯。
  6. 用70%乙醇喷洒露天盒子的地板和墙壁，并用干净的纸巾擦拭，以去除可能的嗅觉线索。然后等待至少1分钟，直到残留酒精完全干燥。
  7. 通过执行开放场测试来评估每只鼠标的运动活动。
    1. 要记录和跟踪每个实验鼠标的行为，请使用动物行为视频跟踪软件（参见材料表）。
    2. 打开视频跟踪软件后，校准打开字段框的大小。然后，设置用于跟踪的区域。设置 3 秒的延迟和 15 分钟的采集时间，以避免跟踪实验者的手。插入有关每个实验鼠标的信息（组、性别、年龄等）。
    3. 然后，轻轻地将实验鼠标放在面向墙壁的开放式盒子中。为此，将其放在笼子盖上，以尽量减少处理相关的压力和焦虑。然后，释放鼠标靠近开放字段框的墙，该鼠标距离对象在熟悉会话期间最远的位置（步骤 1.9.3）。
      注:一旦鼠标在开放字段框中，鼠标跟踪软件将自动检测到它并开始录制。为了对探索进行最佳跟踪，摄像机可以放置在开放字段框的正上方。
    4. 录音15分钟后，将动物放在笼子盖上，将动物送回其家庭笼子。用 70% 乙醇喷雾清洁开场盒，并在试验之间用干净的纸巾擦拭。恢复明亮的光线，并根据制造商的说明使用视频跟踪软件测量动物移动的总距离。
      1. 打开视频跟踪软件和视频剪辑。然后，单击"分析"以基于开放字段框大小的校准计算移动的总距离。
  8. 在第 2 天和第 3 天，通过重复步骤 1.3 到 1.7 来执行习惯会话（H2、H3）。
  9. 在第 4 天，执行熟悉会话 （F1）。
    1. 在昏暗的灯光下，将每只鼠标放在空旷的字段中 3 分钟。短暂康复后，将动物送回其家笼。
    2. 在居住过程中，用70%乙醇彻底清洁物体，并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟，让残留的酒精完全干燥。
    3. 将两个相同的物体（橡胶娃娃，物体A）放置在离相邻墙壁 5 厘米的露天竞技场中。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标引入开放式盒子，面朝离物体最远的墙。
    4. 允许免费探索 20 分钟，并手动测量使用两个秒表探索两个物体所花费的时间。一旦鼠标达到两个物体的最小探测时间（30秒），停止F1会话，并将动物转移到其家庭笼子。如果鼠标在 20 分钟内无法浏览对象 30 秒，请从打开的字段框中删除鼠标，并将其从其他会话中排除。
    5. 将动物从开放式盒子中取出后，用 70% 乙醇喷雾彻底清洁盒子的地板和墙壁，并用纸巾将其擦拭。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为（如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止）量化为探索时间。
  10. 第 5 天，执行 NL 测试会话。
    1. 将鼠标从家庭笼子转移到开阔的田间区域进行 3 分钟的康复。然后把动物送回家里的笼子里。
    2. 在居住过程中，用70%乙醇彻底清洁物体，并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟，让残留的酒精完全干燥。
    3. 将一个物体（橡胶娃娃、对象 A）移到对角线位置，距离相邻墙壁 5 厘米。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标放在笼盖上，转移到开阔的场区，并朝向开放场箱的墙。
      注: 平衡移动的对象的位置，以减少对特定方向的任何潜在固有偏好。例如，从一半的实验动物的熟悉会话更改首选对象的位置，对于其余动物，从熟悉会话中移动不太首选的对象。
    4. 使用视频跟踪系统免费浏览和录制 10 分钟。使用两个秒表测量每个对象探索每个对象所花费的时间，并将歧视比率计算为
      figure-protocol-2159
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为（如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止）量化为探索时间。
    5. 抓住实验鼠的尾巴，放在笼子盖上，转移到笼子里。3天（第6-8天），让鼠标休息，免费获得食物和水。
    6. 一旦动物从开放式的盒子中取出，用70%乙醇喷雾彻底清洁盒子的地板和墙壁，并用纸巾擦拭。

