使用免疫荧光显微镜鉴定帕芬-嵌入式猫动脉血栓中中性粒细胞外陷阱

摘要

我们描述了一种使用热诱导抗原检索和双免疫标记协议识别甲醛固定和石蜡嵌入的猫科动物心性动脉血栓中嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）的方法。

摘要

中性粒细胞外陷阱（NETs），由无细胞DNA（cfDNA）和蛋白质（如组蛋白和嗜中性粒细胞酶酶（NE）组成，由嗜中性粒细胞释放，以响应全身炎症或病原体。虽然NETs以前曾被证明能增强血栓形成和抑制人类和狗的纤维化，但NET在有心性动脉血栓栓塞（CATE）的猫中的作用，这是一种威胁生命的并发症，仅次于肥大心肌病，未知。一种标准化的方法识别和量化猫有氧动脉血栓中的NET，将增进我们对猫在CAT中病理作用的理解。在这里，我们描述了一种技术，用于识别主动脉分叉内甲醛固定和石蜡嵌入血栓中的NET，在尸检期间提取。与二甲苯脱硫后，主动脉部分进行了间接热诱导抗原检索。然后，通过无细胞DNA（cfDNA）、西特鲁普林语H3（citH3）和中性粒细胞酶（NE）共同定位，利用免疫荧光显微镜，发现部分阻塞、渗透和外游性NETs。为了优化血栓中NET的免疫检测，在显微镜之前使用自动荧光淬火过程限制了组织元素的自荧光。这项技术可能是研究其他物种的NET和血栓形成的有用工具，并为这种复杂情况的病理生理学提供了新的见解。

引言

患有肥大心肌病的猫有生命危险血栓栓塞并发症^11，2。2尽管与猫科动物心电源性动脉血栓栓塞（CATE）相关的发病率和死亡率很高，但CAT在猫身上的基本病理生理学还知之甚少。也有有限的诊断和治疗工具，以治疗和识别猫在这种毁灭性的条件³的风险。

除了在先天免疫中的作用外，中性粒细胞外嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）在血栓形成中发挥了作用，这种陷阱是网络状的无细胞DNA（cfDNA）网络，含有组蛋白和粒状蛋白质，如中性粒细胞酶酶（NE）和骨髓红酶。嗜中性粒细胞在反应全身炎症、直接接触病原体以及与活性血小板^{44、5、6、75,6,7}相互作用时进行神经衰弱的形成。在狗中，中性粒细胞衍生的DNA已被证明能抑制血块性结质，而NET蛋白加速血块形成。NET捕获循环细胞和凝固成分的能力也是其血栓生成特性⁸8、9、10、11、12的关键。^,9,10,11,12

通过细胞外嗜中性粒细胞蛋白、组蛋白和cfDNA的共定位检测出NET。因此，通过脱硫素组织的免疫荧光对固定组织中NET的识别和定量优于传统的血氧林和欧辛（H&E）染色，使用明亮的场显微镜^44，5。5利用免疫荧光显微镜进行的几项人体研究确定NETs为冠状动脉血栓、脑卒中、动脉炎和静脉血栓13、14、15、16、17的结构成分。^{13,14,15,16,17}迄今为止，尚未描述一种检测和量化猫科动物血栓中NET的标准化方法。由于在猫科动物心性动脉血栓中识别NETs可能有助于未来在NET和血栓的转化研究，我们描述了NET识别和评估在猫的石蜡嵌入动脉血栓的技术。

研究方案

此处描述的所有方法均按照加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的准则执行。在业主同意下进行组织解剖和活检。

1. 组织固定、嵌入和切片

1. 在人道安乐死或死亡后不久，切除主动脉分叉，包括下降的主动脉、股动脉和常见的伊利亚动脉（图1A）。布伦特解剖出筋膜 （图 1B） 之前，它完全浸入 10% 中性缓冲形式，至少 24 小时，不超过 48 小时。
2. 要脱水样品，首先浸入10%中性缓冲形式中加热至37°C1小时。然后，在乙醇的浓度增加中浸入加热到37°C（70%，95%，100%）2x，每1小时。最后，在不进行润石的情况下，将2倍浸入100%的托鲁烯中加热至37°C，每次加热1小时。
3. 将石蜡加热到62°C，让石蜡在一夜之间完全凝固。
4. 使用微托姆将石蜡嵌入组织的第 2⁄3 μm 节放在带正电荷的玻璃幻灯片上。将切片组织储存在-80°C，直到进一步分析。

