无标记基因删除由絮凝血盒等位基因交换突变在衣原体沙眼

摘要

本文描述的是使用絮状盒状体等位基因突变（FLAEM）在衣原体沙眼中进行靶向、无标记基因删除的方法。

摘要

衣原体沙眼是一种强制性的细胞内病原体，在历史上一直难以进行基因操作。由于缺乏遗传工具，在阐明沙眼菌用来创造和维持一个特权细胞内利基的机制方面，进展有限。幸运的是，基因操纵技术最近有了新的进展。其中包括荧光报告等位基因突变（FRAEM）的发展。该方法允许靶向基因删除，同时插入编码抗生素耐药性和绿色荧光蛋白（GFP）的选择盒。由于极性对下游基因的影响，在靶向多cistronic操作器中的基因时，依赖这种策略可能会很复杂。浮环盒等位基因交换突变（FLAEM），本文描述的方案，是为缓解盒引起极性效应而开发的。FLAEM利用Cre-loxP基因组编辑，在以等位交换定向删除后去除选择盒。生成的菌株包含一个或多个编码序列的无标记基因删除。该技术有助于直接评估基因功能，并扩展了C.沙眼遗传操作工具的系列。

引言

衣原体沙眼是细菌性传播疾病的主要原因，对人类健康构成重大负担。每年有超过1亿人感染沙眼病^。尽管对生殖健康有害，如盆腔炎、宫外孕和/或不育，但大约70%的妇女感染无症状。疾病后遗症与由C.沙眼感染²引起的免疫病理学直接相关。有效的疫苗尚未开发;因此，了解细菌毒性因子和其他细菌基因产物的功能是一个重要而紧迫的研究课题。

由于细胞内细菌、宿主细胞入侵、细胞内复制、后代释放和宿主免疫反应的逃避是关键过程。C. 沙眼形成寄生膜结合的气穴，称为内含物，用于细胞内发育。通过III型分泌系统（T3SS）3分泌效应蛋白，可以建立内含物和许多其他关键过程。由于沙眼的遗传性不通性，这些分泌效应器的功能被限制了很多年。与大肠杆菌不同，许多经典的克隆技术不适用于衣原体。几个主要的限制包括转换效率，缺乏反选择记者，如sacB，和质粒维护。大肠杆菌质粒通常可以无限期地维持与复制的起源和适当的选择性压力，C.沙眼质粒需要额外的8个开放读取帧（pgp1-8）的维护，发现在原生pL2质粒在L2血清质粒^4。

近年来，已经产生了多种基因工具，以适应衣原体的独特生物学，但仍有限制^5，6，7。通过乙基甲酸酯（EMS）处理的化学诱变可以引入失义突变，或者（不太频繁）可能导致核苷酸转化，引入过早停止的柯顿，产生无意义突变^8。转位子插入是有效的基因破坏，但目前技术在衣原体研究是费力和费时的^9。EMS治疗和转波龙诱变技术都会产生随机突变，需要严格的筛选方法来分离突变菌株。一种通过插入II组内子（例如，TargeTron）来破坏基因的方法允许定向诱变;但是，此方法受效率的限制，并且插入站点并不总是正确预测¹⁰。

荧光报告等位基因交换突变（FRAEM）是一种用于靶向基因删除的策略，同时插入一个提供抗生素耐药性的选择盒和荧光报告器^11。然而，FRAEM由于盒式极性效应对下游基因的影响而变得复杂，特别是当靶向多cistronic操作体中的基因时。花环状体等位基因交换突变（FLAEM）是一种新型的遗传方法，旨在缓解以前用FRAEM选择盒¹²观察到的盒式极性效应。FLAEM利用Cre-loxP基因组编辑来去除选择盒和恢复下游基因的表达。含有抗生素耐药性和绿色荧光蛋白（GFP）的选择盒通过侧翼loxP位点进行了重新设计。这些loxP位点可以在存在Cre重组酶的情况下重组，导致从基因组¹³中切除盒。这一策略已被证明，以减轻盒诱发的极性效应，当目标tmeA删除^12，14。