2. 新颖对象识别测试（NO）

  1. 第 9 天，通过重复步骤 1.2_1.7 执行 15 分钟的习惯会话。
  2. 在第 10 天，执行熟悉会话 （F1）。
    1. 在昏暗的灯光下，将鼠标放在空旷区域 3 分钟。将鼠标康复到开阔场地区域后，暂时将其送回其主笼。
    2. 在居住过程中，用70%乙醇彻底清洁物体，并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟，让残留的酒精完全干燥。
    3. 将两个相同的物体（50 mL塑料管装满40 mL的水，物体B）放置在离相邻墙壁5厘米的空地上。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标引入离物体最远的墙面的开放式盒子中。
    4. 由于动物暴露在NO测试中的两个不同的物体（50 mL塑料管，装满40mL的水，物体B;玻璃Coplin罐，物体C），在F1会话期间平衡物体。例如，为组中一半的动物呈现两个相同的对象（玻璃 Coplin 罐，对象 C）。
    5. 允许免费探索 20 分钟，并手动测量使用两个秒表探索两个物体所花费的时间。一旦鼠标达到两个物体的最小探测时间（30秒），停止F1会话，并将动物转移到其家庭笼子。如果鼠标在 20 分钟内无法浏览对象 30 秒，请将其从打开的字段框中删除，并将其从其他会话中排除。
    6. 将动物从开放式盒子中取出后，用 70% 乙醇喷雾彻底清洁盒子的地板和墙壁，并用纸巾将其擦拭。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为（如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止）量化为探索时间。
  3. 第二天（第11天），执行无测试会话。
    1. 将鼠标从家庭笼子转移到露天进行3分钟的康复，然后将老鼠送回其家庭笼子。
    2. 在居住过程中，用70%乙醇彻底清洁物体，并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟，让残留的酒精完全干燥。
    3. 将一个物体（50 mL塑料管装满40 mL的水，物体B）替换为另一个物体（玻璃Coplin罐，物体C）距离相邻墙壁5厘米。使用双面胶带修复对象。将笼子盖上的实验鼠标转移到开阔的田地，然后朝墙放置。平衡 NO 测试期间一起呈现的对象。例如，将一个玻璃 Coplin 罐（对象 C）替换为一个 50 mL 塑料管，该塑料管填充了 40 mL 的水（对象 B），用于在熟悉会话期间接触两个玻璃 Coplin 罐（对象 C）的小鼠。
      注: 也可以对替换的对象的位置进行平衡，以减少特定方向的潜在与生俱来的偏好。例如，对于暴露于两个对象集（对象 B 或对象 C）的每个动物组，更改一半实验动物的熟悉会话中的首选对象，对于其余动物，替换在熟悉会话中不太喜欢的对象。
    4. 允许 10 分钟的免费探索，并使用视频跟踪系统进行录制。使用两个秒表测量每个对象探索每个对象所花费的时间，并计算歧视比率。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为（如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止）量化为探索时间。
    5. 抓住实验鼠的尾巴，放在笼子盖上，转移到笼子里。3天（第12~14天），让鼠标休息，免费获得食物和水。
    6. 一旦动物从开放现场箱中取出，用70%乙醇喷雾彻底清洁露天盒子的地板和墙壁，并用纸巾擦拭。

