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摘要

该协议提出了一个强大的，可重复的模型血管化复合异体移植（VCA），旨在同时研究免疫学和功能恢复。时间投入到细致的技术，在右中大腿后肢正交移植与手工缝制血管肿瘤和神经共性产生研究功能恢复的能力。

摘要

特别是肢体移植和血管化复合异体移植（VCA），一般有广泛的治疗前景，由于目前免疫抑制和功能神经运动恢复的限制，已经阻碍了这种前景。许多动物模型已经开发用于研究VCA的独特特性，但在这里我们提出了一个强大的可重复模型的老鼠正交后肢移植，旨在同时研究当前VCA限制的两个方面:免疫抑制策略和功能神经运动恢复。该模型的核心是致力于细致，久经考验的显微外科技术，如手工缝制血管肿瘤和手工缝制神经共生股股骨神经和坐骨神经。这种方法可以进行持久的肢体重建，使活更长的动物能够恢复、恢复日常活动和功能测试。通过传统免疫抑制剂的短期治疗，异体移植动物在移植后存活了70天，而异体移植动物在术后200天后提供长寿对控制。神经功能恢复的证据在术后30天存在。该模型不仅为询问VCA和神经再生特有的免疫问题提供了一个有用的平台，还允许对专为VCA量身定做的新治疗策略进行体内测试。

引言

血管化复合异体移植（VCA）或复合组织异体移植（CTA）等更广泛范畴的肢体移植尚未实现其治疗承诺。自1998年、1999年在法国里昂和肯塔基州路易斯维尔成功进行人类手部移植手术以来，全球已对经过精心挑选的患者进行了100多例上肢移植手术。广泛的适用性已经阻碍了大量的免疫抑制和有限的功能神经运动恢复。目前的免疫抑制策略导致85%的急性排斥发生率，面对77%的机会性感染2。另一方面，手移植后功能恢复发生;手臂肩部和手部（DASH）的残疾分数从71分提高到43分，但功能水平可能仍有资格成为残疾2。鉴于肢体移植的非生命保存性质，目前的技术必须在动物模型中进行改进，才能在VCA中迈出下一步。

自1978年第一个大鼠模型的肢体移植3，许多创新的动物模型已经发展，以推进VCA 4领域，纳入血管袖口的阿内斯特莫西，以尽量减少手术时间5,5，6，异位 骨皮移植，以尽量减少生理侮辱接受动物77，8，9，10，11，,8,9,10,11和新颖的免疫方法7，12，13，14。,13,147,这里介绍的正畸右后肢中大腿移植的老鼠模型强调经过精密、久经考验的显微手术技术，如手工缝制血管肿瘤和神经整形，作为对一个稳健、可重复的模型平台的前期投资，同时研究当前VCA限制的两个方面:免疫抑制策略和功能神经运动恢复。

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研究方案

所有实验都是根据国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南进行的，并经西北大学动物护理和使用委员会批准。具体程序根据协议 IS00001663 执行。

注:使用两株老鼠，刘易斯大鼠和八月哥本哈根x爱尔兰（ACI）大鼠。动物被分成三个治疗组:无免疫抑制的异丙类移植（ACI到刘易斯），常规免疫抑制的异丙移植植物（ACI到刘易斯），和异种移植（刘易斯对刘易斯或ACI到ACI）。Lewis 是一种近亲繁殖菌株，而 ACI 大鼠则代表一种近亲繁殖的野生型，因此选择这种组合来模拟更坏情况的排斥反应。传统的免疫抑制被作为皮下管理，要么从术后一天（POD）减去1到POD 28，或作为FK506 3毫克/千克从POD 0到POD 14，然后每周一次。雄性大鼠和雌性大鼠都是8至16周大的合格接受者，手术时体重在250至400克之间。

