使用基于路西法抹去的生长测定，确定化学抑制剂对细胞内弓形体贡迪生长的抑制效率

摘要

本文介绍的是一种协议，用于使用基于荧光酶的生长测定来评估化合物对弓形体淋酸体内生长的抑制作用。该技术用于通过基因删除相应的靶基因来确认抑制特异性。以LHVS对TgCPL蛋白酶的抑制为例。

摘要

弓形虫是一种原生动物病原体，广泛影响人类。目前用于治疗临床弓形虫病的抗生素是有限的。此外，它们在某些人群中表现出不良的副作用。因此，发现临床弓形虫病的新药势在必行。新型抗生素开发的第一步是使用高通量筛选策略识别在抑制寄生虫生长方面表现出高疗效的化合物。作为一种义务细胞内病原体，弓形虫只能在宿主细胞内复制，这禁止使用光学吸收度测量作为生长的快速指标。此处介绍的是基于荧光酶的生长测定的详细协议。例如，该方法用于计算野生型弓形虫寄生虫的倍增时间，并测量莫诺林-利基-同苯-乙烯磺胺苯基（LHVS，一种半胱氨酸蛋白酶靶向化合物）对抑制寄生虫细胞内生长的疗效。还描述了一个基于CRISPR-Cas9的基因删除协议在弓形体使用50bp同源区域进行同源相关重组（HDR）。通过量化LHVS在野生型和TgCPL（弓形体cathein L样蛋白酶）缺乏寄生虫的抑制作用，表明LHVS抑制野生型寄生虫生长比μcpl生长更有效，这表明TgCPL是LHVS结合到弓形虫的目标。这种基于荧光酶的生长测定具有高灵敏度和易于操作，因此适用于监测弓形虫的增殖和以高通量方式评估药物疗效。

引言

弓形虫是一种非常成功的细胞内寄生虫，它感染了大约三分之一的人类。其高传播率主要得益于其不同的传播途径，包括食用未煮熟的肉类、接触哺乳动物的水库以及分娩期间的先天性传播。T. Gondii主要导致机会性感染，可导致免疫功能^,低下的个人^{1，2，3，4，5，62,3}的严重发病率和死亡率。^4,5,61目前用于治疗急性弓形虫病的抗生素在治疗先天性和潜伏性感染方面效率特别低^{，在3、7、87,8}引起严重反应。³因此，迫切需要确定新的治疗方法。了解弓形虫及其宿主中亚细胞过程的差异将有助于确定潜在的药物靶点。因此，需要高效和方便的基因组操作技术来研究弓形体中单个基因的作用。此外，弓形虫属于植物性阿皮金，其中包括其他几种重要的人类病原体，如疟原虫和隐孢子虫。因此，弓形虫可以作为模型有机体，以帮助研究其他阿皮质寄生虫的基本生物学。

为了识别针对微生物病原体的新型抗生素，最初对化合物库进行了高通量筛选，以确定其在抑制微生物生长方面的有效性。到目前为止，已经开发出几种基于微孔板的生长测定法，用于测量T的细胞内生长。 贡迪（即放射性³H-uracil基于合并的定量^9，定量ELISA为基础的寄生虫检测使用T.贡迪特异性抗体10，11，记者蛋白质为基础的测量^10,11使用β-加拉西西酶或YFP表达弓形虫菌株^{12，13，,13}和最近开发的高含量成像检测^14）。

这些个别策略都有独特的优势;但是，某些限制也限制了其应用。例如，由于弓形体只能在核动物细胞内复制，因此自荧光和非特异性结合抗T.贡迪抗体对宿主细胞的宿主细胞会导致荧光测量的干扰。此外，使用放射性同位素需要特殊的安全合规性和潜在的安全问题。其中一些测定更适合在单个时间点评估增长，而不是持续监测增长。

此处介绍的是一种基于荧光酶的协议，用于定量细胞内弓形虫生长。在以前的研究中，NanoLuc Luciferase基因在弓形体图布林促进剂下被克隆，这种透明酶表达结构被转染成野生型（RH_ku80+hxg菌株）寄生虫，以产生RH_ku80=hxg::hxgNLuc菌株（ku80称为RH_ku80::后NLuc） ^15。ku80在这项研究中，这种菌株作为父母在细胞内生长测定和基因缺失的菌株。使用RH_ku80::NLuc菌株，在感染后96小时期间监测人类前皮纤维细胞（HFFs）中的寄生虫生长，以计算寄生虫加倍的时间。