3. 模式分离测试（PS）

  1. 第 15 天，为 PS 测试执行第一个熟悉会话 （F1）。
    1. 将鼠标从主笼转移到开阔的田地进行3分钟的康复，然后将其送回其家庭笼子。
    2. 在居住过程中，用70%乙醇彻底清洁物体和网格化地板，并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟，让残留的酒精完全干燥。
    3. 将带有宽网格（5.5 x 5.5 厘米）的底板（42.5 x 42.5 x 0.5 厘米）放在开放场框中，并将两个相同的物体（装满 50 mL 水的塑料 T 瓶，对象 D）放置在离相邻墙壁 5 厘米的露天。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标引入离物体最远的墙面的开放式盒子中。
    4. 由于动物在PS测试中暴露于两个不同的物体（塑料T瓶装满50 mL的水，物体D;玻璃瓶，物体E），在F1和F2会话期间平衡物体。例如，在宽网格地板上为组中一半的动物呈现两个相同的对象（玻璃瓶、对象 E）。
    5. 允许免费探索 20 分钟，并使用两个秒表手动测量两个对象探索所花费的时间。一旦鼠标达到两个物体的最小探测时间总计 （30 s），停止 F1 会话并将动物转移到其家庭笼子。如果鼠标在 20 分钟内无法浏览对象 30 秒，请将其从打开的字段框中删除，并将其从其他会话中排除。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为（如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止）量化为探索时间。
    6. 完成第一次熟悉会话 （F1） 后，使用 70% 乙醇喷雾彻底清洁物体和地板，并将其从开放式现场箱中取出。
  2. 第二天（第 16 天），执行 PS 测试的第二个熟悉会话 （F2）。
    1. 将鼠标从家庭笼子转移到开阔的田地进行3分钟的康复，然后将老鼠送回其家庭笼子。
    2. 在居住过程中，用70%乙醇彻底清洁物体和网格化地板，并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟，让残留的酒精完全干燥。
    3. 将带窄网（2.75 x 2.75 厘米）的底板（42.5 x 42.5 x 0.5 厘米）放在开放场框中，并将两个相同的物体（玻璃瓶、物体 E）放置在离相邻墙壁 5 厘米的开阔字段中。使用双面胶带修复对象。将实验鼠标引入离物体最远的墙面的开放式盒子中。
    4. 对于平衡，在狭窄的网格地板上呈现两个相同的物体（塑料T瓶填充50 mL的水，物体D）。
    5. 允许免费探索 20 分钟，并手动测量使用两个秒表探索两个物体所花费的时间。一旦鼠标达到两个物体的最小探测时间总计 （30 s），停止 F2 会话并将动物转移到其家庭笼子。如果鼠标在 20 分钟内无法浏览对象 30 秒，请将其从打开的字段框中删除，并将其从其他会话中排除。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为（如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止）量化为探索时间。
    6. 完成第二次熟悉会话 （F2） 后，使用 70% 乙醇喷雾彻底清洁物体和地板，并将其从开放式现场箱中取出。
  3. 第二天（第17天），执行PS测试会话。
    1. 将鼠标从主笼转移到开阔的田地进行3分钟的康复，然后将其送回其家庭笼子。
    2. 在居住过程中，用70%乙醇彻底清洁物体和网格化地板，并用纸巾擦拭。等待至少 1 分钟，让残留的酒精完全干燥。
    3. 将窄网格（2.75 x 2.75 厘米）的地板放在开放式盒子中，并将两个不同的物体（装满 50 mL 的水的塑料 T 瓶、物体 D、玻璃瓶、物体 E）放置在离相邻墙壁 5 厘米远的地板上。使用双面胶带修复对象。将笼盖上的实验鼠标转移到开阔的田间区域，并将其置于墙面上。
    4. 平衡 PS 测试期间一起呈现的对象。例如，将每个对象（对象 D、对象 E）放置在窄网格地板上，以使对象 E 成为此上下文中的新对象。还可以对对象 D 或对象 E 的位置（窄地板图案上的新对象）的位置进行平衡，以减少对特定方向的先天偏好的可能性。例如，替换实验动物第二个熟悉会话中的首选对象，对于其余动物，替换第二个熟悉会话中不太首选的对象。
    5. 使用视频跟踪系统免费浏览和录制 10 分钟。使用两个秒表测量每个对象探索每个对象所花费的时间，并计算歧视比率。
      注:测量鼠标用胡须、鼻塞或前爪触摸物体的时间。不要将动物的鼻圈不指向对象的任何行为（如坐在对象、通过对象或后端指向对象时静止）量化为探索时间。
    6. 抓住实验鼠的尾巴，放在笼子盖上，转移到笼子里。

