MeCP2蛋白质变异的电化学发光测定

摘要

电化学发光免疫测定（ECLIA）是一种定量检测内源和外源应用的MeCP2蛋白变异的新方法，在广泛的工作范围内产生高定量、准确和可重复的测量，检测内误差低。此处介绍了 MeCP2-ECLIA 的 96 井格式的协议。

摘要

ECLIA 是一种多功能方法，能够以 96 孔格式量化内源和重组蛋白量。为了证明ECLIA的效率，该测定用于分析小鼠脑组织中MeCP2的内在水平和TAT-MeCP2在人类皮肤纤维细胞中的接受。MeCP2-ECLIA 可生成高精度和可重复的测量，具有较低的内部和内部测定误差。总之，我们开发了一种定量方法，用于评估MeCP2蛋白变异，可用于高通量屏幕。

引言

电化学发光免疫测定（ECLIA）基于一个过程，该工艺利用标签，设计在电化学刺激时发出发光。它是一种广泛适用的生物分析物定量检测技术，用于基础工业和学术研究、食品工业以及临床诊断^1。通常，使用带有碳墨水电极的一次性 96 孔板。这些电极充当免疫测定的固相载体。二次抗体与电化学发光标签结合，当电应用于系统时，触发化学标签的光发射。超低噪声电荷耦合装置（CCD）记录光强度与与捕获抗体结合的抗原成正比，从而对样品²的目标解解物进行定量。与酶相关的免疫吸附剂测定（ELISA）相比，ECLIA被认为是有利的，因为它提供了更高的灵敏度和可重复性，以及更好的自动化和一致性^3。

在这里，我们分析了人类和鼠源样品中的甲基-CpG结合蛋白2（MeCP2）水平，以及使用新开发的ECLIA系统对重组蛋白的不同变异。MecP2是一种与X相关的核酸结合蛋白，已知与甲基化DNA序列相互作用。这种蛋白质已经牵连到基因表达的调节^44，5。5编码这种蛋白质的基因功能丧失突变是导致Rett综合征（RTT）的罪魁祸首，一种严重的神经发育障碍^6。另一种MeCP2相关疾病，MECP2重复综合征，也导致神经症状，可以重叠的RTT^7。值得注意的是，女性大多受RTT影响，而男性则大多受MECP2重复综合征^66、77的影响。

这些疾病分别与中枢神经系统（CNS）中MeCP2水平不足或过量有关。因此，RTT的治疗方案，涉及增加MECP2水平在CNS将需要避免与过量的MeCP2⁷相关的有害影响。由于这一事实，ECLIA系统对MeCP2蛋白水平进行高度敏感和准确的定量，对于推进RTT以及MECP2重复综合征研究至关重要。从人体细胞系和小鼠组织样本中精确测量内源性和外源性MeCP2水平，以及由人类MeCP2等型B（也称为异体e1）组成的重组蛋白，以及具有跨越血脑屏障^88、99的最小N-终端HIV-TAT转导域（TAT-MeCP2）。

研究方案

澳大利亚韦斯特米德儿童医院人体研究伦理委员会批准了为研究目的进行皮肤活检采购。动物实验的同意得到了奥地利联邦科学、研究和经济部的同意，这些实验是根据当地动物福利条例（GZ:66.009/0218-II/3b/2015）进行的。

注:图1中描述了ECLIA系统的原理。

1. 抗体选择

1. 评估各种 MeCP2 抗体的信号噪声比，并在主小鼠单克隆 MeCP2 抗体（克隆 Mec-168）和兔子多克隆 MeCP2 检测抗体（定制）的组合中确定最佳信号强度和最高特异性。对于二次抗体，使用系统特异性抗体（材料表），该抗体也经过实验验证。
   注:表1概述了MeCP2-ECLIA开发期间所有经过验证的抗体及其经过测试的稀释范围。

功能	名字	克隆	稀释
主要	鼠标，防MeCP2	梅克-168	1:500~1:10，000
主要	鼠标，防MeCP2	4B6	1:250~1:4，000
主要	鼠标，防MeCP2	男士-8	1:500~1:4，000
主要	鼠标，防MeCP2	1B11	1:500~1:4，000
主要	兔子，抗MeCP2	D4F3	1:500~1:4，000
二 次	兔子，抗MeCP2	多克隆	1:2，000~1:20，000
二 次	兔子，抗MeCP2	多克隆	1:2，000~1:20，000
检测	SULFO-TAG 标签防兔	多克隆	1:500~1:1，000

表1:抗体和已用工作稀释物清单。

2. 或者，使用每对与传统的 ELISA 配合良好的 MeCP2 抗体。

2. 使用 TAT-MeCP2 融合蛋白处理 HDF

注:TAT-MeCP2 在大肠杆菌中经过重组表达，并使用标准色谱技术进行纯化，如前所述^{的 8，}并储存在-80°C。

1. 板 1 x 10⁶人皮纤维细胞 （HDF） 细胞在 100 mm 的菜肴中，在 37 °C 下以 5% CO₂在 37°C 下一夜之间生长细胞，直到达到约 90% 的汇合。
2. 拿出一小瓶TAT-MeCP2融合蛋白。在冰上解冻，轻轻混合。
3. 在 50 mL HDF 培养介质中，将 TAT-MeCP2 稀释至最终浓度为 500 nM。
4. 从 100 mm 的培养皿中取出介质，在 37 °C 下用 500 nM TAT-MeCP2 孵育细胞，使各种孵育期长达 24 小时。
5. 从单元中删除 TAT-MeCP2 解决方案。用预加热的Dulbecco磷酸缓冲盐水（DPBS）对细胞进行2倍清洗。
6. 在37°C¹⁰下，用2 mL0.05%的胰蛋白酶-EDTA溶液处理细胞5分钟。
7. 加入6 mL的HDF培养介质来停用胰蛋白酶，并将细胞收集到15 mL管中。
8. 在室温下，在500 x g处离心5分钟，将细胞中离心。
9. 取出上清液，用冰冷的DPBS洗涤2倍的细胞。将颗粒储存在冰上，然后进行样品制备。

3. 样品制备

1. HDF 裂度
   1. 根据铃木等人¹¹号，使用REAP方法将亚细胞分馏到细胞质和核亚细胞隔间中，确定MeCP2的最高蛋白质水平。每次实验的分馏限制为不超过六个样本。
2. 小鼠脑力灰分
   1. 准备100 mL的每个低毒液集液试剂和提取缓冲液。
      1. 对于低毒液赖塞试剂，混合10 mM HEPES、1.5m氯化镁和10 mM氯化钾。
      2. 对于萃取缓冲液，混合 20 mM HEPES、1.5 mM 氯化镁、0.42 M 氯化钠、0.2 mM EDTA 和 25% （v/v） 甘油。
      3. 将两个缓冲器的 pH 调整为 7.9。
      4. 新鲜加入1 mM二硫醇（DTT）和1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒。使用前在冰上冷却。
   2. 悬浮100毫克的总小鼠脑（应变:C57BL/6J，野生型男性和女性和B6.129P2（C）-Mecp2tm1.1Bird/J，血西古雄性和异血酶雌性;年龄:4-8周大）在1 mL的冰冷低毒丝病试剂。^tm1.1Bird
   3. 通过预冷却的 Dounce 全玻璃组织均质器，分别通过 15 冲程（松散、大间隙）和 B（紧密、小间隙）使大脑均质化。
   4. 将均质细胞转移到清洁管和离心机在10，000 x g在4°C下20分钟。丢弃上清液（或将其保留为细胞原分，供进一步使用）。
   5. 每100毫克起始材料重新悬浮140μL的萃取缓冲液。将管置于预冷却的热块中，在 4 °C 下轻轻混合 30 分钟。
   6. 在 4 °C 下将管在 16，000 g 下离心 10 分钟。将上清液（即核馏分）转移到新的预冷却管，并储存在-80°C，直到使用。
      注:从小鼠大脑和HDF中提取的裂干的蛋白质浓度可以通过BCA蛋白测定来评估。

