使用磁力学监测化学合成氧化铁纳米粒子的细胞合并和后续生物降解

摘要

氧化铁纳米粒子通过无味溶胶程序合成，并涂有离子短分子或聚合物。利用磁力计（VSM）来监测人类干细胞内磁纳米粒子的整合和生物转化。

摘要

由氧化铁制成的磁性纳米粒子对广泛的生物医学应用有着特殊的兴趣，它们经常被内化在细胞中，然后留在细胞内。一个挑战是用可靠和精确的方法评估他们在细胞内环境中的命运。在此，我们介绍了振动样品磁力计 （VSM） 的使用，通过测量其磁力矩精确量化细胞内磁性纳米粒子的完整性。干细胞首先被标记为两种类型的磁性纳米粒子:纳米粒子具有通过快速高效的微波无味溶胶合成产生的相同核心，其涂层也不同:常用柠檬酸分子与聚丙烯酸相比。然后通过离心实现3D细胞球体的形成，用VSM在不同时间测量这些球体的磁力矩。获得的时刻是纳米粒子完整性的直接指纹，其值下降表明纳米粒子退化。对于两个纳米粒子来说，磁性时刻会随着培养时间的减少而减少，揭示它们的生物降解。与柠檬酸相比，还显示了聚丙烯酸涂层的保护作用。

引言

人们越来越关注氧化铁纳米粒子的磁性特征，用于广泛的生物医学应用。他们对磁共振的反应使得它们成为磁共振成像（MRI）的可靠对比剂，这是再生医学的一个优势，在植入¹后，可以跟踪带有磁纳米粒子的细胞。利用磁场，也可以在远处引导细胞:这样，细胞球体^2，3，环^4，或表⁵可以进行磁力工程，也可以远程刺激^6，在无脚手架组织发展的资产。这些纳米粒子的可能性范围还包括药物输送系统^7，8和磁性和光诱导的高温治疗杀死癌细胞^{9，10，11。}对于所有这些应用，纳米粒子通过静脉注射或直接内化在细胞中集成在生物环境中，然后留在细胞内，这使人对其细胞内的命运产生疑问。

在体内分析传达了对纳米粒子在生物体中命运的一般理解:在血液中注射后，它们首先被肝脏（库普弗细胞）、脾脏和骨髓的巨噬细胞捕获，逐渐退化，并加入生物^{体12、13、14、15、16、17、18、19}的铁池。只有由于纳米粒子在整个生物体中的循环，才能进行定性观测。通常，传输电子显微镜 （TEM） 可用于直接观察纳米粒子，并且可以通过剂量确定器官中铁的存在。最近，他们的命运被直接评估在细胞池，这意味着在近距离电路没有铁逃逸，允许定量测量他们的生物转化在细胞水平20，21，22。通过分析与其结构完整性密切相关的纳米粒子的磁性，可以进行此类测量。振动样品磁力计 （VSM） 是一种定期振动样品的技术，因此所诱导的通量线圈测量提供了应用磁场样品的磁时刻。这种同步检测允许快速测量，这是确定大量样品^{20，21，22，23}的磁时刻的资产。然后，VSM检索到的宏观磁信号对与纳米粒子的大小和结构直接相关的整个生物样本进行了定量概述。特别是，它提供了样品饱和时的磁时刻（以 emu 表示），这是直接量化样品中存在的磁性纳米粒子的数量，分别到其特定的磁性。

结果表明，磁性纳米粒子的细胞内处理与其^{结构特征紧密}相连。这些功能可以通过最佳的合成协议进行控制。每个协议都具有优点和局限性。氧化铁纳米粒子通常通过共生铁离子²⁴在液态溶液中合成。为克服纳米粒子尺寸多分散性的局限性，已开发出聚醇介质溶胶法等其他合成方法²⁵种。通过热分解的无声方法导致生产非常校准的氧化铁纳米粒子^26。然而，使用大量的表面活性剂，如烯酰胺或油酸，使其功能化和生物医学应用的水转移复杂化。因此，我们通过一条无糖溶胶路线合成这种磁性纳米粒子，从而达到高晶度、纯度和可重复性^。该协议产生控制良好的大小纳米粒子，可以通过温度变化²⁸调整。然而，微波辅助的非水溶胶路由的纳米粒子的上限约为12纳米。此程序将不适用于在室温下使用铁氧颗粒的应用。除了核心合成，另一个主要功能要考虑的是涂层。涂层位于纳米粒子表面，充当锚定分子，帮助纳米粒子有针对性地内化，或者保护纳米粒子免受降解。由于苯乙醇同时作为氧气源和配体，光裸纳米粒子的产生无需额外的表面活性剂或配体。然后，纳米粒子在没有表面活性剂交换过程的情况下，在合成后很容易表面功能化。