此外，通过绘制弓形虫酸的增长率以确定IC₅₀值，可以确定LHVS对寄生虫生长的抑制作用。此前有文献记载，TgCPL是寄生虫中LHVS的主要目标，使用LHVS治疗可减少急性和慢性^,17,18,19弓形虫^{感染的发展}。此外，RH_ku80::NLuc用作用于基因组修饰的父母菌株，以产生TgCPL缺陷菌株（RH+ku80=cpl::NLuc），并针对此突变体测量 LHVS 的抑制。通过观察TgCPL缺乏寄生虫中LHVS的IC₅₀值与WT菌株相比的向上变化，经验证TgCPL是LHVS体内的目标。

在此协议中，RH_ku80::NLuc用作父母应变，缺乏有效的非同源端联通路（NHEJ），从而促进双交叉同源性重组（HDR）20，21。^20,21此外，50 bp 同源区域在 PCR 的耐药盒的两端侧翼。PCR 产品用作修复模板，使用基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑工具通过 HDR 去除整个基因位点。这种短的同源区域可以很容易地集成到底漆中，为维修模板的生产提供了方便的策略。可以修改该协议，执行通用基因删除和内源基因标记。

例如，在我们最近的出版物中，三个蛋白酶基因，TgCPL，TgCPB（弓形体乙型蛋白酶）和TgSUB1（弓形体亚骨素样蛋白酶1），在TgCRT（弓形素氯奎酮抗药性运输器）中基因消解，缺乏寄生虫使用这种方法^15。 TgCPB此外，TgAMN（一种假定的氨肽酶N[TgAMN，TGGT1_221310]）被内质标记¹⁵。Lourido实验室还报告说，使用40-43bp范围内的短同源区域，使用类似的方法²²在弓形体基因组中引入位点基因突变和内源基因标记。这些成功的基因组修改表明，40-50bp同源区域足以在TgKU80缺陷菌株中进行有效的DNA重组，这大大简化了弓形虫腺的基因组操作。

研究方案

弓形虫贡迪被分类在风险组 2 中，必须在生物安全级别 2 （BSL-2） 处理。该议定书已得到克莱姆森大学机构生物安全委员会的审查和批准。

1. 基于路西法删除的弓形虫生长测定

1. 在寄生虫接种前1周种子人类前皮成纤维细胞（HFFs），以确保宿主细胞完全融合。在透明板中进行模拟测定，以确保寄生虫在整个评估过程中保持细胞内。
   注:在这里，测定是在96孔微孔进行。根据实验需要，可扩展到384或1536孔微板。
2. 在使用前2天将弓形虫寄生虫转移到T25烧瓶中，将±0.3-0.4 mL完全裂原的寄生虫转移到汇出的HFF。在37°C下孵育受感染的宿主细胞，2天用5%的_CO2孵育。
3. 注射器5 mL的新鲜磨碎的寄生虫通过21 G安全针5倍，以释放细胞内寄生虫，然后通过3μm过滤器去除宿主细胞碎片。使用7 mL无酚D10介质从烧瓶中冲洗残留的寄生虫，然后再次通过过滤器。
4. 在室温 （RT） 下，在 1000 x g下离心寄生虫 10 分钟。倒入上清液，在10 mL无酚无红D10介质中重新悬浮颗粒。
5. 使用血液测量仪对寄生虫进行计数以确定浓度。
6. 将寄生虫稀释至1 x 10⁴寄生虫/mL，用于野生类型 （WT） 菌株。对于生长缺乏的寄生虫菌株，相应地增加浓度，以观察到荧光酶信号的显著增加。
7. 从96个孔微孔中小心吸气介质，预置氢氟碳化合物，以三列和五行的形式将150μL的寄生虫重新悬浮到井中，代表三个技术复制和五个时间点。
8. 在37°C和5%CO₂孵育微板4小时。
9. 小心地从井中吸气介质，去除未入侵的寄生虫，然后在每排用RT酚无红介质填充井中（第一行除外）。
10. 混合等量的PBS和2x荧光酶测定缓冲液，将荧光酶基板稀释至12.5μM。
11. 将 100 μL 的稀释荧光酶基板添加到顶排的每个井中。在RT孵育微板10分钟，使细胞完全解解。
12. 使用微孔板读取器测量荧光酶活性。板读取器设置列在表 1中。每一次读数表示感染后4小时入侵的寄生虫的初始数量。
13. 每行每 24 小时重复步骤 1.9-1.12，每 24 小时重复 4 天，而不更改介质。这些读数反映在感染后24小时、48小时、72小时和96小时复制的寄生虫总数。
14. 计算每个时间点的平均读数，并将它们除以 4 小时的平均读数，以确定寄生虫生长随时间的变化。
15. 使用图形软件绘制数据。图1A，B显示了具有代表性的生长读数表和RH_ku80::NLuc寄生虫的地块。ku80
16. 要计算加倍时间，请绘制在孵育时间各个时间点的折叠变化的 log2 值。使用线性回归函数计算斜率，该斜率表示每个应变的倍增时间（图 1A，C）。

