小鼠脚垫接种模型，研究病毒引起的神经炎反应

摘要

脚垫接种模型是描述体内病毒引起的神经炎反应的宝贵工具。特别是，它提供了病毒动力学和相关免疫病理过程在周围神经系统启动的明确评估。

摘要

该协议描述了一种脚垫接种模型，用于研究小鼠α疱疹病毒感染期间神经炎症反应的启动和发展。由于αherpes病毒是周围神经系统（PNS）的主要入侵者，该模型适用于病毒复制的动力学、从PNS到CNS的传播以及相关的神经炎症反应。脚垫接种模型允许病毒颗粒从脚垫表皮的主要感染部位传播到内层、汗腺和真皮的感官和同情神经纤维。感染通过坐骨神经传播到背根神经（DRG），并最终通过脊髓传播到大脑。在这里，鼠标脚垫接种了伪狂犬病病毒（PRV），一种与单纯疱疹病毒（HSV）和水痘-佐斯特病毒（VZV）密切相关的α疱疹病毒。该模型表明，PRV感染诱发严重炎症，其特点是中性粒细胞渗透和DRG。ELISA随后在同质组织中检测到高浓度的炎症细胞因子。此外，观察到DRG中的PRV基因和蛋白质表达（通过qPCR和IF染色）与亲炎细胞因子的产生之间有很强的相关性。因此，脚垫接种模型提供了更好地了解αherpes病毒引起的神经病变背后的过程，并可能导致创新治疗策略的发展。此外，该模型可以指导对周围神经病变的研究，如多发性硬化症和相关的病毒引起的对PNS的损害。最终，它可以作为药物开发具有成本效益的体内工具。

引言

这项研究描述了一个脚垫接种模型，以调查病毒从PNS到CNS的复制和传播以及相关的神经炎症反应。脚垫接种模型已被密集用于研究神经元^,1、2、32中的αherpes病毒感染。¹³该模型的主要目标是允许神经热带病毒在到达CNS之前通过PNS到达最大距离。在这里，这个模型被用来获得新的见解，在感染伪狂犬病病毒（PRV）的小鼠中发展一种特定的神经病变（神经病变瘙痒）。

PRV是一种与几种众所周知的病原体（即单纯疱疹1型和2型[HSV1和HSV2]和水痘-佐斯特病毒[VZV]）相关的α疱疹病毒，分别引起冷疮、生殖器病变和水痘^4。这些病毒都是泛异性的，能够感染许多不同的细胞类型，而不表现出对特定组织类型的亲和力。然而，它们都表现出一种典型的神经营养，入侵宿主物种的PNS（偶尔还有CNS）。自然宿主是猪，但PRV可以感染大多数哺乳动物。在这些非自然宿主中，PRV感染PNS并诱发一种称为"疯痒"的严重瘙痒，然后是急性死亡^55，6。6神经免疫反应在PRV感染的临床结果和发病机制中的作用一直知之甚少。

脚垫接种模型允许PRV在脚垫的表皮细胞中启动感染。然后，感染扩散到感觉和同情神经纤维，内生表皮，汗腺，和真皮。感染通过通过坐骨神经向DRG移动的病毒颗粒在大约60小时内传播。感染通过脊髓传播，当动物垂死（感染后82小时）时，最终到达后脑。在此期间，可以收集、处理和分析组织样本，以进行病毒复制和免疫反应标记。例如，组织学检查和病毒载量定量可以在不同的组织中进行，以确定PRV发病机制中临床、病毒学和神经炎过程的启动和发展之间的相关性。

利用脚垫接种模型，可以研究小鼠PRV诱导瘙痒的细胞和分子机制。此外，该模型可以提供新的见解，在疱疹病毒感染期间病毒引起的神经炎症的启动和发展。更好地了解αherpes病毒引起的神经病变背后的过程，可能导致创新治疗策略的发展。例如，该模型有助于研究疱疹后病变患者（如疱疹、带状疱疹）的神经病变机制，并测试小鼠中针对相应人类疾病的新治疗靶点。

研究方案

所有动物实验均按照一项议定书（编号2083-16和2083-19）进行，该议定书由普林斯顿大学动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准。这项工作是严格按照生物安全等级2（BSL-2）的要求进行的，我们拥有一个设备齐全的实验室，得到普林斯顿大学生物安全委员会的批准。包括小鼠脚垫磨损、病毒接种、小鼠解剖和组织收集在内的程序在普林斯顿大学生物防护动物设施室的生物安全柜（BSC）中执行。执行手术的人穿着一次性礼服、头罩、护目带、无菌手套、外科口罩和鞋套。