FRAEM 和 FLAEM 方法都使用相同的自杀载体 pSUmC 4.0，可通过pgp6的诱导表达有条件地保持这种载体。pgp6的表达先前已被证明是质粒保留所必需的，因此用于控制质粒维持^11，15。当C.沙眼在介质中生长，辅以无水四环素（aTc）诱导pgp6表达时，保持向量。在没有 aTc 的情况下，矢量将丢失。通过选择盒基因的等位交换，实现靶向基因删除。目标基因的上游和下游直接的3 kb区域作为重组的同源臂。这些手臂被克隆到选择盒的两侧pSUmC 4.0矢量中。通过荧光报告观察成功的C.沙眼转化和重组事件。在选带盒中的载体骨干和gfp上表达mCherry会产生红色和绿色荧光内含物。一旦从培养培养物中去除aTc，仅绿色内含物表示成功重组事件，自杀载体的丢失和选择盒与细菌基因组的整合。

FLAEM 代表 FRAEM 的扩展，它通过随后将 Cre 重组酶表达载体 pSU-Cre 转换为新创建的突变菌株。Cre 重组酶有助于loxP位点之间的重组和选择盒的切除。重组事件通过荧光报告表示。pSU-Cre矢量编码mCherry;因此，成功转化通过添加红色荧光到gfp-表达内含物。在没有选择性压力的情况下培养盒式磁带会导致在 loxP位点进行 Cre 介导重组，而盒式磁带的丢失由仅红色内含物指示。与 pSUmC-4.0 一样，pgp6的诱导表达用于有条件地维持 pSU-Cre。一旦消除aTc和抗生素选择，质粒被治愈，由此产生的无标记缺失菌株是非荧光的。该方法解决了盒式极性效应问题。