4. 克里西尔紫色染色

  1. 完成所有行为测试后，通过注射一种鸡尾酒（4:0.5）氯胺酮（50mg/mL）和锡拉辛（23.3毫克/米）在盐水中溶解，以110 mL/kg体重（IP;1 mL注射器;26 G针）为动物麻醉。检查因对脚趾捏缺乏反应而麻醉的深度。
  2. 一旦动物被深度麻醉，进行转体灌注与4%的副甲醛，以修复大脑15。
  3. 转盘灌注完成后，用一把剪刀将动物斩首15。然后，用一把虹膜剪刀取出头骨，露出大脑。分离后，在4%的副甲醛中过夜后修复，随后在0.01M磷酸盐缓冲盐水中冷冻保护30%蔗糖。
  4. 使用冷冻剂从卡扣冷冻的大脑制作日冕部分（30 μm）。
  5. 将脑组织安装在幻灯片上，通过连续洗涤3分钟，依次为100%、95%、90%、80%、70%乙醇，执行从100%乙醇到自来水的一系列水化步骤。
  6. 在0.1%的克里西尔紫罗兰溶液中孵育组织幻灯片15分钟。
  7. 将组织滑片浸入 95% 乙醇/0.1% 的冰醋酸中，然后用 100% 乙醇、50% 乙醇/50% 二甲苯和 100% 二甲苯溶液使组织脱水，从而去除过多的污渍。
  8. 使用市售的二甲苯安装介质盖住组织幻灯片。

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结果

图1显示了评估认知功能的一般实验时间表和设置。在引入皮洛卡平引起的急性癫痫发作六周后，小鼠接受NL、NO和PS测试，按该顺序在测试之间间隔3天休息期（图1A）。对于 NL 测试，在熟悉会话 （F1） 期间，两个相同的对象放置在开放字段中，第二天，一个对象移动到新位置。在 NO 测试中，一个对象在测试会话期间被替换为新对象。对于 PS 测试，两?...

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讨论

本研究描述了评估慢性癫痫小鼠认知功能的实验程序。许多不同的行为测试范式用于评估小鼠18中的学习和记忆功能。莫里斯水迷宫、径向臂迷宫、Y迷宫、上下文恐惧调节和基于对象的测试是最常用的行为测试，并提供可靠的结果。其中，NL、NO和PS测试是评价癫痫小鼠,8、10学习和记忆的有效、简单的方法。8由于癫痫小鼠在行为过程中...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢李杰敏博士的技术支持。这项工作得到了韩国政府资助的韩国国家研究基金会（NRF-2019R1A2C1003958，NRF-2019K2A9A2A2A08000167）的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml syringeSung-shimUse with the 26 or 30 gauge needle
70% EthanolDuksanUN1170Spray to clean the box and objects
black curtainFor avoiding unnecessary visual cues
Cresyl violetSigmaC5042For Cresyl violet staining
cryotomeLeicaE21040041For tissue sectioning
double-sided sticky tapeFor the firm placement of the objects
DPX mounting mediumSigma06522
ethanol seriesDuksanUN1170Make 100%, 95%, 90%, 80%, 70% ethanol solutions
floor plate with narrow grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 2.75 x 2.75 cm
floor plate with wide grid patternsLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, plate size: 42.5 x 42.5 x 0.5 cm, grid size: 5.5 x 5.5 cm
illuminometerTES Electrical Electronic Corp.1334AFor the measurement of the room lighting (60 Lux)
Intensive care unitThermocare#W-1
ketamine hydrochlorideYuhan7003Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
LED lampLungoP13A-0422-WW-04Lighting for the behavioral test room
objectsRubber doll, 50 ml plastic tube, glass Coplin jar, plastic T-flask, glass bottle
open field boxLeehyo-bioBehavioral experiment equipment, size: 44 x 44 x 31 cm
paper towelYuhan-Kimberly47201Use to dry open field box and objects
paraformaldehydeMerck Millipore104005Make 4% solution
pilocarpine hydrochlorideSigmaP6503
rulerUse to locate the objects in the open field box
scopolamine methyl nitrateSigmaS2250Make 10X stock
Smart system 3.0PanlabVideo tracking system
stopwatchJunsoJS-307For the measurement of explorative activities of mice
sucroseSigmaS9378For cryoprotection of tissue sections
terbutaline hemisulfate saltSigmaT2528Make 10X stock
video camera (CCD camera)VisionVCE56HQ-12Place the camera directly overhead of the open field box
xylazine (Rompun)Bayer koreaKR10381Use to anesthetize the mouse for transcardial perfusion
xyleneDuksanUN1307For Cresyl violet staining

参考文献

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