使用全载免疫作用化学和三维重建对咽弓动脉的可视化与分析

摘要

在这里，我们描述了一种协议，使用全孔免疫荧光、组织清除、共聚焦显微镜和3D重建来可视化和分析小鼠胚胎的咽弓动脉3、4和6。

摘要

咽弓动脉（PAA）3、4和6的不当形成或重塑导致一些最严重的先天性心脏病。为了研究PAA的形成，我们开发了一种方案，使用全支式免疫荧光结合苯基醇/苯甲酸苯甲酸酯（BABB）组织清除和共聚焦显微镜。这允许以精细的细胞分辨率可视化咽喉拱内体，以及血管的 3D 连接。使用软件，我们建立了一个协议，以量化PAA中的内皮细胞 （EC） 数量，以及咽喉拱门 3、4 和 6 内围绕 PAA 的血管丛中的 E 数。该方法应用于整个胚胎时，对胚胎血管进行综合的可视化和定量分析。

引言

在小鼠胚胎形成期间，咽喉弓动脉（PAAs）出现为对称的两侧动脉对，将心脏与背动脉¹连接起来。随着胚胎的发展，第一和第二对PAA回归，而^第3、4和6^PAA经历一系列不对称的重塑事件，形成主动脉^2。

PAAs 3、4 和 6 通过血管生成而发展，这是血管的脱层³。这些弓动脉形成或改造的缺陷导致各种先天性心脏缺陷，如在DiGeorge综合征^44，55患者看到。因此，理解调节PAA发展的机制可以导致对先天性心脏病（CHD）病因的更好理解。

目前用于可视化和分析PAA发展的方法包括组织部分的免疫荧光、血管铸件、印度墨水注射、高分辨率的异见显微镜和/或全卡免疫组织化学^{11、4、5、6、7。4,5,6,7}在这里，我们描述了一种结合全载式免疫荧光、共聚焦显微镜和3D图像渲染的协议，以便收集、分析和量化体积数据、血管连接性和细胞识别。此外，我们详细介绍了一种将每个咽喉拱中的ECs数量分割和量化的方法，作为研究咽喉弓血管丛的形成及其重新改造到PAA的方法。虽然该协议是专为分析PAA发展而设计的，但它可用于分析其他正在发育的血管网络。

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研究方案

罗格斯大学机构动物护理和使用委员会批准了动物使用和程序。

1. 准备解决方案

1. 用 0.1% Triton-X-100 （PBST） 制备 1 L 的磷酸盐缓冲盐水，并消毒过滤器。此解决方案可在室温 （RT） 下存储至少一年。
2. 准备600μL的阻塞缓冲液，由PBST中正常驴血清的10%组成。每次使此解决方案新鲜。
3. 在流量罩中制备以下 50 mL 甲醇 （MeOH） 稀释剂:在去离子水中 （dH₂O） 中的 25% MeOH，在 dH₂O 中制备 50% MeOH，在 dH₂O 中混合 75% MeOH。存储在 RT 中。
4. 在50 mL锥形管中制备以下50 mL的苯基醇-苯甲酸酯（BABB）溶液。
   1. 对于 100% BABB，将 32 mL 苯甲酸苯甲酸添加到 16 mL 的苯基醇（每体积比 2:1 体积）。
   2. 对于 50% BABB，将 16 mL 苯甲酸苯甲酸苯甲酸苯甲酸酯和 8 mL 苯基醇加入到 24 mL 的 MeOH 中。
   3. 用铝箔覆盖锥形管，防止光线照射。这些解决方案可在 RT 中存储长达一年。
      注意事项:BABB 具有毒性和腐蚀性。应根据 MSDS 处理和处置。

2. 胚胎解剖和固定

注:此协议适用于从任何小鼠应变中分离的 E9.5 和 E10.5 小鼠胚胎（雄或雌性）。对于更年轻和年长的胚胎，应经实验确定孵化时间，以最大化荧光信号的信号与噪声比。