4. MeCP2-ECLIA协议

1. 洗涤溶液、阻塞缓冲液和测定稀释液的准备（第1天）
   1. 加入 500 μL 的 Tween 20 至 1 L 的 PBS，在 PBS 溶液中制备 0.05% Tween 20，大力混合，并标为"洗涤液"。
      注:确保只使用新鲜准备的洗涤缓冲液。
   2. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 3% 阻滞剂 A （材料表） 的阻滞溶液。通过温和搅拌混合，过滤消毒，并将其保存在冰箱中，直到使用最多两周。
   3. 将 5 mL 的阻塞溶液添加到 10 mL 的 PBS 中，以准备测定稀释溶液（PBS 中的 1% 阻滞器 A）。
2. 高结合板涂层
   1. 拿出96孔多阵列单点高粘结板。
      注:高结合板具有更大的结合能力，因此比具有疏水表面的标准板具有更大的动态范围。
   2. 在冰上解冻单克隆小鼠抗MeCP2抗体，将抗体的0.67μL与4 mLPBS混合（PBS中1:6，000抗体稀释）。涡旋抗体溶液混合良好，并将管标为"涂层溶液"。
   3. 使用多通道移液器在每个井底角小心分配25μL的涂层溶液;这称为溶液涂层方法。轻轻敲击每侧 96 孔板，确保涂层溶液覆盖每个井的底部。
   4. 用粘合箔密封板，并在冰箱中孵育板，温度为 4°C 过夜（12~16 小时）。
3. 阻塞（第 2 天）
   1. 从冰箱中取出盘子，取出铝箔。
   2. 将其轻拂到废篮中，然后轻触纸巾上的板，从井中取出所有涂层溶液，从而去除抗体涂层溶液。
   3. 每口井加125μL的阻塞溶液。再次密封板并将其放在轨道微板摇床上。
   4. 在室温下孵育板 90 分钟，在 800 rpm 时不断晃动。
4. 标准和样品的准备
   1. 在孵育期间，准备MeCP2和/或TAT-MeCP2蛋白质标准及各种样品。
      注:用于标准稀释的Lysis缓冲液必须与分析样品中使用的液位缓冲液相同。
   2. 从-80°C拿出一小瓶MePC2和/或TAT-MeCP2蛋白质库存溶液（250微克/米L），小鼠脑裂解液和HDF裂解剂。在冰上解冻。
   3. 根据表2，在清洁管中稀释标准库存溶液（MeCP2 和/或 TAT-MeCP2）。
   4. 稀释裂灰缓冲液中的样品，如下所示:每25μL裂灰缓冲液1~20μg，每25μL裂灰液液液0.25±1μg。准备足够的体积的每个样品进行三联分析。

标准	浓度	稀释
标准 1	1，800 纳克/mL	1.08 μL 标准库存溶液 = 148.92 μL Lysis 缓冲液
标准 2	600 纳克/mL	50 μL 标准 1 + 100 μL Lysis 缓冲液
标准 3	200 纳克/mL	50 μL 标准 2 + 100 μL Lysis 缓冲液
标准 4	66.67 纳克/mL	50 μL 标准 3 + 100 μL Lysis 缓冲液
标准 5	22.22 纳克/mL	50 μL 标准 4 + 100 μL Lysis 缓冲液
标准 6	7.41 纳克/mL	50 μL 标准 5 + 100 μL Lysis 缓冲液
标准 7	2.47 纳克/mL	50 μL 标准 6 + 100 μL Lysis 缓冲液
标准 8	0.82纳克/米拉	50 μL 标准 7 + 100 μL Lysis 缓冲液
标准 9	0.27纳克/米拉	50 μL 标准 8 + 100 μL Lysis 缓冲液
标准 10	0 纳克/mL	150 μL Lysis 缓冲液

表 2:标准系列从 0 到 1，800 纳克/mL。

5. 添加示例和标准解决方案
   1. 将其轻拂到废篮中，然后轻触纸巾上的板，从井中取出所有阻塞溶液，从而拆下挡块溶液。
   2. 通过添加洗涤液并立即将其去除，使用 150 μL 洗涤液清洗板 3x。
   3. 使用单个通道移液器将 25 ul 标准和样品添加到井底角。
   4. 密封板，在室温下孵育板 4 小时，并在 800 rpm 时持续摇动。
6. 未标记检测抗体
   1. 解冻冰上多克隆兔抗MeCP2抗体。在测定稀释液中稀释抗体1:6，000。
   2. 将其轻拂到废篮中，然后轻触纸巾上的盘子，从而拆下标准和样品。
   3. 通过添加洗涤液并立即将其去除，使用 150 μL 洗涤液清洗板 3x。
   4. 使用多通道移液器将 25 μL 未标记的检测抗体添加到每个井中。密封板，在室温下以 800 rpm 的恒定摇动，将其孵育 1 小时。
7. 特定的偶联抗体
   1. 从冰箱中拿出特定的二次抗体（材料表），放在冰上。稀释抗体1:666.67测定稀释液，轻轻混合。
   2. 将无标签的二次抗体轻拂到废篮中，然后用纸巾敲击板，取出无标签的二次抗体。
   3. 通过添加洗涤液并立即将其去除，使用 150 μL 洗涤液清洗板 3x。
   4. 使用多通道移液器将25μL的特定偶联抗体（材料表）添加到每个孔中。密封板，在室温下以 800 rpm 的恒定摇动，孵育 1 小时。
8. 读取板
   1. 将其轻拂到废篮中，然后用纸巾敲击盘子，取出自由共聚的抗体（材料表）。
   2. 用 150 μL 的洗涤液清洗板 3 倍。
   3. 加入150 μL的1x三聚三酯金读缓冲液（材料表），表面活性剂中含有三丙胺作为光生成的共同反应剂到板。使用反向移液技术避免任何气泡。
   4. 将板材放在微板检测平台（材料表）上，然后立即开始测量。使用 96 孔板采集的设置。
   5. 在电化学发光检测系统（材料表）中，内置CCD相机捕获电化学发光信号，并记录与相对光单位（RLU）相对相对的光单位（RLU）相对比例的信号计数。
      注:电化学刺激后，与碳电极结合的铀标签在620nm处发出发光光。使用仪器随附的软件（材料表）分析数据。

结果

图1描述了ECLIA系统的原理。图 2显示了两个 MeCP2 变体的标准曲线。在广泛的浓度（1~1，800纳克/mL）上可以精确定量。在图3中，分析了从小鼠大脑和HDF中提取的MeCP2水平裂灰。图3A对来自异质细胞、野生型和敲空小鼠的脑核结扎液中的MeCP2表达进行了对比，而图3B中，使用ECLIA的MECP2缺乏人...

讨论

为了测量内源性MeCP2、重组MeCP2和TAT-MeCP2水平，开发了96孔板ECLIA。已经表明，MeCP2蛋白功能的丧失导致RTT综合征^6，目前治疗仅限于症状管理和物理治疗。一个有前途的治疗途径是所谓的蛋白质替代疗法，其中MeCP2水平可以打分到他们所需的浓度12，13，14，15。^12,13,14,15过去二十年来，TA...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad Laboratories Inc.	500-0006	Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit	Meso Scale Diagnostics	R32AB-1	Antibody
Discovery workbench 4.0	Meso Scale Discovery		Software
DMEM (1X)	gibco by Life Technologies	41966-029	Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Sample preperation
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA protocol
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)	GFL	3014	MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)	Sigma-Aldrich	M2670	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	Cell treatment
Microseal B seal	Bio-Rad Laboratories Inc.	MSB1001	for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antibody, Coating solution
MSD Blocker A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	Blocker
MSD SECTOR Imager 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin	gibco by Life Technologies	15140122	Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit	Eurogentec S.A.	custom-designed	Antibody
Potassium chloride (KCl)	Merck KGaA	1049361000	Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)	Sigma-Aldrich	SAB1404063; RRID:AB_10737296	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)	Sigma-Aldrich	WH0004204M1; RRID:AB_1842411	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)	Sigma-Aldrich	M6818; RRID:AB_262075	Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)	Sigma-Aldrich	M7443; RRID:AB_477235	Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)	Cell Signaling Technology	3456S; RRID:AB_2143849	Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)	Sigma-Aldrich	8340	Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	custom	Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2	Merck	07-013	Antibody
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014	Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)	Meso Scale Diagnostics	W0015528S	Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein	in-house production		Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)	gibco by Life Technologies	25200-056	Cell treatment
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Washing solution