2. 对弓形虫生长的化合物抑制效果评价

注:这里以对弓形体生长抑制性评价为例。测试了 8 种不同浓度的 LHVS，并针对 RH_ku80::NLuc和RH_ku80μcpl的NLuc菌株分别进行了三次技术复制。

1. 在寄生虫感染之前，将HFF的种子以三行和9列的形式，以96个井微板的形式，每个菌株进行一个生物复制。宿主细胞在使用前将被允许生长至少7天。
2. 在使用前 2 天通过RH_ku80::NLuc和 RH=ku80=cpl::NLuc寄生虫。按照步骤1.2-1.6进行寄生虫纯化和定量。在1 x 10⁴寄生虫/mL时，在无酚红介质中重新悬浮寄生虫。
3. 从含有汇液氢氟碳化合物的板中吸气介质，用150μL的寄生虫重新悬浮接种每个孔。在37°C和5%CO₂孵育微板4小时。
4. 通过连续稀释，在12口井储层中制备8个不同浓度的LHVS。通常，浓度以连续稀释的方式减少三倍。
   注:与最高浓度相比，最低浓度降低6，561倍。稀释的褶皱变化可根据不同化合物的不同特性进行相应调整。
5. 在感染后4小时，吸气介质去除未入侵的寄生虫，并从2-9栏中填充每口井，以150μL的介质补充不同浓度的LHVS。让第一列充满常规介质，作为未经处理的控制。
6. 在37°C和5%CO₂孵育微孔板，再延长96小时。
7. 执行步骤 1.9-1.11 并测量单个井的透明酶活性。
8. 平均从每个LHVS浓度的井中三个技术复制的荧光酶活性。
9. 将每个LHVS浓度的平均荧光酶活性除以从未经处理的寄生虫中提取的平均透明酶活性，以百分比计算正态的透明酶活性。
10. 使用图形软件根据单个 LHVS 浓度绘制标准化的荧光酶活性（图2）。对寄生虫生长抑制苯丙胺也作为对照进行测量。苯丙胺是一种临床抗生素，用于通过抑制弓形虫的叶酸代谢来治疗急性弓形虫病。
11. 在"剂量-反应抑制"回归程序下，使用图形软件中的嵌入式方法计算单个化合物的IC₅₀值，将正态响应与[抑制剂]进行规范化响应。IC₅₀使用以下公式计算:
    Y = 100/（1 = X/IC₅₀）
    地点:Y表示受感染细胞在不同浓度抑制剂下的正常透明酶活性，X表示抑制剂的个体浓度。

3.弓形虫寄生虫中基于CRISPR-Cas9的基因删除

1. 生成用于删除感兴趣的基因的质粒结构，表达指南RNA（sgRNA）和Cas9
   1. 转到www.ToxoDB.org并检索整个基因编码序列，包括内子和外音，以及 1.5 kb 5'-UTR 和 3'-TRS（未翻译区域）。
      注:此处，TgCPL（TGGT1_321530）作为具有代表性的示例。
   2. 将检索到的 TgCPL序列复制到序列分析软件中（有关名称和版本，请参阅材料表），并标注 5'和 3'-UTR 区域。
   3. 选择顶部菜单栏中的"工具"图标，然后选择"克隆 " |查找 CRISPR 网站。
   4. 为 PAM 站点位置选择3'（Cas9）'，并在特异性评分部分选择包含弓形虫基因组序列的文件夹。将其余设置保留为默认值。
   5. 选择具有以下两个条件的 sgRNA:1） 显示高特异性分数，通常 >98%，2） 在 NGG（原间隔相邻图案 （PAM） 序列之后缺少 G。选定的sgRNA通常位于靠近感兴趣基因的起始和停止的部位。
   6. 复制所选 sgRNA 的序列并将其粘贴到以下底漆模板中。
      