1. 用 1x PBS 填充一个 35 mm 和一个 60 mm 的培养皿，并放置在冰上，直到需要为止。
2. 通过CO₂吸入对怀孕的小鼠进行安乐死。作为安乐死的次要措施，进行宫颈错位。
3. 用70%乙醇清洁大坝的腹部区域。使用钳子捏住腹部区域，使用手术剪刀从中线腹壁底部开始，进行V型切口;继续打开胸腔。抬起腹部组织，将肠子移到一侧，露出子宫角。
4. 在阴道管的底座上切开，用钳子将子宫从大坝上拉开。在每个卵巢上做一个额外的切口，以释放子宫。将子宫转移到含有冷1x PBS的60毫米培养皿之一。
5. 使用直剪刀，在每个植入部位之间切割子宫壁。拿起一个带有玻璃移液管的二分，然后转移到35毫米的培养皿与1xPBS。在解剖显微镜下，将直剪刀插入二分和子宫壁之间的空间。切割并拆下子宫壁。
6. 用细钳子，通过小心地沿着组织进行横向切口，并将组织从蛋黄囊中拉开，从胚胎中取出二分体和赖歇特的膜。通过小心地将组织从胚胎中拉开，并在异体炎和脐带静脉上切开，去除蛋黄囊和羊水囊。
   注:蛋黄囊可用于基因分型胚胎。
7. 用玻璃移液将每个胚胎转移到单独的 2 mL 管中，管子中填充 1 mL 的 1x PBS。使用唯一标识符标记每个管。
8. 要修复胚胎，请小心地取出 1x PBS，并在 1x PBS 中加入 4% 的甲醛 （PFA） 溶液。在4°C孵育，一夜之间用温和的搅拌。
   注:4%PFA 固定适用于该协议中提到的抗体。但是，固定程序应针对其他抗体进行优化。

3. 胚胎染色

注:在本节中，胚胎渗透并沾染原抗体和继发抗体。由于PAA开发进行迅速，胚胎阶段的差异将极大地影响下游的分析。因此，胚胎必须经过仔细计数的躯体来匹配对照组和突变对，才能在进一步操作之前与年龄相匹配。

1. 要洗涤胚胎，请小心地去除4%的PFA并加入1倍PBS。轻轻反转管子几次。将管子放在右侧，让胚胎下沉。重复洗涤3次。将带胚胎的管子放在冰上。
   注:（可选停止点）在进行完注后，胚胎可以在分级系列的MeOH中脱水，每次稀释30min，如第1.3节，并储存在-20°C的100%MeOH，供以后使用长达6个月。
2. 对于 E10.5 胚胎，使用玻璃移液管将一个胚胎转移到充满冷冻 1x PBS 的 35 mm 培养皿中。小心地用细钳子将胚胎捏在后肢上方，进行横向切割，以去除后半部分的胚胎。这允许胚胎平躺在一个凹陷位置的步骤4.2。用新鲜的1x PBS将胚胎放回2 mL管中。
   注:对照胚胎和突变胚胎可以在一个管中配对并染色相同的抗体溶液，步骤3.3到3.8。
   1. 如果将两个胚胎染色在一起，则用细钳子捏下一个胚胎的头部，以进行横向切割。这将区分每个管内两种不同基因型的胚胎。
3. 为了渗透胚胎，从管子里伸出1xPBS，小心不要接触胚胎。添加 1 mL 的 PBST。将管置于 4°C 处，一夜之间轻轻搅拌。
   注:（可选停止点）胚胎可以在4°C的PBST溶液中保存数天。
4. 为了防止抗体的非特异性结合，首先从管子中取出PBST，小心不要接触胚胎。在胚胎中加入600 μL的阻塞缓冲液。在4°C下用柔和的搅拌在4°C处挡住胚胎。
   注:在使用前，需要在台式离心机上以最高速度旋转阻塞溶液，以清除碎屑。
5. 要染色和量化 E，请使用针对 VEGFR2 和 ERG 的抗体。抗体溶液在阻塞缓冲液中制造。抗VEGFR2抗体稀释1:200，ERG抗体稀释1:1000。
   注:抗体溶液在使用前需要在台式离心机上以最高速度旋转，然后才能清除颗粒物。
   1. 要用原抗体孵育胚胎，请从管子中取出阻塞缓冲液，小心不要接触胚胎。在每个管中加入600 μL的原抗体溶液。在4°C下用温和搅拌孵育胚胎4-5天。
6. 要洗净抗体溶液的胚胎，请先从管子中取出主要抗体溶液。在室温 （RT） 下，在室温下使用 1 mL 的 PBST，每小时用 1 mL 的 PBST 进行洗涤胚胎，并轻轻搅拌。在白天洗4-5次胚胎，然后在4°C下用温和的搅拌孵育过夜。第二天重复进行重点。
7. 通过稀释抗山羊Alexa Fluor 488和抗小鼠Alexa Fluor 555 1:300在阻塞缓冲液，使二次抗体解决方案。稀释块缓冲液中的库存 DAPI 1:1000。
   注:抗体溶液必须在使用前立即在台式离心机上以最高速度旋转，然后才能清除颗粒物。此外，其他Alexa氟染料可用于代替488或555。
   1. 要用继发抗体孵育胚胎，请从管子中取出PBST。在每个管中加入600 μL的二次抗体溶液。在4°C下用温和搅拌孵育胚胎4-5天。
8. 要洗净抗体溶液的胚胎，请先从管子中取出二次抗体溶液。在RT用1 mL的PBST在RT上用温和的搅拌洗涤胚胎。在白天洗4-5次胚胎，然后在4°C下用温和的搅拌孵育过夜。第二天重复进行重点。

4. 在阿加罗斯中植入胚胎

注:在第4节中，胚胎将嵌入在琼脂中。这种嵌入过程有两个目的:在成像前正确定向胚胎，并在BABB中清除胚胎后帮助定位胚胎（步骤5.2.2- 5.3.2）。

1. 通过将 2 克琼脂糖加入 200 mL 的 dH₂O. 微波，直到所有琼脂溶解，制备 200 mL 的 1% 琼脂糖溶液。
   注:剩余的琼脂可储存在4°C，并重新加热供以后使用。
2. 使用塑料石蜡模具和玻璃移液管，轻轻地将一个胚胎转移到模具中。小心地从胚胎中取出PBST。将胚胎置于凹陷位置。快速，在模具中加入约0.5 mL的热脂糖 - 刚好够覆盖胚胎并填充模具。确保胚胎周围没有气泡。
3. 将模具放在冰上，用铝箔盖住，直到琼脂凝固。
   注:在去除PBST后，不要让胚胎干燥。阿加罗斯溶液必须足够温暖，才能在添加到胚胎中时保持液体。只加入足够的琼脂覆盖胚胎，但不要太多，否则将很难成像。图像深度部分由目标的工作距离决定。

5. 脱水和组织清理

注:在本节中，胚胎使用甲醇系列脱水，然后在有机溶剂BABB中清除，并安装在由橡胶垫片分离的两个盖玻片之间;在此协议中使用快速井橡胶垫块。快速井保险杠具有双面粘合表面。垫片是创建一个井，其中胚胎将被放置和保持在两个盖玻片之间。

1. 甲醇脱水
   1. 标记新的 2 mL 管，每个胚胎一个。每管加入 1 mL 25% MeOH。
   2. 使用干净的手术刀，轻轻地切开胚胎周围的琼脂，在胚胎周围留下足够的，以便它可以通过钳子拾取。使用细钳轻轻抓住植入胚胎的琼脂，并将其放入带有 25% MeOH 标签的管中。不要让钳子接触胚胎。
   3. 在黑暗中用温和的搅拌在RT孵化胚胎1小时。
   4. 从管子中取出25%的MeOH，小心不要触摸胚胎。每管加入 1 mL 50% MeOH。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。
   5. 从管子中取出50%的MeOH，小心不要触摸胚胎。每管加入 1 mL 75% MeOH。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。
   6. 从管子中取出75%的MeOH，小心不要触摸胚胎。每管加入 1 mL 100% MeOH。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。重复 100% MeOH 洗涤两次。
2. 使用 BABB 结算
   1. 从管子中取出100%MeOH，小心不要触摸胚胎。每管加入1 mL 50% BABB。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。
   2. 从管子中取出50%的BABB，小心不要接触胚胎。每管加入1 mL 100%BABB。在黑暗中用温柔的搅拌在RT孵育1小时。重复 100% BABB 洗涤两次。
      注:（可选停止点）胚胎可以在管中保持100%BABB约一周。更长的储存会导致BABB溶解管的塑料。
3. 安装用于成像的胚胎
   1. 将快速井保险杠放在 24 mm x 60 mm #1.5 玻璃盖滑滑上，从一侧剥去塑料胶粘剂。通过在橡胶保险杠上的塑料胶粘剂施加温和的压力，确保盖玻片和保险杠之间没有气泡。根据胚胎数量、基因型和用于染色的抗体标记盖玻片。
      注:只要其厚度足以防止挤压或挤压胚胎，任何垫片都可以放置在盖玻片之间。我们使用快速井垫片，由于其厚度和便利性，其中包括垫片两侧的粘合表面，用于将其固定到盖玻片上。
   2. 小心地移出管，然后从管子中丢弃 100% BABB。在管中可视化阿加罗斯嵌入的胚胎后，使用细钳子拾取琼脂，并小心地将胚胎转移到快速井内的盖玻片上 - 不要让钳子接触胚胎。
   3. 从保险杠上取下第二个塑料粘合剂，并将第二个盖玻片放在顶部。轻轻按压盖玻片可去除气泡。小心不要打碎玻璃。
      注:如果密封紧密，样品可以平放在 RT 黑暗中的滑动支架中长达一年。