其中，评估了两种纳米粒子，它们的核心相同，涂层也不同。该核心采用快速高效的微波技术合成。比较的两种涂层包括柠檬酸，这是生物医学应用中用作涂层剂最多的涂层之一^，29、30和聚丙烯酸 （PAA）， 聚合物涂层具有大量的溷合功能。然后，VSM磁力计测量首先用于量化细胞吸收的纳米粒子，然后作为干细胞内化后纳米粒子结构完整性的直接评估。结果表明，孵化浓度影响纳米粒子的吸收，涂层影响其降解，PAA的大量锚定分子保护核心免受降解。

研究方案

1. 磁纳米粒子的合成

1. 核心合成–微波辅助
   1. 溶解 400 毫克铁 （III） 乙酰乙酰酮 （+99.9%）在 10 mL 苯酒精 （BA， 99.8%）在30毫升单波玻璃瓶内。
   2. 在20分钟内将悬架的温度从25°C提高到250°C（以11.25°C/min的速度），并使用微波反应器将其保持在250°C30分钟。
   3. 将苯醇中悬浮的纳米粒子转移到玻璃瓶中，使用新磁铁分离纳米粒子30分钟。
   4. 用10毫升二氯甲烷、1 M氢氧化钠、乙醇、pH 7水（三次）清洗前100毫升玻璃瓶中的沉淀物，每步用新钛磁铁清洗5分钟，使纳米粒子颗粒化并去除超生剂。
   5. 使用 1M 盐酸将水中的纳米粒子悬架调整为 pH 2，然后在 100 kDa 超中分子过滤器中离心，在 2，200 x g 下使用 10 分钟。
   6. 取出滤液，在纳米粒子溶液中加入12 mL的^10-2M 盐酸，在100千达超中度滤液中离心机在2，200 x g 下10分钟（三次）。然后在涂层前将纳米粒子溶液稀释在 10 mL 内^10-2 M 盐酸。
2. 涂层
   1. 在 100 mL 玻璃瓶中以 pH2 在水中稀释 175 毫克柠檬酸和聚丙烯酸，并使用 1M 盐酸溶液将 pH 调整为 2。
   2. 将10 mL纳米粒子液分散到涂层分子溶液中，相当于涂层分子和纳米粒子之间的质量比为5。在室温下在磁性搅拌下搅拌2小时。
   3. 反应后，用1M氢氧化钠将pH调整为7。
   4. 将纳米粒子溶液与去离子化 （DI） 水混合 3 次，在 100 kDa 超中度滤清器中以 2，200 x g 的速度 喷水 10 分钟:在 12 mL 的 DI 水中去除过滤液并稀释纳米粒子溶液。

2. 干细胞的培养和磁性标记

1. 培养人类间质干细胞（MSC）在完整的间质干细胞生长介质（MSCGM）在37°C和5%_二氧化碳。当细胞处于 90% 的汇合处时，以每 150 cm2 烧瓶 37°C 的速度加入 10 mL 的尝试素-EDTA 预热，然后离开 2-3 分钟分离细胞。
   1. 要知道细胞何时分离，使用明亮的场显微镜观察它们。将MSCGM中的分离细胞重新悬浮，并将它们分成四个150厘米2的烧瓶。通过这种方式放大细胞，直到通道4到5。
2. 为细胞标签准备磁性纳米粒子的溶液:将选择的氧化铁纳米粒子浓度分散在无血清罗斯韦尔公园纪念研究所介质（RMPI-1640）中，无谷氨酰胺。RPMI 用于纳米粒子孵化（和相关冲洗步骤），因为它的离子强度低于 DMEM，可更好地防止纳米粒子聚集事件。
3. 当细胞处于通道 4 或 5 和 90% 的交汇处时，去除 MSCGM 介质，用无血清 RPMI（无谷氨酰胺）冲洗细胞，每 150 cm² 培养瓶添加 10 mL 氧化铁纳米粒子溶液，这是覆盖所有细胞所需的最小体积。
4. 在37°C和5%_二氧化碳 下孵化30分钟，然后丢弃纳米粒子溶液。用无血清RPMI-1640（无谷氨酰胺）清洗一次，用Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）孵化，辅以10%FBS和1%青霉素链霉素（每150厘米^2瓶25 毫升），在37°C和5%_二氧化碳 下过夜，使纳米粒子完全内化。