2. 脱硫、补液和热诱导抗原检索

1. 要对玻璃滑轨上的部分进行除石化和补液，将玻璃滑板放在机架中，然后按以下顺序进行处理:
   1. 完全浸入 100% 二甲苯 3 分钟。 重复此步骤 2 倍。不要在步骤之间冲洗。
   2. 完全浸没在乙醇浓度下降（100%、95%、70%）中室温 （RT）， 3x 每 3 分钟.不要在步骤之间冲洗。
   3. 完全浸入去离子水中2分钟。 重复。
2. 将部分放入三酯缓冲盐水中，以 0.1 % Tween （TBST， pH = 7.6） 放置 2~3 分钟。
3. 将去离子水加热到 100°C。让蒸箱室平衡20分钟。
   注:热诱导抗原检索最好通过具有预设温度设置的蒸水器（如食品蒸水机）产生的间接加热进行。
4. 在温度控制热板上将含有Tris和EDTA（pH = 9）的商用抗原回收溶液加热到95~97°C，并持续搅拌。确保它不沸腾。
   注:一旦加热，溶液应变为多云。
5. 将加热抗原回收溶液倒入滑容器，然后将容器放入蒸水器的腔室中。让抗原回收溶液与蒸水器的温度平衡3~4分钟。确保造型室温度为+95°C。
6. 将滑轨完全浸入加热抗原回收溶液中，并通过蒸水器继续应用外部加热 20 分钟。
7. 从蒸托器中取出滑动容器，让幻灯片和抗原检索溶液冷却至 RT. 将稀释后的抗原检索溶液储存在 4°C，如果需要，可重复使用多达 2 倍。
8. 使用 TBST 将幻灯片 3x 洗涤 5 分钟。

3. 免疫标签和自荧光淬火

注:表 1详细介绍了以下步骤中使用的阻塞缓冲区的组成。

1. 在轻柔摇动（30~50 rpm）下，在 RT 下孵育阻塞缓冲区 1 中的 2 小时部分。用石蜡膜密封，避免干燥。
2. 不洗，立即将100μL稀释的兔多克隆抗人类血性组蛋白H3（citH3）抗体（0.03毫克/mL稀释在阻塞缓冲液1）直接涂抹在滑道上。
3. 在每个部位放置盖玻片（24 毫米 x 40 毫米 x 0.13*0.17 mm），以便均匀分配抗体混合物。
4. 在4°C下孵育12~16小时，轻轻摇动（30~50 rpm）。用副膜密封，避免干燥。
5. 用 TBST 清洗 3x 5 分钟。
6. 将100 μL的山羊抗兔抗体结合在Alexa Fluor 488（稀释至最终浓度0.04毫克/mL或1:50在阻塞缓冲液1）上，如步骤3.3所述。在轻柔摇动（30~50 rpm）下，在 RT 处孵育 1 小时。保护幻灯片免受光线照射。
7. 用 TBST 3x 清洗 5 分钟。
8. 在温和的摇动（30~50 rpm）下，在4°C下在阻塞缓冲器2中孵育部分过夜。防光。
9. 用 TBST 3x 清洗 5 分钟。
10. 阻塞缓冲区 3 中的块段，如 RT 步骤 3.3 中所述的 2 小时在温和摇动（30~50 rpm）下。
11. 在4°C下孵育具有生物微粒多克隆兔抗人类NE抗体的部分（阻堵缓冲液3中的最终浓度=0.2微克/米）为12~16小时，如步骤3.2~3.4所述。
12. 用 TBST 3x 清洗 5 分钟。
13. 与Alexa Fluor 594链球菌素结合（稀释至1:100或0.02毫克/米L在阻塞缓冲液3）如步骤3.2~3.3 1小时RT所述。
14. 用 TBST 1x 清洗 5 分钟。
15. 按照制造商的指示，将 100 μL 的自荧光淬火溶液混合物直接涂抹在部分上 1 分钟。
16. 立即用 TBST 6x 清洗幻灯片 10 分钟。
17. 在黑暗中用 100 μL 300 nM DAPI 覆盖每张幻灯片 5 分钟。
18. 用 TBST 清洗 3 分钟，重复此操作共 5 倍。
19. 将一滴（±50 μL）的防褪色安装介质（自动荧光淬火套件的一部分）直接涂抹在部分周围的玻璃滑轨上。将盖玻片（24 毫米 x 40 毫米 x 0.13×0.17 毫米）轻轻放在该部分，而不会产生任何气泡。
20. 允许样品在 4°C 的黑暗中固化过夜，直到安装介质硬化，以便使用浸入镜片进行显微分析。

4. 嗜中性细胞外陷阱识别

注:以下协议使用带有 1，280 x 960 数字 CCD 摄像机的倒置出物显微镜（参见材料表）。

1. 要定位血栓，使用具有10倍目标的相位对比显微镜，沿主动脉的长度、主动脉分叉和每个股骨动脉进行颅骨扫描。血栓是一种包含红血球、白血球和血小板的组织聚集，在相位对比和明亮场显微镜下与内皮体相邻（图2A，图2B）。
2. 首先检查使用 DAPI 通道（激发 = 357/44 nm）具有 10 倍和 20 倍目标的 NT 部分（图 2C）。请注意，当在相位对比或明亮场显微镜上看到时，cfDNA显示为不凝聚的DNA，不在细胞细胞质范围内。
3. 识别德州红通道（激发 = 585/29 nm，发射 = 628/32 nm）和绿色荧光蛋白通道（激发 = 470/22 nm，发射 = 525/50 nm）上的细胞外 NE 和 citH3，分别具有 10、20 和 40 倍的目标。
4. 使用可用的软件（如图像 J （NIH））评估和分析血栓中的 NET。NET形成基于cfDNA、细胞外citH3和NE的共定位（如前所述^的18）进行识别。在整个图像采集过程中，保持每个通道的一致的曝光时间和增益，以避免像素强度饱和。
5. 将每个血栓基于其与降序主塔的邻近程度映射，将其划分为三个相等的区域，区域 1 最接近主主塔，区域 3 最远于主塔，区域 1 和 3 区域之间的区域 2）。由于操作员对每个受试者的医疗状况视而不见，因此在每个区域中至少采用十个随机字段。通过在每个区域中平均带 NET 的字段数或计算每个区域的平均 NET 占用面积，描述国家电信电子指标在血栓中的分布情况。

结果

利用该协议进行除石蜡化、热诱导抗原检索和石蜡嵌血栓的双重免疫标签，我们首次确定了猫科动物CATE中的NET。主动脉分叉内的血栓通过荧光显微镜和亮场显微镜使用标准H&E染色和相位对比显微镜定位。在明亮的田间显微镜下，猫动脉血栓由红血球、白细胞、纤维蛋白和血小板组成（图3A）。虽然H&E不能染色特定的NET组件，但NET经常作为围绕附近红细胞和白细胞的各种长度?...

讨论

我们描述了一种协议，使用双免疫标记协议和免疫荧光显微镜识别固定猫科动物心电源动脉血栓中的NET。虽然只有心电动脉血栓被染色，但理论上，这种协议可用于其他类型的血栓和其他兽医物种。猫动脉血栓内NET的识别表明，NET在猫的血栓形成中可能起一定的作用。

在固定和石蜡嵌入组织中通过免疫荧光检测NET优于H&E等传统组织学污渍，后者通常显示由嗜中性粒细胞包围?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate	ThermoFisher Scientific	Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x	ThermoFisher Scientific	AMEP4681	NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x	ThermoFisher Scientific	AMEP4682	NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x	ThermoFisher Scientific	AMEP4699	NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	ThermoFisher Scientific	Catalog # A32723
Goat serum	Jackson Immuno Research Labs	Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody	Bioss Antibodies	Bs-6982R-Biotin	Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40	Pierce	Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides	Thomas Scientific	Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum	Life Technology	Catalog # 10510
Target Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400