6. 获取数据

注:在以下步骤中，将使用共聚焦显微镜对咽喉拱门 3、4 和 6 的内窥镜进行成像。

1. 幻灯片在显微镜舞台上的定位
   1. 要对胚胎进行成像，请使用配备 20 倍水浸式目标、数值孔径 0.95、工作距离 0.95 mm 和 NIS-元素 AR 5.11.01 64 位软件的共聚焦显微镜。
   2. 使用宽场荧光，直观地定位咽喉拱门。围绕第 4^个PAA 的字段视图进行居中。
   3. 如果目标的视场没有捕获整个咽喉拱形区域，则拍摄并缝合具有 1% 重叠的大图像面板。为防止样品在获取大图像过程中移动，使用模塑粘土轻轻将盖板组件固定到舞台上。
2. 设置采集参数
   1. 将针孔大小设置为 1.0。
   2. 在ND 采集选项卡下，使用粗调整设置成像的顶部和底部限制。根据软件规格设置 Z 步长大小。确定可按目标工作距离和样品清晰度进行成像的厚度。
   3. 由于胚胎的厚度，调整整个Z堆栈的增益。为每个通道（405、488 和 555）设置 Z 堆栈中间的激光强度和增益，并在"Z 强度校正"选项卡下分配值。
   4. 滚动穿过胚胎，直到荧光信号开始出现变暗。增加每个通道的增益，直到信号强度与上一段相似。在Z 强度校正选项卡下分配新值。重复，直到 z 堆栈完成。将设置导入回ND 获取。
   5. 使用运行 Z 校正选项运行扫描。

7. 使用 Imaris 软件进行分析

注:在这些步骤中，将使用 Imaris 版本 9.2.0 的显微镜图像分析软件分析共聚焦图像。在此分析中，我们将首先选择要通过创建曲面来分析的感兴趣区域。接下来，我们将使用蒙版函数直观地分隔这些区域。最后，我们将使用Spot函数来量化每个感兴趣区域内的 E 数。

1. 根据步骤 6 中使用的成像软件，使用Imaris 文件转换器将图像转换为 .ims。
2. 打开 .ims 文件。将图像设置为"相机/标签"下的正交 |摄像机类型面板。
3. 找到 PAA 并定向图像以进行曲面。
   注: 首次打开文件时，它们将显示为所有图像切片的 3D 编译。在此步骤中，PAA 将通过将 3D 图像转换为 2D 图像来定位。然后，2D 图像允许 PAA 正确定向进行分析。
   1. 在"属性"面板下，关闭"音量"。在"属性"面板下，单击"添加新的正交切片器"。将切片方向设置为XY 平面。使用"切片位置"滚动图像，直到找到 PAA。
   2. 如果 PAA 与图像的顶部和底部不平行，请使用鼠标光标自由旋转图像，以便 PAA 在屏幕上从左到右运行。在"图像处理"下拉菜单下，选择"自由旋转"并单击"确定"。
4. 浮出水面^的第3个Pharyngeal拱门（图2A，B - B"）
   注:在这些步骤中，将使用Surface工具跟踪咽喉拱门和 PAA，以生成感兴趣的"表面"区域。这将允许每个感兴趣的区域从周围组织的视觉隔离。在这里，我们描述了表面和分析^第三咽弓的内皮分量的步骤。Pharyngeal 拱门 4 和 6 也进行了类似的分析。
   1. 要在整个^{第 3 个}咽喉拱门中显示内皮，请单击"新建曲面"按钮，该按钮位于"属性"面板下方。双击曲面 1并将新曲面重命名为"第^{3 个}咽喉拱门"。
   2. 选择"跳过自动创建"，手动编辑。将曲面方向设置为 YZ 平面（冠状方向）。使用切片位置将第 3^个咽喉拱面平面放置到第 3^个PAA 和多尔萨尔 Aorta 连接的位置。
   3. 旋转图像，以便第³咽弓拱面平面在视图中。关闭正交切片器 1。
   4. 在抽奖 |轮廓 |模式选项卡，选择"距离绘制模式"功能。如果需要，调整参数设置。保持样品之间的一致曲面参数。在此示例中，顶点间距为 10 μm。
   5. 要开始浮出水面，请按Esc键，然后单击"绘制"按钮。用鼠标光标跟踪第³咽弓的周长。使用"切片位置"移动 10-25 个切片。追踪咽弓的周长。重复，直到咽弓完全追踪。
   6. 要生成跟踪区域的表面，请在"属性"面板中选择"创建曲面"按钮。
5. 表面第^{3 个}PAA （图 2C- C"）
   1. 要显示^{第 3 个}PAA 的内皮，首先通过取消选择第 3^个Pharyngeal 拱门曲面框，从步骤 7.4 关闭曲面区域。然后，再次单击"添加新曲面"按钮。双击曲面 1并将新曲面重命名为"第 3^{个 PAA"。}
   2. 选择"跳过自动创建"，手动编辑。将曲面方向设置为 YZ 平面（冠状方向）。使用切片位置将第 3^个PAA 平面放置到第^{3 个}PAA 和多尔萨尔 Aorta 连接的位置，然后重复步骤 7.4。
6. 表面结构的遮蔽
   注: 在以下步骤中，每个显示感兴趣的区域将被屏蔽。遮罩允许感兴趣的区域在视觉上不同于成像组织的其余部分，并允许对这些不同的感兴趣结构进行量化。下面，我们描述了 Imaris 中用于可视化和分析 PAA 内皮质的步骤，以及丛 - 咽喉拱门内围绕 PAA 的较小血管。在这些步骤中，将屏蔽^{第 3 个}PAA 曲面，以便仅使用第 7.7 节中描述的 Spot 函数对 PAA 进行可视化和执行分析。
   1. 选择"音量"以可视化所有蒙版通道。按Esc键以旋转图像并将图像定位到 XY 位置。
   2. 在"编辑"选项卡下，选择第 3^个PAA 的蒙版选择。选择 DAPI 通道并单击"确定"。对其余通道重复上述步骤。
   3. 在键盘上，按Ctrl + D以查看"显示调整"面板。选择每个新频道并重命名它们，以明确每个频道显示的内容。例如，这将导致三个新的通道:"^第三个PAA DAPI"，"第^三个PAA ERG"和"^第三个PAA VEGFR2"。
      注:在步骤 7.6.4-7.6.7 中，我们将只为咽喉弓形丛创建通道。
   4. 为了将内皮丛与 PAA 分开可视化，我们将首先为第 3^个PAA 曲面选择蒙版选择。选择 DAPI 通道。取消选中"选择曲面外部的体素"，并选中"选择曲面内的体素到按钮"，将曲面内的"选择体素"设置为零。单击"确定"。
   5. 对其余通道重复上述步骤。此操作将从新的屏蔽通道中排除包含 PAA 的区域。重命名通道以明确每个通道显示的内容。例如，这将导致三个新的渠道:"非PAA DAPI"，"非PAA ERG"和"非PAA VEGFR2"。
   6. 要可视化^{第 3 咽}弓中的内皮丛，请在"编辑"选项卡下为^{第 3 个}咽喉拱门曲面选择"蒙版选择"。选择非 PAA DAPI通道。单击"确定"。
   7. 对剩余的非 PAA 通道重复上述步骤。重命名通道以明确每个通道显示的内容。例如，这将导致三个新的渠道:"Plexus DAPI"，"Plexus ERG"和"Plexus VEGFR2"。
7. 欧共体编号的量化
   注:ERG 的表达标记内皮核，便于量化 EC 数。在这些步骤中，将使用 Spot 函数量化 EC 的数量，以生成 PAA 和丛中 ERG 表达式标记的每个 EC 的点。在第7.7节中，将生成蒙面PAA中每个ERG阳性细胞的斑点，然后取消选择ERG阳性、VEGFR2阴性细胞中的斑点。
   1. 在键盘上，按Ctrl + D以查看"显示调整"面板。关闭除 PAA ERG 以外的所有通道。
   2. 在"属性"选项卡下，单击"添加新点"按钮。单击点 1并将其重命名为"PAA 总数量的 E"。单击蓝色箭头按钮。对于源通道，选择 PAA ERG 通道。将估计 XY 直径调整到 4 μm。单击蓝色箭头按钮，继续进入下一个面板。
   3. 调整使用滑动刻度看到的点数，以确保每个 EC 核（由 ERG 表达式标记）由一个点表示。单击绿色双箭头按钮。
   4. 关闭显示调整中的 PAA ERG 通道。打开 PAA VEGFR2 通道以可视化 PAA 内皮。
   5. 为了准确量化 EC 的数量，我们确保每个点同时表示 EC 标记、ERG 和 VEGFR2。为此，请在"编辑"选项卡下选择"对象曲面" |添加/删除面板。按Esc键，通过按住班次并选择该点，删除任何未为 VEGFR2 正位的点。
      注:在以下步骤中，将生成蒙版丛中每个ERG阳性细胞的斑点，然后取消选择ERG阳性、VEGFR2阴性细胞中的点。
   6. 在"属性"选项卡下，单击"添加新点"按钮。选择"点 1"并重命名为"PC 总数"。单击蓝色箭头按钮。对于源通道，选择 Plexus ERG 通道。将估计 XY 直径调整到 4 μm。对于 Plexus 的 E 总数重复步骤 7.7.1 - 7.7.5。
   7. 单击每个点函数的"统计信息"选项卡，确定^{第 3 个}PAA 和咽弓丛中的 E 总数。
   8. 对剩余的 PAA 和咽弓丛重复步骤 7.7.1 - 7.7.6。