研究方案

1. pSUmC-4.0的设计和组装，具有与兴趣基因特有的同源武器

1. 识别直接用于删除的基因的上游和下游的 ±3 kb 区域，作为同源重组的 5' 和 3' 同源臂（图 1）。
2. 设计 PCR 引源到 1） 从衣原基因组 DNA 和 2） 放大 3 kb 5' 同源臂和 2） 包含 15–30 bp 悬伸特定于 pSUmC-4.0 时在 Sall 限制酶位点消化。确保与 pSUmC-4.0 重叠的引基区域的熔融温度为 55°C，并且整个引基的发夹熔合温度为 <35 °C。
3. 设计 PCR 引源到 1） 从衣原基因组 DNA 和 2） 放大 3 kb 3' 同源臂和 2） 包含 15–30 bp 悬伸特定于 pSUmC-4.0 时在 SbfI 限制酶位点消化。确保与 pSUmC-4.0 重叠的引基区域的熔融温度为 55°C，并且整个引基的发夹熔合温度为 <35 °C。
4. 设计PCR筛选引源，在DNA组装反应¹⁶后，将每个同源臂放大到pSUmC-4.0载体中。在限制位点外设计这些引体以 ~500 bp，以便轻松可视化 PCR 产品，即使插入不成功（图 1）。
5. 通过PCR从新鲜提取的衣原体基因组DNA中放大3 kb 5' 和3'同源性手臂，在一到二个反应中产生足够的片段，供以后的DNA组装。遵循DNA聚合酶制造商的协议，针对特定的反应设置和循环条件。
6. 验证两种 PCR 产品的大小是否正确，并且反应不含任何污染带。在1%脱氧核糖凝胶上运行5μL的每种PCR反应。
7. 通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀来净化和浓缩PCR片段。
   1. 将所有 3' PCR 反应汇集在 1.5 mL 管中，在无核酸酶 H₂O 下最终体积达到 200 μL。
   2. 将200μL的苯酚加入每管和涡旋30-60秒。在室温（RT）下，在±gt;21，000 x g的微离心机中旋转每根管20分钟。
   3. 将每个管的水相顶层转移到新的1.5 mL管中，将3M醋酸钠的十分之一的体积添加到每个管中，然后轻拂混合。
   4. 在每个管子中加入3卷100%乙醇，然后轻弹混合。在-80°C下孵育两个管20分钟。
   5. 在RT处将每根管子旋转到>21，000 x g5分钟，从而将DNA压碎。
   6. 用 100 μL 的 70% 乙醇清洗 DNA 颗粒。在RT处将每根管子旋转5分钟，以>21，000 x g旋转5分钟。丢弃上清液。
   7. 用100μL的100%乙醇再次清洗DNA颗粒。在 RT 处旋转每个管材 >21，000 5 分钟。丢弃上清液。
   8. 让颗粒完全风干，然后轻轻重新悬浮DNA在12 μL的无核酸酶H₂O通过轻拂混合。
8. 根据制造方案，在20μL反应中，用1个单位的Sall和1个单位的SbfI，在20μL反应中消化500 ng的pSUmC-4.0载体。孵育反应约3小时或过夜，以确保对载体的完全消化。
9. 如前所述，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀（步骤1.7.1~1.7.9）净化和浓缩消化的骨干。
10. 将消化的 pSUmC-4.0 矢量和 5' 和 3' 同源臂 PCR 产品结合在一起，每同源臂的比率为 0.01 pmol pSUmC-4.0 至 0.09 pmol。根据制造方案，在DNA组装反应中组装片段。
11. 使用 1 μL 的 DNA 组装反应，将 50 μL 的电能大肠杆菌转化。将转化的大肠杆菌板板板板内含有 100 μg/mL 规格霉素，每板分布 150 μL。在37°C过夜孵育板。
12. 第二天，使用荧光倒置显微镜进行绿色和红色荧光的屏幕菌落。每个琼脂板总共有5~30个菌落。
13. 挑选5~10个菌落，接种4 mL的LB肉汤，辅以100微克/mL的霉素。在 37°C 过夜孵育培养物，在 250 rpm 下摇动。
14. 使用隔夜大肠杆菌培养物，进行小规模DNA纯化。用50μL的无核酸酶H₂O洗脱DNA。
15. 使用 PCR 筛选引基（在步骤 1.4 中设计）确认每个同源臂插入 pSUmC-4.0 矢量中，以放大每次插入。如果 DNA 组装成功，应在 5' 和 3' 臂区域的 1% DNA Agarose 凝胶中观察到 ±4 kb PCR 产物。±1 kb PCR 产品表示缺少插入。
    注:如果在双片段装配反应中插入同源臂失败，则单独执行两次装配反应以插入 5' 臂，然后插入 3' 臂。在与 5' 臂组装之前，仅用 Sall 消化矢量，然后用 SbfI 消化矢量以组装 3' 臂。
16. 变换大坝^-/dcm^-具有 200 ng 的 pSUmc-4.0 的合格大肠杆菌，用两个同源臂组装。将转化后的细菌盘到含有100μg/mL的光谱霉素的LB琼脂板上，每盘散播25μL。在37°C过夜孵育板。预计总共有20-200个殖民地。
17. 如步骤 1.13 所述，筛选红色和绿色荧光菌落的板。
18. 通过接种含有100μg/mL光谱素的100 mL含有红色和绿色菌落的LB肉汤，建立大规模DNA纯化培养物。在 37°C 过夜孵育培养基，在 250 rpm 下摇动。
19. 利用大规模DNA纯化收获培养物，纯化DNA。
    1. 在NF-H₂O的100μL中重新悬浮纯化质粒DNA。总DNA收率至少为2微克/μL，是C型沙眼转化的理想选择。
    2. 对5'和3'同源臂区域进行序列，以确保在转化C.沙眼之前正确组装成pSUmC-4.0。

