原子力显微镜在早期骨关节炎检测中的应用

摘要

我们提出了一种使用原子力显微镜（AFM）研究关节软骨细胞水平上早期骨关节炎变化的方法。

摘要

细胞和组织的生物力学特性不仅调节其形状和功能，而且对保持其活力也至关重要。弹性的变化可以传播或触发癌症或骨关节炎（OA）等主要疾病的发病。原子力显微镜（AFM）已成为一种强大的工具，用于在微观尺度上定性和定量地描述特定生物目标结构的生物力学特性，测量从小到小到微牛顿的力。生物力学特性在肌肉骨骼组织中特别重要，肌肉骨骼组织受到高水平的应变。OA作为软骨的退行性疾病，导致细胞外基质（PCM）的中断和细胞外基质（ECM）中嵌的软骨细胞的空间重新排列。PCM 和 ECM 的中断与软骨生物力学特性的变化有关。在本研究中，我们使用 AFM 来量化这些与软骨细胞特定空间模式变化相关的变化。每次模式变化时，PCM 和 ECM 的弹性都会显著变化。因此，测量局部弹性可以直接得出OA中局部组织退化程度的结论。

引言

关节软骨是一种血管性神经性组织。稀疏分散的软骨细胞产生、组织和维护一个膨胀的细胞外基质（ECM），它们嵌入其中。作为 ECM 的一个独特和专门部分，软体细胞被称为近细胞基质 （PCM） 的一层薄薄的专用基质所包围。PCM充当一个对化学敏细胞-基质接口^1，保护软糖²并调节其生物合成反应^3。如前所述^4，在健康的软骨中，软骨细胞排列在特定的，独特的空间模式，是特定于每个组织层和关节^4,4，5，并依赖于关节特定的机械加载机制^6。这些模式从健康软骨中的对和字符串变为骨关节炎 （OA） 发病的双字符串。随着疾病的进一步进展，软骨细胞形成小簇，在高级OA中逐渐增加到大簇。在OA末期观察到完全丧失任何组织结构和诱导凋亡。因此，软骨细胞排列可用作OA进展⁴的基于图像的生物标志物。

细胞和组织的生物力学特性不仅调节其形状和功能，而且对保持其活力也至关重要。弹性的变化可以传播或触发癌症或OA等主要疾病的发病。原子力显微镜（AFM）已成为一种强大的工具，用于在微观尺度上定性和定量地描述特定生物目标结构的生物力学特性，测量从皮科牛顿到微牛顿的各种力。AFM的主要应用是测量样品的表面地形和在亚纳米分辨率⁷下的变化。测量装置由三个主要组件组成:1） AFM 探头，这是安装在悬臂上的尖尖，用于与样品表面的直接交互。当力施加到悬臂上时，后者根据测量的组织特性发生变形。2） 将激光束投射到悬臂上的光学系统，然后反射到探测器单元。3） 光电二极管探测器，可捕获从悬臂偏转的光。它将收到的有关悬臂激光偏转的信息转换为可分析的力曲线。

因此，AFM的主要原理是检测AFM探头与样品目标结构之间的力。所得力曲线描述了样品表面目标结构的力学特性，如弹性、电荷分布、磁化、屈服应力和弹性塑性变形动力学^8。与其他成像技术AFM的一个重要优点是，AFM可用于测量处于原生状态的中等或组织中活细胞的机械特性，而不会损坏组织。AFM 可在液体或干燥条件下工作。样品制备没有要求。AFM 提供了在接近生理条件的标本中同时成像标本并测量其机械特性的可能性。在本研究中，我们描述了一种通过测量原生关节软骨中 PCM 和 ECM 的弹性来评估 OA 进展的新方法。软骨细胞的空间组织与局部组织退化程度的相关性为早期发现OA提供了一个全新的视角。然而，迄今尚未评估这些模式的功能相关性。由于关节软骨的主要功能是低摩擦时承重，组织必须具有弹性特性。AFM 不仅允许测量 ECM 的弹性，还允许测量嵌入到 PCM 中的空间细胞模式。观察到的弹性与软骨细胞空间模式变化的相关性非常强，仅靠测量弹性就可能允许局部组织退化的分层。

使用集成在倒置相对比显微镜中的 AFM 系统，对 PCM 和 ECM 的弹性面进行了 35 μm 薄部分的评估，该显微镜可同时可视化软骨样品。该协议基于我们的实验室⁹已经发表的一项研究，并具体描述了如何描述软骨细胞的空间排列，以及如何测量其相关的PCM和ECM的弹性。随着软骨的每次模式变化，PCM和ECM的弹性也会发生重大变化，从而允许该技术直接测量软骨退化的阶段。

这种经过验证的方法为在宏观组织退化真正开始出现之前的早期阶段评估OA进展和治疗效果开辟了一条新途径。持续执行 AFM 测量是一个艰巨的过程。在以下协议中，我们将介绍如何准备由 AFM 测量的样品，如何从准备悬臂开始执行实际的 AFM 测量，如何校准 AFM，以及如何执行测量。分步说明提供了一种清晰、简洁的方法，以获得可靠的数据，并提供处理和解释数据的基本策略。讨论部分还介绍了此严格方法的最常见缺陷，并提供了有用的故障排除提示。

研究方案

从德国图宾根大学医院骨科外科和德国罗滕堡永霍夫医院接受膝关节整形矫形手术的患者那里获得人类软骨样本，用于膝盖的末期OA。在研究开始之前（项目编号674/2016BO2），获得了部门、机构和地方道德委员会的全面批准。在参与之前，所有患者都收到了书面的知情同意。这些方法是按照核准的准则执行的。

1. 样品制备

1. 准备软骨进行冷冻切除
   1. 为了评估膝关节的退行性变化，从患者组织切除后从股骨结块的承重区采集关节软骨样本。
      注:被调查的样本仍应至少包含一层薄薄的下骨，以便明确识别与内表面和外表面有关的组织方向，从而也允许最上部软骨层的标准化组织收获。软骨可用于AFM测量，直到手术后24小时。该组织可在使用前以2%（v/v）青霉素-链霉素和1.2%（v/v）安高霉素B的无血清杜尔贝科改良鹰的介质（DMEM）储存。但是，将样品储存在 24 小时以上可能会导致 AFM 测量中的伪影，导致组织肿胀。
   2. 在手术刀的帮助下，从下骨上切出整个关节软骨，然后将软骨样本嵌入到低温旋钮上的水溶性嵌入介质中，在低温下冻结在低温装置中。
      注:冷冻介质稳定其包裹的组织。它还导致软骨样品与嵌入介质一起冻结。从骨骼切割软骨时，跟踪组织的方向。为低温截面嵌入的组织必须以使软骨的顶层（即关节表面）面向刀片的方式放置。请注意，组织必须完全覆盖嵌入介质。
2. 软骨的冷冻切片
   1. 使用标准低温，从嵌入在冷冻水溶性嵌入介质中的关节软骨的最顶层（即关节表面）以35μm的厚度分割组织。
      注:总共，最多 300 μm（相当于大约 9 个部分）可以分割并用于分析。建议的 300 μm 极限对应于通常可以通过透明软骨（如关节软骨）中的荧光显微镜获得的视觉渗透深度。因此，可以根据主要的局部空间模式对软骨进行排序，然后在相应的部分中测量这些图案。
   2. 收集玻璃滑轨上的部分，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗 3 倍部分，以去除水溶性嵌入介质。
3. 将软骨部分胶着到 AFM 兼容的培养皿上
   注:由于 AFM 通过对样品的机械缩进收集数据，因此需要固定这些部分以进行精确测量。
   1. 用生物相容性样品胶水将 35 μm 厚的部分轻轻粘附到与 AFM 器件兼容的组织培养皿上。为此，服用2~3滴胶水，放在组织培养盘上，在部分边缘结束的地方。现在把软骨部分放在胶水上，让它牢牢地粘在组织培养皿的表面。
      注:35 μm厚的透明线关节软骨部分不太容易卷曲。但是，如果从缓冲介质中取出样品时发生卷曲，请确保尽可能少的液体粘附在样品上。一旦多余的水干涸，直接将组织扩散到分散的胶水点上，使其固定在细胞培养皿的表面。胶水仅在样品边缘而不是整个部分的薄层中应用。仅测量远离粘附区域的样品的该部分，以消除胶水干扰测量的可能性。
   2. 在室温 （RT） 下孵育部分 2 分钟，使胶水和组织正确粘合。然后用莱博维茨的L-15介质覆盖部分，不含L-谷氨酰胺，没有碳酸氢钠，因此它们完全被淹没。
      注:样品在固定过程中突然移动或胶水应用不足是常见的错误，导致组织脱离培养皿。此外，应用 Leibowitz 介质应以温和的方式进行，以免由于介质产生的"波"而将样品从表面分离。
   3. 将带有粘附部分的培养皿放在标准细胞培养培养箱 37°C 处，直到进行测量。
      注:确保组织部分稳定，并且不会通过缓慢执行每个步骤从组织培养盘的表面分离。

2. 悬臂制备（胶化微球）

1. 制备AFM装置和稀释微球
   1. 将悬臂放在指定用于空气测量的玻璃块上，用弹簧固定，并将玻璃块安装在 AFM 头上。
   2. 在100%乙醇（100颗粒/10μL）中稀释微球，超声波处理10s，使微球分离，不聚集在一起。
2. 准备胶体设置
   1. 用 70% 乙醇清洁玻璃幻灯片，并将其安装在 AFM 设备上的样品支架上。
      注: 清洁幻灯片可防止可能干扰胶着过程的灰尘斑点积聚在幻灯片表面。
   2. 将微球悬浮液的 2 μL 放在滑轨中间，在微球悬浮液附近放置 2 μL 胶水。
      注:建议将微球悬浮液和胶水彼此靠近，以便在胶水和微球之间快速过渡悬臂。如果将悬臂浸入胶水和与微球接触之间的过渡时间过长，胶水最终将变硬，从而失去其粘合性能。
   3. 让微球中的乙醇液体悬浮空气干燥，使微球就位。
3. 在悬臂尖端上倾斜微球
   1. 在步进电机的帮助下，在 10 μm 步长下，将悬臂手动浸入胶水中，直到尖端被胶水覆盖。当胶水干燥得很快时，快速执行此步骤。
   2. 再次将悬臂缩回 100 μm，将其朝微球方向移动，并将悬臂尖端直接放置在单个微球上方。
   3. 运行力光谱测量，使用表 1所示的参数将悬臂尖端浸入选定的微球上。
      注:通过执行此步骤，用于测量微球表面，以建立悬臂尖端和微球之间的接触。表 1所示的接触时间相对长，因此在胶水和微球之间留出了充足的粘接时间。此步骤期间获得的力距离曲线作为胶合悬臂尖端微球的副产品生成，不经过处理以进行进一步分析。
   4. 将微球连接到悬臂上后，将顶部安装悬臂的玻璃块缩回，然后从显微镜上取下 AFM 头。最后，从 AFM 头上卸下玻璃块和悬臂。
   5. 在65°C下孵育悬臂2小时，在RT干燥过夜，然后开始测量。
      注:悬臂的孵化增强了胶水的粘合性能，使悬臂-微球复合体更加稳定。

3. 准备 AFM 设备进行测量

1. 调整为在 AFM 支架上的液体环境中测量而指定的玻璃块，使上表面与 AFM 支架平行。
2. 在钳子的帮助下，小心地将选定的悬臂安装在玻璃块表面，使带有微球的 AFM 尖端在抛光光学平面上突出。
   注:悬臂的尖端需要突出在抛光平面上，以便能够将AFM的激光反射到光探测器上。将悬臂放在 AFM 上时要非常小心，以免刮伤玻璃块抛光的光学表面。划伤玻璃块可能会导致难以调整激光对准，并可能干扰后续测量。
3. 由于悬臂将受到机械压力，因此需要固定到位。通过将金属弹簧滑入块槽，并在钳子的帮助下用弹簧夹紧悬臂顶部，稳定玻璃块上的悬臂。
4. 小心地将带悬臂的玻璃块放在 AFM 头上，并固定其集成锁定机构。确保弹簧朝向左侧，以便悬臂置于正确的方向。然后用悬臂将 AFM 头安装在 AFM 设备上。

4. 装载样品并校准悬臂

注:在这里，通过运行在充满Leibovitz介质的培养皿的清洁表面上的力曲线，没有任何样品组织，对器件进行校准。校准也可以通过使用单独的控制 AFM 盘填充，无需样品即可进行。

1. 将样品安装在 AFM 设备上
   1. 将步骤 1.3.3 中准备的培养皿放在 AFM 样品支架上。
   2. 打开 Petri 盘加热器并将其设置为 37°C。让组织培养盘达到最佳温度（即20分钟）。
   3. 在悬臂组件底座上放置保护箔，以避免 AFM 头中介质冷凝。
2. 设备的校准
   1. 打开软件（材料表），然后是激光对齐窗口，窗口描述接近参数设置。然后打开步进电机、激光和CCD相机。
   2. 使用显微镜上的 CCD 摄像机可视化和识别悬臂。使用步进电机功能，将悬臂降低 100 μm 步长，直到悬臂完全浸入介质中。
      注:悬臂在液体中的下潜可通过CCD相机目视识别。当它打破水面时，悬臂尖端在水中产生容易明显的圆形反射。
   3. 使用调节螺钉将激光定向到悬臂顶部。
      注:请勿过风螺钉，因为这将损坏激光校准机构。悬臂从下面观看，激光束来自上方。
   4. 激光定位在悬臂上后，借助 AFM 设备中的螺钉调整激光束，使反射光束落在光电探测器的中心。使用激光对准功能持续监控激光束的位置。
      注:探测器拾取悬臂反射的激光束的偏转，并将其转换为电信号。
   5. 激光悬臂调整后，Sum信号必须为 1 V 或以上，而横向和垂直偏转必须接近 0。如果未获得这些值，请调整光探测器。
3. 获取校准力曲线
   1. 为了到达 AFM 盘的表面以开始测量，使用表 2中给出的方法参数运行扫描仪方法。一旦达到组织培养盘的底部，将悬臂缩回100μm。
      注:此时，探头离组织培养皿底部仅高出 100 μm。
   2. 设置RUN参数并调整表 3中显示的参数。单击"运行"按钮以开始测量并获取校准力距离曲线。
      注: 此处获得的力曲线如图1所示。
   3. 在校准力距离曲线上，选择软件中缩回曲线的线性拟合区域。
      注: 线性拟合用于测量悬臂的灵敏度。线性拟合到位后，软件将保存这些值。悬臂的弹簧常数测量或热噪声由软件随后计算。
   4. 当测量在37°C的温度下以介质进行时，在软件中将温度变量设置为37°C，以尽可能密切地模拟生理条件。
      注:在校准结束时，垂直偏转将保存并显示在力单位牛顿 （N） 中，而不是电压 （V），这是光电二极管探测器原始注册的单位。

5. 通过 AFM 进行弹性测量，对 ECM 和 PCM 的生物力学特性

1. 识别软骨部分的软骨部分的软骨模式
   1. 观察在AFM系统集成的相位对比显微镜下软骨部分，并识别骨关节炎膝关节软骨¹⁰的特定细胞模式:单弦（健康组织区域）、双弦（开始组织退化）、小组和大簇（均为高级组织退化）。参见图 2A_D。
   2. 确定特定所需模式后，根据每个矩阵类型（PCM 或 ECM）测量每个所选模式的两个站点，并在每个测量站点上执行九次测量重复（图 2E，F）。确保样本大小足够大，以考虑可能的不准确之处。
      注:对于 PCM 测量，将悬臂放置在靠近细胞的位置（如图2E、F中的红色圆圈所示）。为了对 ECM 进行测量，请选择一个没有任何单元的区域（如图2E、F中的蓝色区域所示），并执行步骤 5.2 中所述的缩进。
2. 目标站点的缩进
   1. 执行一种方法，然后进行回缩，使悬臂位于组织上方 100 μm 上，这将是后续测量的起始位置。
   2. 关注要测量的图案的 PCM 或 ECM，并在该点修复计算机鼠标。
      注: 鼠标将作为缩进目标站点的视觉标记。一旦焦点转移到悬臂尖端，组织结构将变得无法区分或模糊。
   3. 现在，将注意力放在探头上，并将探头的尖端移动到以前由计算机箭头修复的点。接下来，使用RUN启动测量，使用悬臂校准获得的设定点参数。
      注: 从测量单个字符串的 PCM 中获得的模范力曲线显示在补充图 1中。

6. 数据处理

注:弹性模数的数据分析或测定使用赫兹模型执行，如前面所述^{的11，12。,12}由于尖尖上使用微球，Indenter的形状是球形的，根据以前的文献^{13、14、15，,15}泊森的比例保持在0.5。^13,

1. 打开与从 AFM 设备获得的数据兼容的数据处理软件 （材料表）。
2. 在软件中选择赫兹模型，用于处理力距离曲线。将泊森比设置为 0.5，并将尖端形状设置为球形和尖端半径 12.5 μm。
3. 调整所有参数后，将安装结果，并且由软件计算并显示 Young 的模量。

结果

沿着物理病理学模型从字符串到双字符串，到小，最后到大聚类，ECM （图3A） 和 PCM （图 3B） 弹性多利之间每个模式变化显著减少.唯一的例外是字符串和双字符串之间的 ECM 差异（p = 0.072）。结果表明，ECM/PCM比（图4B）没有显著变化，而ECM和PCM之间弹性的绝对差异明显下降（图4B）。此外，结果没有显示与E...

讨论

利用AFM作为一种新颖而强大的技术，在纳米级水平上测量生物材料的生物力学特性，测量了ECM和PCM在人类骨关节炎关节软骨中的弹性特性。软骨样本是根据其主要空间模式选择软骨细胞组织作为图像为基础的生物标志物，用于局部组织退化。正如预期的那样，在空间软骨重组中观察到ECM和PCM的弹性值急剧下降。这些观测结果清楚地突出表明，软骨细胞空间排列的偏差不仅与细胞微环境（PCM）的弹?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck	A2942
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
Biocompatible sample glue	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	H000033
Cantilever	tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
Microspheres	Polysciences	07313-5
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather	2023-01
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012