1. 捐赠者右后肢收获

  1. 通过具有适当清除系统的蒸发器，在纯氧中用 5% 异氟来诱导全身麻醉。
  2. 用脚趾捏来确认足够的麻醉深度，然后用剪发器修剪右后肢和右腹股沟手术场的毛皮
  3. 通过啮齿动物鼻锥将异氟化物降低至2-2.5%。
  4. 将展开的四肢贴在操作板上的两侧，下面有加热垫。用 70% 的酒精对无毛皮肤进行消毒，用无菌纱布保护手术场。
  5. 使用适当的显微外科显微镜、显微手术仪器和容易接触双极和单极电卡，开始解剖。
  6. 使用剪刀在右后肢周围做包皮/皮下组织切口。从内皮折痕开始，与内侧韧带大致相同，并侧侧延伸以完成包周切口。
  7. 在切口下方暴露肌肉层后，解剖和烧灼从肌肉层到刚刚创建的近体皮肤/皮瓣的肤浅的表层。
  8. 将近位皮瓣超位反射到内侧韧带和近侧皮肤/皮下皮瓣推断到膝盖。
  9. 使用钢丝缩回器或卷纱布帮助露出磁场。
  10. 观察大鼠的内科解剖与人类相似;从横向到中枢，在于神经、动脉和静脉。
  11. 解剖股骨神经，在内侧韧带上急剧分割，如果可能的话，与分叉近。低劣地收回分裂的神经， 保持它的安全远离的方式， 覆盖在潮湿的纱布下。
  12. 将注意力转向股动脉和静脉，使用 4 厘米 7-0 丝丝领带，以创伤性地缩回血管，而不是直接处理它们。
  13. 用7-0丝带将股骨容器的所有分支都拉上;划分之间的领带分支。对于非常小的树枝，可以使用双极烧灼，而不是领带。
    注:需要分割的动脉和静脉分支包括表面的环静脉和肌肉血管。表面的环皮动物通常是最大的，似乎潜入深，就像人类的富伦达股骨一样，但大鼠15中不存在。股骨血管（如最高根和盐状分支）的更近处分支通常不需要分割。
  14. 系统地在雄性大鼠供体中通过笔静脉注射500个国际单位的肝素。如果捐赠大鼠为雌性，请使用表面的胃静脉。
  15. 在继续下一步之前，允许肝素系统循环 2 分钟。
  16. 将股骨动脉与 7- 0 丝状动脉尽可能与内关节韧带保持近，并在连接之间划分。
  17. 类似于动脉，拉大和分割股骨静脉。
  18. 反射动脉和静脉低劣，安全的方式，覆盖在潮湿的纱布下与股骨神经覆盖之前。解剖腹体肌肉群，注意烧灼任何可见的血管。这里的对血侧损伤的关注将最大限度地减少再灌注后接受者失血。
  19. 深到腹骨肌肉群，识别和尖锐地划分坐骨神经近到它的分支。三个坐骨神经科通常可见:胸肉，胸膜和耳骨。这三者都应保留在捐赠者肢体中。第四个皮肤分支是通常不见在此解剖15，16。15,
  20. 完成在中大腿水平的其余腹体和背部肌肉群的分部与细致的海莫西。可能需要以医疗方式收回肢体以完成肌肉的分割。
  21. 使用手持无绳旋转锯在中轴上转换股骨。
  22. 从捐赠者那里取出肢体移植物后，从移植侧股股动脉和静脉树桩上切开丝束的末端，从而重新打开血管。
  23. 将一个24测量的血管导管插入移植动脉树桩，用250个国际单位的肝素在5 mL的冰冷普通盐水中稀释，观察它通过打开的静脉流出来。
  24. 慢慢地，轻轻冲洗移植物约3分钟。过度的强力冲洗可能会损坏内皮。
  25. 将移植物放在冷藏盐水盘中，嵌套在冰桶中，直到移植。
  26. 用双边胸腔切除术对捐赠鼠进行安乐死。
  27. 适当清洁所有手术器械。

2. 接收者原生右后肢截肢

  1. 诱导麻醉与异氟兰5%，确认深度，修剪毛皮，定位动物，并消毒皮肤与酒精，如所述的捐赠大鼠。
  2. 将同流血球降低至2-2.5%，注射皮下术前镇痛剂，注射丁丙诺啡1.2毫克/千克，术前预防与苯丙沙星7.5毫克/千克。
  3. 与捐赠者相同，在内脏折痕中进行包环切，反射皮肤皮瓣，确保血栓，并解剖股骨神经、动脉和静脉，将与上述分支血管连接。
  4. 比捐赠者更分裂股骨神经，但如果可能的话，则与分体神经分开。
  5. 解剖股动脉和静脉，有足够的空间分别夹在内关节韧带的水平。用微手术斗牛犬夹夹住静脉和动脉。夹紧后，用剪刀将每个容器尖锐地分开。
  6. 用细致的下大腿水平分割大腿的腹体和背部肌肉，必要时以医疗方式缩回肢体。
  7. 识别并分割坐骨神经，如上所示。
  8. 使用锯在中轴上横贯股骨。
  9. 取出接收者本机右后肢并适当处置。
  10. 通过鼻锥将异氟降低至1-1.5%。