2. C.沙眼病与pSUmC 4.0的转化 – 同源性武器通过等位交换进行基因删除

1. 种子麦科伊细胞，小鼠成纤维细胞标准用于培养衣原体，成两个6孔板（1 x 10⁶细胞/孔）与生长培养基#1。在 37°C 下用 5% CO₂孵育板，直到单层汇合（约 24 小时）。
2. 在 1.5 mL 管中，加入一体积的C. 沙眼 WT血清Var L2 基本体 （HB），足以在 MOI 为 2 时感染 6 孔板的 12 口井。将 EB 在 >20，000 x g处进行 30 分钟，然后丢弃上清液。
3. 通过轻轻地在 CaCl₂缓冲液的 600 μL 中重新悬浮 EB，然后向管中加入 24 μg 的 pSUmC-4.0 + 同源臂，启动衣原体转化。轻拂轻轻混合溶液。在 RT 孵育管子 30 分钟，每 10 分钟轻拂一次混合。
4. 将转化溶液添加到 24 mL 的汉克斯平衡盐溶液 （HBSS） 中，并通过轻轻移液进行混合。将2 mL的接种液转移到6个孔板中每个孔的汇合McCoy细胞，并在20°C下以900 x g离心感染1小时。
5. 拆下接种液，并更换为 2 mL/well RPMI 增长介质#2。在37°C下用5%的_CO2孵育板。
6. 至少 7 小时后，但不超过 12 小时，将介质更换为 2 mL/井的选择介质#1。从感染时起，在37°C继续孵育48小时。
7. 收获细菌，并将细菌转移到麦考伊细胞的新鲜单层上。
   1. 使用细胞刮刀，轻轻刮擦麦考伊单层，将细胞提升到介质中。将材料从每个井转移到 2 mL 管中。在4°C下，在微离心机中以>20，000 x g的细胞材料粒度30分钟。
   2. 拆下并丢弃上清液。通过轻轻移液将细胞颗粒重新悬浮在 1 mL 的 HBSS 中。
   3. 在 4°C 下以 200 x g将细胞碎屑颗粒 5 分钟。将上清液转移到一口新的康体麦考伊细胞井上。在每个井中额外添加 1 mL 的 HBSS，总体积为 2 mL/口。
   4. 在20°C下，在900 x g下离心1小时。感染后立即用选择介质#1更换接种。
8. 继续将细菌传给每48小时一次的McCoy细胞（第2.7节），进行三个或三个以上通道，直到使用感染后24 h的荧光倒置显微镜（24 hpi）检测到红色和绿色内含物。
9. 检测到红色和绿色夹杂物后，继续使用选型介质#2通过单层（第 2.7 节）。
10. 继续传去单层，直到检测到仅绿色的内含物24 hpi（#3或更高版本），这表示pSUmC-4.0载体的丢失，并将loxP选择盒纳入基因组。
11. 选择一口仅含绿色的内含物，通过传用来丰富。在蔗糖-磷酸盐-谷氨酸缓冲液（SPG）中也含有仅含绿色的含泥剂的任何其他油井进行收获和冷冻。
    1. 为了丰富仅含绿色的内含物，从步骤 2.7 中完成的 6 孔板的一口井中通过单层，但在对细胞碎片进行颗粒（步骤 2.7.3）后，将上清液转移到具有 12 mL HBSS 的锥形中。使用此接种液通过每口井加入 2 mL 来感染两个 6 孔板，然后在 20°C 下以 900 x g旋转板 60 分钟。
    2. 要冻结额外的油井，如步骤 2.7.1 中那样收获单层，但将颗粒重新悬浮在 1 mL SPG 而不是 HBSS 中。将细胞碎片（步骤2.7.3）粒化，并将上清液转移到1.5 mL冷冻管中。将材料冷冻在-80°C。
12. 在将仅绿色内含物浓缩到 0.5–1.0 的 MOI（检测后再增加一到两个通道）后，如步骤 2.11.2 所述，将单层收获到 SPG 中。在 1.5 mL 管中获得 50 μL 的等分，并在 -80°C 冷冻。
13. 滴青细菌测定内含物，形成单位/μL，根据标准滴定方案^17。

3. 仅绿色C. 沙眼缺失突变体的克隆隔离，通过限制稀释，包含loxP带状选择盒

1. 在生长培养基#1中，在+2，000个细胞/孔中，用50μL的McCoy细胞播种384孔组织培养板。在 37°C 下孵育，5 % CO 2，+24 小时或直到汇合。
2. 稀释哈佛商学院中仅绿细菌的等分，达到每 20 mL 的 +50 EB。将稀释的接种液转移到储液罐托盘上。
   1. 将整个板倒置到废物容器中，将介质从 384 孔板中取出。使用多通道移液器，在每个井中加入 50 μL 的C. 沙眼接种液。在20°C下，在900 x g下离心1小时。
      注意:请注意，不要轻弹太重，以至于单层分离。如果细胞过度汇入，它们将更容易分离。
3. 轻拂并更换50μL/井生长介质#2，取出接种。在 37°C 下孵育板，CO₂为 5%。
   注:在此阶段，选择盒与基因组的整合是稳定的，因此不再需要使用光谱霉素选择抗生素。
4. 在培养板5~12天后，使用荧光倒置显微镜或高含量筛选平台，用绿色荧光内含物识别单个孔。
5. 用p-10尖端刮取单层，并将油井的全部内容物转移到含有2 mL的HBSS管中，用仅含绿色的内含物收获油井。轻轻混合，将2 mL的接种液涂抹在6孔板中，将2 mL的接种液涂抹在一个新的康康麦科伊单层上，以进行感染。
   注: 在确定包含物的单个井时，由于初始包含的扩展，内含物将位于群集中。如果一口井有多个群集，则可能有多个 EB 最初感染了该井。这些井不应被收获，在某些情况下，可能需要通过连续稀释进行多轮克隆隔离。
6. 在20°C下，在900 x g下离心1小时，感染6孔板。将接种液更换为 2 mL/油井生长介质#2。在 37°C 下孵育，5 % CO₂孵育 48 小时。
7. 重复步骤 2.11–2.13 以丰富、冻结和位子克隆种群。
8. 确认使用qPCR从克隆分离的C.沙眼病中删除靶向基因，如前所述^12。