1. 鼠标脚垫磨损

1. 用异物菌气体麻醉剂麻醉C57BL/6小鼠（5~7周大），通过小型麻醉系统（室）以3%的剂量提供。
   1. 在接种前，将鼠标放在麻醉外科的背上，放在后脚垫中。将带有隔膜（大小足以适合动物的枪口）的鼻锥连接到小鼠，以1.5%~2.0%的固定剂量提供异物菌气体麻醉剂。
   2. 密切监控鼠标，以刺激用钳子用力捏住脚趾，从而对痛苦的刺激反应。
2. 轻轻抓住一个带扁平钳子的后脚垫。
   1. 轻轻磨擦后脚垫的玻璃皮约 20 倍，在脚跟和步行垫之间，用砂板 （100~180 砂砾）。不要因磨蚀太频繁或施加过大压力而引起出血。
   2. 使用细钳子，慢慢剥去由磨损分离的地层角膜，露出地层。

2. PRV 脚垫接种

1. 在含有2%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（材料表）的DMEM介质中，将病毒稀释到所需的山丁体中。
   1. 量化PK15细胞上病毒储存中的斑块形成单位（PFU）的数量，以计算和标准化病毒剂量，并相应地稀释病毒内皮。
      注:在这项研究中，以8 x 10⁶ PFU的剂量使用PRV（PRV-Becker）的毒性菌株。在以前的初步实验中，这种剂量得到了优化，以确保所有接种的动物在接种后82小时（hpi）出现临床症状。
   2. 将病毒在冰上保持，并在使用前轻轻混合。
2. 在磨损的脚垫（局部管理）上添加 20 μL 病毒内库（8 x 10⁶ PFU）。并行执行模拟接种（仅限中等）。
3. 用针头的轴轻轻擦10倍，以方便吸附病毒。避免用针尖划伤。每 10 分钟重复此步骤。
4. 将鼠标麻醉30分钟，直到磨碎的脚垫干燥。
5. 停止麻醉后，监测小鼠，直到它能保持胸骨再生，并将其放在单独的笼子里进行临床跟踪和取样。

3. 小鼠解剖和组织收集

1. 感染后的适当时间，通过窒息法（CO_2）对小鼠进行安乐死。
   注:在这项研究中，PRV-Becker感染小鼠的人道终点（当动物开始表现出终端症状时）是82 hpi。同时安乐死控制动物。
2. 使用针头/针将鼠标腹腔侧朝上放在手术垫上。用针固定鼠标的四肢到手术泡沫板。用70%乙醇对小鼠的腹腔进行湿润，以尽量减少毛皮污染。
3. 使用钳子捏住毛皮和皮肤的外部层，并使用细剪刀在尿道开口附近进行一个小的初始切口。
   1. 从这个开口，继续切口在中间腹侧到下巴。
   2. 向前肢和后肢延伸两个侧切口。
   3. 将皮肤与底层肌肉层分开，并固定到侧面。
   4. 打开腹腔，切开到胸部底部。通过做两个横向切口完成腹腔的开口。
   5. 通过切割两侧隔膜和肋骨打开胸腔。
      注:切割肋骨的侧面可防止心脏切开的风险。
   6. 在1.5mL微管中收集暴露的器官，包括心脏、肺、脾脏、胰腺、肝脏、肾脏和膀胱。把管子放在冰上。
   7. 在脚跟和走垫之间切开磨损的脚垫，并将一块纸巾放在管子中，如步骤 3.3.6 所述。
4. 将鼠标背侧向上放置，用 70% 乙醇润湿毛皮。剪切皮肤层以露出椎骨柱。
   1. 在骨盆区域做一个小切口。将皮肤从后肢剥到头部。
   2. 用剪刀与两侧并靠近脊柱平行切割，取出腿部和手臂。
   3. 在头骨底部（C1+C2 水平）砍掉头部。
   4. 用剪刀把头骨从前臂切开到前骨。
   5. 使用钳子以横向方向拉开头骨。
   6. 使用钳子轻轻挖出大脑，按照步骤3.3.6所述进行。
5. 使用弯曲的剪刀切割肌肉、脂肪和软组织，清洁脊柱。切尾巴将完整的脊柱放在含有无菌冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）的15 mL管中。将管子放在冰上，直到进一步解剖脊髓和DRG。