3. 接受者肢体植入的捐赠者

  1. 使用手持式电源锯，剃掉捐赠者和接受者股骨切割末端的任何不规则现象。
  2. 使用锯子，切断18表针的轮毂端，这将成为股骨内杆。
  3. 在操作骨骼之前，将少量骨蜡涂抹到股骨的接受者切端，以减少骨髓在重开过程中出血。
  4. 使用18量针作为内杆，将捐赠者和接受者股骨进行注射。一些力是必要的，但不要把骨骼都用，以使皮层断裂。
  5. 根据需要，取出针头并将其修剪到适当的长度，使两个骨骼平滑地在针上，骨骼之间没有针。
  6. 将小支撑，如纱布垫或小岩石或建模粘土在捐赠者肢体下面，以保持其张力。
  7. 用8到10个简单的中断的5-0多糖蛋白缝合线重新建立腹体肌肉群，使移植物不会围绕股骨针旋转。这为动物提供了肢体稳定性。
  8. 定期用冰冷的盐水灌溉移植物和手术场，以便更好地可视化，减少热缺血再灌注损伤。
  9. 使用简单的中断 10-0 尼龙缝合线，将供体和接受者股动脉对齐，并最终对它们进行原子化，避免张力和循环。动脉平均需要六个缝合线。
  10. 与动脉类似，对供体和接受者股骨静脉进行最后到年底的时尚。静脉需要六到八个缝合线。
    注:慷慨的冷盐水灌溉，创伤容器处理技术，并留下长尾巴作为容器缩回的停留缝合线是有效微外科麻醉的重要工具。
  11. 将少量止血纤维素粉末放在两个麻醉剂周围，然后去除静脉和动脉上的近端微外科斗牛犬夹。
  12. 检查两种麻醉和流动。使用棉签棒轻轻搅拌静脉，并确保两种麻醉素的良好的血栓。保持出血点的压力，并放置更多的止血纤维素粉，如果需要的话。另一种缝合线可能通过出血孔放置，风险只是作为最后手段"背壁"针头。
  13. 当两个 anastomos 被确认为令人满意时，修剪任何剩余的长停留缝合尾部短，以匹配其他。
  14. 将大鼠重新定位到左侧脱花位置，使用自由电烧机获得任何再灌注肌肉出血的细致止血。
  15. 一旦肌肉痉挛得到保证，将注意力转向神经神经。修剪回任何神经切割端，看起来不规则。
  16. 用简单中断的 5-0 多糖蛋白缝合线在坐骨神经下的后体肌肉群中重新建立。
  17. 重新发展坐骨神经。八到十 10-0尼龙神经简单的中断缝合线通常就足够了。
  18. 重新建立提醒的后体肌肉群，然后用4-0多糖蛋白连续缝合关闭后体皮肤。
  19. 重新定位大鼠回到苏平位置，重新发展股骨神经。两到三个10-0尼龙神经简单的中断缝合线通常就足够了。
  20. 用4-0多糖蛋白连续缝合关闭腹肌皮肤。避免多余的缝合尾巴，这一旦醒来，可能会刺激大鼠。

4. 术后护理

  1. 在笼子里用加热垫恢复动物，并随时获得食物和水，在第一周每天监测早期并发症。
  2. 通过POD 2提供术后镇痛与皮下旋律1毫克/千克每日注射。提供术后抗生素预防稀释的苯丙沙星喷雾剂。提供抑制自体切除术（自残），苦安全雾每天通过POD 7喷洒两次到移植物上。
  3. 与其他大鼠一起将移植的老鼠关在笼子里，以刺激他们恢复日常活动，恢复移植的肢体。

5. 术后感觉测试

  1. 应用哈格里夫斯热感觉协议测试，也描述了其他地方17，18。17,
  2. 将大鼠放在测试容器中，并允许其适应20分钟。仪器玻璃被证实清洁，热源被证实与调查人员的手指工作。
  3. 测试前，确认大鼠已唤醒，测试的爪子位于红外运动探测器上。
  4. 在强度级别 90 时传输热能。记录动物移动爪子远离热源的时间延迟。如果在 20 秒内未发生任何移动，则中止测试以防止受伤。
  5. 在计算每种动物的每次戒断延迟时间之前，每个测试肢体获得五次试验，不包括最高值和最低值。