      红色部分表示选定的TgCPL sgRNA 序列。它可以被不同的sgRNA取代，用于各种感兴趣的基因。
      注:如果所选 sgRNA 不以 G 开头，则在 sgRNA 的开头添加 G 以帮助增强其表达。
   7. 执行PCR反应，修改先前存在的质粒表示sgRNA（图3A），该基因以弓形体尿素磷酸酯转移酶（TgUPRT）基因²³为目标，使用PCR预混与表2中提供的设置。
   8. 在琼脂胶凝胶上运行PCR产品，以确认成功放大。一个10 kb的PCR产品预计将被放大（图3B）。
   9. 使用DNA凝胶提取试剂盒提取PCR产品，并使用现场定向诱变试剂盒进行循环。有关配方，请参阅表 3。在RT孵化反应10-20分钟。
   10. 将圆形PCR产品转化为大肠杆菌，并挑选10个克隆，以进一步验证设计sgRNA的加入。
   11. 种植两个克隆和提取质粒。用 BamHI 和 EcoRV 切割纯化质粒。候选质粒将产生两个波段，在2.4 kb和7.2 kb（图3C）。
   12. 使用 M13 反向引物发送桑格测序的质粒，以确认TgUPRT sgRNA 成功更换为设计的 sgRNA（图 3D）。
2. 通过HDR机制生成基因删除修复模板
   1. 根据所选 sgRNA 的定位位，找到 50 bp 的 5'-UTR 或 3' -UTR 的目标基因进行同源相关重组（HDR，请参阅讨论部分）。区域的选择遵循以下标准，具体取决于 sgRNA 目标的位置。
      1. 如果 Cas9 的裂解位位于起始切口的上游，请选择以下内容:从裂解部位上游作为左 HDR 区域的 50 bp DNA 序列，以及从止流器 codon 下游作为右 HDR 区域的 50 bp DNA 序列。
      2. 如果 Cas9 的裂解位位于开始和停止协成之间，请选择以下内容:从起始 Codon 作为左侧 HDR 区域的起始切口上游的 50 bp DNA 序列，以及从停止 Codon 作为右侧 HDR 区域下游的 50 bp DNA 序列。
      3. 如果 Cas9 的裂解位位于止流器的下游，请选择以下内容:从起始切口上游作为左 HDR 区域的 50 bp DNA 序列，以及从裂解部位下游作为右 HDR 区域的 50 bp DNA 序列。
         注:对于TgCPL基因，裂解位位于启动和止停止子体之间。因此，以下底漆设计用于使用 pMDC64 作为模板放大维修模板，该模板对苯丙胺电阻盒进行编码。黑色锥形的序列到pMDC64质粒，用于PCR扩增。以红色标记的区域是TgCPL- 用于同源重组的特定序列。
         