4. 用 pSU-Cre 转换C. 沙眼瘤FRAEM 突变体以启动去除loxP带刺的选录盒

1. 使用克隆分离的C. 沙眼 FRAEM突变体、pSU-Cre 矢量和选择介质#3在 6 孔板中重复变换过程（步骤 2.1~2.8）。
   注: 成功的变换由红色和绿色荧光的内含物指示。
   1. 使用表氟倒置显微镜检测仅红色内含物，从而通过单层，指示选择盒（两到三个通道）丢失。继续传去单层，直到仅红色内含物浓缩到±0.5的MOI。
2. 如前所述（步骤 3.1~3.8），通过限制 384 孔板中的稀释，从而完全隔离仅红色内含物;但是，对所有步骤使用选择媒体#3。
3. 通过传递来丰富克隆种群，直到 MOI 为 0.1。一旦浓缩，用生长介质#2替换截面介质，以启动 pSU-Cre 矢量（大约三到四个段落）的损耗。
4. 克隆分离非荧光细菌（步骤3.1~3.8）;但是，使用明场显微镜手动扫描板以检测内含物。丰富和冻结细菌（步骤 2.11~2.12）。
5. 屏幕突变应变使用定量实时PCR，西方印迹，和全基因组DNA测序如前^所述12。

结果

使用FLAEM在C.沙眼中无标记基因删除的方法依赖于谨慎的克隆和转化技术。成功的等位基因重组是一个基本的第一步，需要识别和插入同源臂到pSUmC-4.0克隆载体（图1）。无标记基因删除的一个基本第二步是通过Cre-lox基因组编辑去除荧光报告器和抗生素选择盒，如图2所示。用于完成每个步骤的矢量在图 3中进行了批出。

讨论

此处描述的FLAEM在沙眼病中生成无标记基因缺失的协议允许有针对性地删除非必需基因，并消除盒式极性效应。该协议依赖于对插入pSUmC 4.0自杀载体的5'和3'同源臂的精心设计，对沙眼的有效转化，以及对分离的突变菌株的仔细筛选。通过这种方法成功的基因组工程导致细菌是非荧光的，并在靶向基因删除部位包含单个loxP疤痕序列。此外，该方法有可能适用于同一C型沙眼菌?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE Scientific	BMK-A1705	Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride	ACROS Organics	233131000
CaCl2 Buffer			10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	C7902-500G	Suitable for cell culture
Cycloheximide	Sigma	7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli	New England BioLabs	C2925H
DMSO	ATCC	4-X	Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid	Sigma	G8415-100G	L-Glutamic acid
Growth Media #1			RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2			RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x)	Gibco	24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS)	Gibco	A38402-02
McCoy Cells	ATCC	CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England BioLabs	T1010S	Small scale DNA purification
NaH2PO4	Sigma	S3139-250G	Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4	Sigma	S5136-500G	Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells	New England BioLabs	C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit	New England BioLabs	E5520S	Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-10MU	Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162	Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase	New England BioLabs	M0515	Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x)	Gibco	11875-093	Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF	New England BioLabs	R3138S
Sbfl-HF	New England BioLabs	R3642S
Selection Media #1			RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2			RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3			RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution	Sigma	S7899-100ML	3M
SOC Outgrowth Medium	New England BioLabs	B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade	Alfa Aesar	J61820
Sucrose	Sigma	S1888-1KG	Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG)			37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris	AMRESCO	0497-5KG	Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25200-056	0.25%
Water	Sigma	W3500-500ML	Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture