血管化、扩展发育和改进显微镜成像的肾器官和器官培养的优化

摘要

本文描述了研究器官发育的两种方法，一种是改善鸟类胚胎中胆囊膜（CAM）的异种移植设置，允许培养胚胎器官和器官的血管化，以及一种新颖的固定z方向器官培养方法具有改进的实验条件，允许高分辨率延时共聚焦成像。

摘要

胚胎肾器官培养，特别是多能干细胞衍生肾器官，是跟踪发育过程和模拟肾脏疾病的绝佳工具。然而，由于缺乏血管化和功能性，这些模型受到限制。为了解决这个问题，开发了一种改进的方案，用于将细胞和组织移植到鸟类胚胎的胆囊膜（CAM），以获得血管化和恢复血流。嫁接上覆盖着定制的小型储层，将样品固定在CAM上，并为他们提供培养介质，防止移植物干燥。改进的培养方法允许异种移植物生长长达9天。手稿还描述了如何使用先前发布的固定 Z-方向 （FiZD） 方法，为肾器官和器官培养物的长期共聚焦成像提供最佳条件。该方法在大量介质中轻轻压缩玻璃盖玻片和膜之间的胚胎器官或器官，为长达12天的成像提供极好的条件。这些方法加在一起，允许血管化和血液流向肾器官和器官肾脏培养物，改善共聚焦成像。本文描述的方法对研究肾外活体的基本和应用功能非常有益。这两种方法都适用于各种类型的组织和器官。

引言

胚胎肾脏的有机体培养在几十年前^{11、2、32,3}成为研究肾病的重要模型。肾器官代表研究健康及患病肾脏发展的高级模型系统^4。然而，这两种方法的主要缺点是，这两种方法都没有概括肾脏的主要功能:血液过滤。肾管和肾血管在肾器官和器官培养中发展，类似于体内发育的早期阶段;然而，体外形成的球状物仍然是血管^5。前活体胚胎肾脏和肾器官的血管化以前仅在体内条件下的移植实验中被证明。例如，在小鼠肾胶囊下移植人类多能干细胞衍生的肾器官，使器官中的肾素发育到功能阶段^6。

纯体外培养体与体内移植方法之间的中间方法是对鸟类胚胎的CAM进行异种移植。血管化完整的小鼠肾原体已被证明以前使用这个系统^77，8。8然而，也显示，异种移植的鼠肾中的肾血管质来源于宿主内皮，而不是移植^9。这一观察大大降低了胚胎肾脏的嵌合体（鸟-哺乳动物）模型研究肾血管发育的潜力，因为实验条件对于供体源内皮细胞的生存是不许可的。

本议定书第一部分介绍了一种结合组织菌培养和异种移植的微环境条件，在禽蛋CAM上培育小鼠胚胎肾脏的改进方法。对以前方法的主要改进是，植入区域不是将小鼠胚胎肾脏和肾器官直接放在CAM上，而是覆盖着充满培养介质的渗透式小型储液罐，这些培养培养培养物为移植组织提供用营养，防止干燥。实验的成功率显著提高，供体血管发育条件得到改善。该方法在异种移植培养中的应用，导致由供体肾脏的内源内皮细胞组成的球状血管发育。

细胞形态发生的详细分析是肾脏培养模型的另一个重要应用。先前报道的肾脏培养的延时图像采集方法仅可用于分析胚胎肾脏的整体形态和模式，但不足以跟踪单个细胞^10。最近，一种新型的固定Z-方向（FiZD）方法，旨在高分辨率共聚焦3D延时成像的肾器官和器官培养物^{被描述11。}在这种方法中，在玻璃盖玻片和可渗透膜之间轻轻压缩器官和胚胎器官，在定制设计的板材中，直到样品厚度达到70μm，为成像提供最佳的光学条件。在方法的第二部分，描述了定制设计的板材的制造以及长期器官成像FiZD实验的设置的详细协议。

研究方案

动物护理和程序符合芬兰关于使用实验室动物的国家立法、《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约》（ETS 123）和欧盟第86/609/EEC号指令。

1. 在鸡CAM上培养小鼠胚胎肾脏和肾器官的小型储液罐，建立异种移植实验

1. 使用为 6 口或 12 孔板设计的跨孔细胞培养刀片。
   注:根据特定的实验，可以使用大型或小型小型储层。最好使用小型小型储液罐进行异种移植，最多移植8个胚胎肾脏，或者当几个小型培养液被放置在同一鸡胚胎上时（例如，在同一鸡CAM上进行实验和控制样品）。
2. 使用带圆形锯片或手锯的旋转多工具切割刀片的两侧，以创建一个 2 mm 高的塑料环，并连接一个渗透膜。
3. 用手术刀或锋利的刀抛光这些小型储液罐的边缘。
4. 将小型储液罐消毒为70%乙醇，至少1小时。
5. 用自风化的双蒸馏水清洗小型水库，让它们在层压罩中干燥。
6. 用PBS和培养介质冲洗小型储液罐（高葡萄糖DMEM/10%FBS/1%青霉素-链霉素）。
7. 将储液罐放在培养介质的跌落（600 μL/400 μL）顶部，膜朝上。
8. 在移液器或玻璃毛细管的帮助下，将解剖的外活体胚胎肾脏或肾器官均匀地排列在膜上。避免在肾脏周围留下大量的液体。
9. 让样品在37°C和5%CO2的细胞培养培养箱中附着在膜上2~24₂小时。
   注:在小刀片上可安排多达8个E11.5胚胎小鼠肾脏或肾器官。如果更大的胚胎组织片用于异种移植，或者用于CAM较大区域的细胞水凝胶混合物，则建议使用大刀片。
10. 以8天大的前奥沃培养胚胎鸡，按照先前公布的方法从细胞培养培养培养箱^{中拿出12、13,13}只。
11. 将小型储液罐转移到 CAM，以便移植物面向 CAM，膜覆盖它们。将小型储液罐放在 CAM 的外围，使其不覆盖鸡胚胎。
    注:当使用由转井插入器制成的 12 个孔板的小型小型储层时，一个 CAM 上最多可放置三个小型储液罐。
12. 将 500 μL（6 口井插入）或 300 μL（12 井插入）添加到小型储层中。
13. 在鸡CAM上培养样品，最多9天。每天更换小型储层中的培养介质。
    注:移植后可尽快观察样品的血管化24~48小时。

2. 制造定制设计的板材和设置 FiZD 培养物

1. 在 6 个井板底部钻 20 mm 直径的孔。
   注:对于FiZD实验，使用6个井板，井深为16毫米（在材料表中指定）。
2. 使用带反水槽钻头、手术刀或锋利刀的电钻对孔的边缘（尤其是上侧）进行抛光。
3. 将板材消毒70%乙醇至少1小时。
4. 用自风化的双蒸馏水清洗板，使其在无菌条件下干燥。
5. 彻底清洗22毫米x22毫米玻璃盖玻片与70%乙醇或清洁他们根据公布的协议由Saarela等人^11。
6. 使用无毒组织胶水将盖玻片粘附到6个井板的孔的上侧。在孔周围涂上胶水，轻轻放置盖玻片盖住孔。让胶水干。
7. 在立体显微镜下检查板，如果需要，从盖玻片表面去除多余的干胶。
   注:检查盖玻片上方没有胶水，以确保样品均匀压缩。
8. 将聚苯乙烯珠（70 μm 颗粒大小）与同等量的水凝胶混合。每口井的体积为50~100μL就足够了。
   注:将水凝胶和聚苯乙烯珠的混合物放在冰上。
9. 将转井插入物放在解剖显微镜下，将膜向上放置。
10. 将样品（例如，前活体胚胎肾脏或肾器官）均匀地排列在膜上。
11. 小心地将水凝胶/聚苯乙烯珠混合物添加到样品旁边，以避免损坏脆弱的组织。
12. 翻转转井插入件，使装有样品的膜朝下。
13. 轻轻地将插入物放入经过修改的 6 孔板的孔中，轻轻向下压压，以便将样品压缩到珠子的水平。
    注:使用显微镜跟踪压缩过程。
14. 用一只手将刀片稍微压到井上，并在刀片外围的三点用焊接熨斗熔化塑料，将其固定在板上。
15. 当刀片固定在板上时，将2 mL的培养介质（DMEM/10% FBS/1%青霉素链霉素）添加到孔中，并继续以同样的方式组装板中剩余的孔。
16. 将成品板转移到倒置显微镜的舞台培养箱，进行延时成像。
17. 使用适当的实验设置对样品进行延时成像。
    注:在延时实验期间，不需要更换板孔中的培养介质，但可以通过刀片两侧的孔轻松完成。

结果

此处介绍的CAM培养协议使肾器官和胚胎肾脏的高效血管化，由于鸡CAM的异种移植（图1，电影1）。含有培养基的小型储层向供体组织提供营养，并在适当血管化前的一段时间内保护其不干燥。该方法为供体源性内皮细胞的生长提供了宽松的条件。因此，移植肾脏和器官中的肾血管主要由供体特定细胞（图2B、C、F）代表。"C

讨论

提出了两个详细的方案，完善了经典的肾器官培养方法，使血管化、扩展发育和最佳4D（即3D图像和时间）成像为活体胚胎肾脏和器官。本节重点介绍这些方法的关键步骤，并讨论故障排除。

其他CAM培养方法与这种改良的鸡CAM培养方法之间的显著差异是，在胚胎肾脏和肾器官异种移植中，使用定制的小型储液器。改性转井插入物的膜底将样品压入鸡 CAM 并保持其原位。刀片的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610