6. 术后电机测试

  1. 使用步态分析跑步机和集成软件分析平台，在手术后四到六周内选择跑步机测试的候选者。
  2. 在测试前一两天修剪所有大鼠脚趾甲。
  3. 在测试前将动物适应到测试室一小时，并允许一分钟的测试前宠物，以平息焦虑。
  4. 将大鼠放入跑步机内，在速度增加的试验中运行跑步机，从10厘米/s到14厘米/s，到目标18厘米/s。如果大鼠是沉默的，不能哄着走路，中止当天的测试，以避免阴性调节。允许高绩效者步行至 24 厘米/s。
  5. 在测试动物之间用70%的乙醇冲洗跑步机设备。
  6. 盖特参数来自分析平台的专有软件。

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结果

生存和恢复取决于细致的手术技术。注意血管性肿瘤和神经性肿瘤，以及上述骨合一，是最大化此模型成功的关键。操作设计和具有代表性的原子结果如图 1所示。

总体死亡率取决于免疫抑制策略，大多数异移植动物达到100-200个术后研究终点，如图 2所示。一旦走出急性术后窗口，治疗的异种移植动物可以体验到生存长达58个术后?...

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讨论

肢体移植，在更广泛的血管成分异位移植（VCA）类别下，具有广泛的应用治疗前景尚未实现。主要障碍在于VCA和神经运动恢复技术目前所特有的未解决的免疫学问题。新技术的发展将取决于灵活、健壮和可重复的动物建模。

在VCA中已经建立了许多动物模型，每种模型都有特定的优点。非人类灵长类动物模型为人类患者提供了有吸引力的可翻译性，但一直受?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作由弗兰克尔基金会和西北纪念医院麦考密克·格兰特（恢复行动）资助。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持，其编号为T32GM008152。这项工作得到了西北大学显微外科核心和行为表型核心的支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia machineVet Equip911103
0.5cc syringeExel26018
18-gauge needleBD305196
1cc syringeBD309659
22-gauge needleBD305156
24-gauge angiocatheterSur-VetSROX2419V
25-gauge needleExel26403
3 cc syringeBD309657
5cc syringeExel26230
AlcoholFisher ScientificHC-600-1GAL
Anesthesia induction chamberVet Equip941443
Anesthetic gas scavenger systemVet Equip931401
Bipolar electrocauteryAura26-500
Bitter Spray MistHenry Schein5553
Bone waxCP MedicalCPB31A
Breathing circuitVet Equip921413
BuprenophineReckitt Benckiser12496075705
Castro-Viejos needle driversRobozRS-6416
Cordless rotary sawDremel8050-N/18
Cotton swab stickFisher Scientific23-400-101For hemostasis
DigiGait Appparatus and SoftwareMouse SpecificsMSI-DIG, DIG-SOFT
Dumont forceps (#4)RobozRS-4972
Dumont forceps (#5)RobozRS-5035
EnrofloxacinNorbrookANADA 200-495
FK-506Astellas301601
GauzeKendall1903
GauzeCovidien8044
GlovesMicroflexDGP-350-M
Hair clippersOster078005-010-003
Handheld monopolar electrocauteryBovieAA00
Hargreaves ApparatusUgo Basile S.R.L. Gemonio, Italy37370
Heating padWalgreens126987
HeparinFresenius Kabi42592K
Hot plateCorningPC-351For warming resusscitation fluid
IsofluraneHenry Schein29405
Lactated ringersBaxter2B2074
Large petri dishFisher ScientificFB0875713For donor graft while in chilled saline
MeloxicamHenry Schein49755
micro Collin Hartmann retractor
Micro dissecting scissorsRobozRS-5841
Microfibrillar collagen powderBD1010590For hemostasis
Microvascular clipsRobozRS-5420
Normal salineBaxter2F7124
Opthalmic lubeDechraIS4398
RapmycinMedChem ExpressHY-10219
Small petri dishFisher ScientificFB0875713AFor warmed resusscitation fluid
Sterile drapesProAdvantageN207100
Surgical gownCardinal Health9511
Surgical mask3M1805
Surgical microscope, optic model OPMIMDZeiss169756
Surgical microscope, Universal S3Zeiss243188
Suture 10-0 nylonCovidienN2512
Suture 5-0 vicrylEthiconJ213H
Suture 7-0 silk tieTeleflex103-S
Tape3M1530-1
Ultrasonic instrument cleanerRobozRS-9911
Vessel dilation forcepsRobozRS-5047

参考文献

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