   2. 在表 4中描述的 PCR 条件下，使用 PCR 预混料执行 PCR。
   3. 在琼脂胶凝胶上运行PCR产品（图3E），然后是凝胶提取和标准核酸定量程序。
      注:如果无法成功放大预期频段，请优化 PCR 条件和/或切换底漆对。
3. 弓形虫转染
   1. 在含有汇素氢氟碳化合物的T25烧瓶中通过RH+ku80::NLuc寄生虫2天。完全被冲冲的寄生虫的T25烧瓶足以进行两到三次转染。
   2. 步骤 1.2 中所述的注射器和过滤器纯化寄生虫。在细胞混合缓冲液中重新悬浮寄生虫，并在RT时以1，000 x g旋转10分钟。
   3. 用10mL的细胞混合缓冲液清洗颗粒化的寄生虫，并在RT时以1，000 x g旋转寄生虫10分钟。
   4. 小心地从上清液中倒入，以1 x 10⁸寄生虫/mL的浓度在同一缓冲液中重新悬浮寄生虫。
   5. 将 2 μg 的修复模板 DNA 与 20 μg 的 sgRNA/Cas9 表达质粒（质量比 = 1:5，相当于 1:3 摩尔比）混合。如果修复模板的放大率较低，请相应地减少两个DNA片段的输入。可以使用至少 0.5 μg 的维修模板。
   6. 在1.5 mL离心管中混合400 μL的寄生虫再悬浮、DNA和5 μL的200 mMATP/500 mM减少谷胱甘肽（GSH）。如果需要，使用细胞混合缓冲液将总体积达到 500 μL。
   7. 将寄生虫和DNA的混合物转移到电镀皿（4 mm 间隙宽度），并使用电穿孔器进行电穿孔（2 kV 电压，50 Ω 电阻）。
   8. 将电化寄生虫转移到含有新鲜D10介质中汇有氢氟碳化合物的T25烧瓶中。在24小时后应用适当的抗生素选择药物。
   9. 保持药物选择性压力，直到转基因寄生虫的生长稳定。
   10. 从挖空种群中纯化基因组DNA，并通过PCR检查热铁矿抗性盒与TgCPL位点的整合。经核实后，继续第3.4节。如果没有，执行另一轮寄生虫转染和药物选择。无法检测抗药性盒的正确整合通常表明目标基因是必不可少的，或者基因位点不可接近。
4. 克隆挖空寄生虫
   1. 在克隆寄生虫之前，用HFF细胞在37°C和5%CO2孵育1周。₂
   2. 通过含有汇源氢氟碳化合物的T25烧瓶中转基因寄生虫种群的±0.3-0.4mL，并种植2天。如果突变体表现出生长缺陷，请考虑传递更多的寄生虫。
      注:为了达到最佳的产生力和生存能力，宿主细胞被寄生虫严重感染，并且大多数寄生虫都保存在细胞内阶段。
   3. 如步骤 1.3 中提到的注射器感染的宿主细胞和过滤器纯化新鲜被水化的寄生虫。在D10介质中重新悬浮寄生虫，并在RT时以1，000 x g将其旋转10分钟。
   4. 在10mL的D10介质中重新悬浮颗粒化的寄生虫。
   5. 使用血液测量仪对寄生虫进行计数，以确定寄生虫的浓度。
   6. 进行两步稀释，使浓度在D10介质中浓度为10种寄生虫/mL，并辅以适当的抗生素。通常，最初的寄生虫再悬浮被稀释1，000倍，然后第二次稀释到10种寄生虫/mL。
   7. 96 孔微孔中的吸气介质含有汇入 HFF，并将 150 μL 稀释的寄生虫接种到每个井中。
   8. 在37°C下孵育板，5%CO_2，7天无干扰，允许斑块形成。如果转基因寄生虫表现出生长缺陷，潜伏期可能更长。
   9. 使用相位对比显微镜筛选板，并仅标记包含单个斑块的孔。
   10. 执行聚位 PCR 以识别正确的克隆。
       1. 使用移液器尖端刮起每个井的底部，以提升受感染的 HFF 单层。
       2. 移液器 75 μL 的电池重新悬浮从每个标记到 1.5 mL 微离心管。
       3. 在RT时，离心管以最高速度工作10分钟。小心地吸气上清液，并在10.25μL的压解缓冲液中重新悬浮，其中含有稀释缓冲液和试剂盒中提供的脱氧核糖核酸释放添加剂（材料表）。
       4. 在RT孵化样品4分钟，然后在98°C孵育2分钟。之后，样品可用于PCR或储存在-20°C，直到使用。三组PCR反应用于测试耐药盒的整合和感兴趣的基因的丧失（图4A）。有关 PCR 反应设置，请参阅表 5，有关热循环器设置的表 6。
   11. 识别正确的克隆，并将四个克隆转移到含有汇液的 T25 瓶中。
   12. 在单个克隆后，将宿主细胞进行纯化，以进行进一步的PCR验证。
   13. 如果有识别感兴趣的蛋白质的抗体，请遵循标准免疫膨胀程序，以验证在正确的弓形蛋白敲除液中的目标蛋白的丢失。用于筛选TgCPL-删除突变体的代表性图像如图4B、C所示。

结果

图 1表示 RH_ku80::NLuc应变的生长曲线示例及其加倍时间的派生计算。通常，对三种生物复制进行三种技术复制，以解释荧光酶活性读数的变化。为了计算寄生虫生长的正化褶皱变化，每次在感染后24-96小时读数除以感染后4小时的初始读数，这反映了测定中活寄生虫的起始量（图1A，B）。在确定寄生虫加?...

讨论

*本协议描述了一种基于荧光酶的协议，用于评估细胞内弓形虫的生长，并评估化合物对寄生虫生长的抑制作用。与现有的测量细胞内弓形虫生长的策略相比，该方法具有高灵敏度和特异性。在监测寄生虫生长时，建议在96孔微孔的模拟检测中确认测试菌株在评估期结束前不会过早压出宿主细胞。否则，发光读数将不能准确反映寄生虫的生长，因为弓形体只在宿主细胞内复制。<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel extraction kit	New England BioLabs	T1020L
BamHI	New England BioLabs	R0316S
Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader	BioTek Instuments
BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System	Harvard Apparatus
Chemically competent E. coli cells	New England BioLabs	C29871
CloneAmp HiFi PCR premix	Takara Bio	639298
Coelenterazine h	Prolume	301-10 hCTZ
EcoRV	New England BioLabs	R3195S
Phire Tissue Direct PCR Master Mix	Thermo Scientific	F170L
Plasmid miniprep kit	Zymo Research	D4054
Q5 Site-Directed Mutagenesis kit	New England BioLabs	E0554S
Software
Geneious software for sgRNA design (version: R11)
GraphPad Prism software (8th version)
SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)