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结果

此处介绍的全载免疫荧光协议产生清晰、干净的结果，允许对咽喉拱内皮进行3D重建，如图1A所示。在每个抗体溶液中孵育胚胎足够长的时间以确保通过样品完全渗透，以及彻底清洗胚胎后抗体孵育，这一点非常重要。在图 1B中，大而明亮的点是抗体或阻塞缓冲液溶液中微粒的结果。我们发现，每次抗?...

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讨论

在3D小鼠胚胎中可视化内皮的能力为小鼠胚胎的发展^{提供了新的见解。}在这里，我们提出了一个协议，允许对胚胎进行高分辨率的3D成像，血管连接的可视化，以及PAA形成的定量分析。该协议可用于查看基因改变或环境侮辱如何影响 PAA 发展。此处报告的程序使用针对VEGFR2和ERG的抗体来可视化PAA形成和量化EC编号;然而，额外的抗体可用于可视化和分析弓动脉发展的其他方面，如神?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	MP Biomedicals	PBS10X02
20x water immersion objective	Nikon	MRD77200
Agarose	Bio-Rad Laboratories	1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat	Invitrogen	A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Invitrogen	A-31570
Analysis Software	Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol	Sigma-Aldrich	305197
Benzyl Benzoate	Sigma-Aldrich	8.18701.0100
Cover Slips	VWR	16004-312
DAPI (5 mg/mL stock)	Fisher Scientific	D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL)	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol	VWR	89370-084
Falcon tubes (50 mL)	Corning	352098
Fast wells	Grace Bio Labs	664113
Forceps	Roboz	RS-5015
Goat anti-VEGFR2	R&D Systems, Inc.	AF644
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Microscope	Nikon	A1HD25
Mouse anti-ERG	Abcam	ab214341
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Petri dishes (35 mm)	Genesee Scientific	32-103
Petri dishes (60 mm)	Genesee Scientific	32-105
Plastic Molds	VWR	18000-128
Scapels	Exelint International Co.	29552
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP 151-500