3. 干细胞球体的形成

1. 新鲜制备由DMEM高葡萄糖和L-谷氨酰胺组成的细胞球体培养介质，辅以50μM L-抗坏血酸2-磷酸盐， 0.1 μM 德萨美松，1 米硫酸钠，0.35 m M L-丙氨酸，以及 1% 含有胰岛素、人类转移素和 Selenous 酸 （ITS-Premix） 的通用培养补充剂。
2. 通过添加 10 mL 的 0.05% 的尝试-EDTA 预热，每 150 厘米² 瓶 37 °C 分离磁性 MSC 2-3 分钟。当细胞分离时，立即灭活胰腺素，加入1/3的DMEM体积，补充10%FBS和1%青霉素链霉素预热在37°C。
3. 将分离细胞以260 x g 为5分钟，吸气介质，并在细胞球体培养介质的小体积（每150厘米2瓶不到1 mL）中重新悬浮细胞，例如在大约50μL的介质中拥有200，000个细胞。使用血细胞计计算细胞数，并在需要时调整体积。
4. 在 15 mL 无菌圆锥形离心管中加入 1 mL 新鲜制备的细胞球体培养介质，并添加相当于 200，000 个细胞的重新悬浮溶液体积。
5. 将这些磁性标记的细胞在180 x g 上离心3分钟，例如在管子底部形成细胞颗粒，并保持超纳坦，这是细胞培养介质。
6. 稍微打开管子，让空气交换和孵育在37°C与5%_二氧化碳 长达21天，培养时间沿细胞形成一个凝聚力的3D结构，导致一个完全形成的球体。每周更换两次介质。
7. 在给定的日子里，用在去纳化水中稀释的0.2M可可地酸盐制成的可可酸酯缓冲液两次清洗球形，并在室温下用2%的谷胱甘肽在蒸馏水中稀释30分钟。将固定球体存储在PBS中，直至用于VSM测量或TEM成像。这个固定步骤停止所有生物过程，并允许长期保护。

4. 使用振动样品磁力计（VSM）在溶液和纤维素中量化磁纳米粒子

1. 将一定体积的磁性纳米粒子溶液（最大 10 μL）或单个细胞球体放入专门设计用于 VSM 的样品架中。
2. 将样品插入 VSM 并扫描以进行样品偏移。将样品放置在与磁化最大值对应的位置。
3. 以 20 Oe/s 的速率在低磁场（-1500 Oe 和 +1500 Oe 之间）进行首次测量。
4. 以 200 Oe/s 的速率在高磁场（-30 000 Oe 和 +30 000 Oe 之间）进行第二次测量。

5. 传输电子显微镜分析

1. 对于纳米粒子溶液，将 10 μL 的液态溶液沉积到碳涂层铜网格中，使其在室温下干燥。
2. 对于细胞内化的纳米粒子，将固定细胞球体与乌龙茶提取物 （OTE） 进行对比，在 0.1 M 可可酸酯缓冲液中稀释 0.5%，在 1% 的四氧化硅中固化后含有 1.5% 氰化钾，然后在分级乙醇浴池中脱水，包括在 Epon 中。切片超切 70 nm 并将其沉积到库珀网格中。
3. 使用80千伏的电子显微镜拍摄图像，放大倍数从1k用于观察整个细胞到40k用于观察内分泌室。

结果

使用微波辅助合成，产生单分散 8.8 ± 2.5 纳米核心尺寸的磁性纳米粒子，并涂上柠檬酸盐或 PAA（图 1A）。然后，干细胞与这些纳米粒子一起在培养基中以给定的浓度分散30分钟，导致其内分泌和细胞内分泌（图1B）内。然后，磁性干细胞悬浮在介质、离心体中，形成的细胞颗粒培养长达21天（图1C）。获得的球体是固定的，例如停?...

讨论

使用快速高效的微波合成，磁性纳米粒子可以轻松合成，控制大小，并进一步涂上给定分子。关键的一步是在真空下储存铁盐和苯基醇，以保持小的分散大小。苯基醇同时作为溶剂和配体，允许直接获得校准裸氧化铁，而无需额外的配体。纳米粒子在水中转移后，裸露的磁性纳米粒子可以很容易地涂上多种配体。这种涂层具有纳米粒子和纳米粒子细胞相互作用的特性，可以影响其细胞内化，生物?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024