4. 脊髓和DRG提取

注:在小鼠解剖后直接从椎骨柱中提取脊髓和DRG。脊髓和DRG提取的规程是从以前的出版物⁷中改编的。

1. 从冰冷的PBS管中取出椎骨柱，并去除剩余的软组织，在冷藏后更容易。
2. 使用剃刀刀片在柱中穿过椎骨（T1、L1 和 S2 级别）进行三个横向切割。将三块放入含有无菌冰冷PBS的 15 mm 培养皿中。跟踪和标记段的源，以便以后进行分析。
3. 取一个段，并将其固定在钳子之间，背侧朝上。使用剃刀刀片在中线进行单个纵向切割，将柱子分成两个相等的两半。
4. 将两半放入包含新无菌冰冷 PBS 的新培养皿中。确保线段的正确方向能够区分左右两侧。
5. 在解剖显微镜下，用细钳子轻轻地将脊髓从椎骨柱中剥离出每半根，以向方向倾斜。
6. 将两个脊髓半部分收集在含有 500 μL 无菌冰冷 PBS 的 1.5 mL 微管中。把管子放在冰上。
7. 轻轻地从脊柱的一侧取出脑膜到另一侧，露出DRG。
8. 通过抓住暴露的脊髓神经，将其轻轻地从脊柱中拉出，单独取出每个DRG。将收集的 DRG 放入包含冰冷 PBS 的 15 mm 培养皿中。从脊柱部分单独收获所有ipsi边和反向DRG，按照步骤4.5所述进行。
   注:DRG 是沿着白色脊柱神经的圆形透明结构可见的。
9. 在 30–45 分钟内使用另外两个脊柱段重复步骤 4.3_4.7。
10. 在4°C下，以高速（17，900 x g）将所有管离心 3 分钟。
11. 液氮中吸气上清和闪冻管。将管储存在-80°C，以进一步组织均质化。
12. 或者，修复和截面清洁的DRG和其他小鼠组织，用于组织病理学分析和/或免疫荧光染色后步骤4.9。

5. 组织均质化

1. 解冻含有冰上冷冻组织样本的管子。
2. 称量100毫克纸巾，并将其放入含有无菌钢珠和500 μL的RIPA缓冲液的2 mL中，该缓冲液含有0.5 M EDTA（pH = 8.0）、1 M Tris-HCl（pH = 8.0）、5 M NaCl、10%SDS和蛋白酶鸡尾酒抑制剂片剂。
3. 在室温 （RT） 下使用均匀器在 20 周期/s 下破坏组织 2 分钟，然后等待 1 分钟，然后 20 个周期/秒中断 2 分钟。
4. 在 RT 时，在高速（17，900 x g）处将管离心 10 分钟。
5. 将上清液（500 μL）收集到新管中，并将其储存在-20°C，直到执行ELISA和qPCR，分别量化炎症标记和病毒载量。
   注:对于qPCR，用无RNase材料（即珠子、管等）收集所有样品，用含有1%βmercapto乙醇的RNA乳液缓冲液破坏组织（材料表）。

6. 冷冻DRG部分的制备和免疫荧光染色

1. 组织处理
   1. 在 RT 时将解剖和清洁的 DRG 固定在 1% 甲醛 （PFA） 中 2 小时。
   2. 将组织转移到15 mL管与10%蔗糖在PBS。在4°C孵育过夜。
   3. 将组织转移到15 mL管与20%蔗糖在PBS。在4°C孵育过夜。
   4. 将组织转移到15 mL管与30%蔗糖在PBS。在4°C孵育过夜。
   5. 在 OCT 中嵌入组织，使用低温，并将块放置在干冰中，以便快速冻结。
   6. 将样品存放在-80°C，直到使用。
2. 冷冻科制备
   1. 从-80°C中取出冷冻块，使其在低温室温度中平衡30分钟。
   2. 以 15 μm 的厚度对 DRG 进行冷冻，并将部分安装到滑轨上。
   3. 使用笔在滑动式组织周围绘制疏水圈。
   4. 将幻灯片保持在 4°C，直到染色。
3. 免疫荧光染色
   1. 在 RT 中将 DRG 部分 3x 洗涤 10 分钟。
   2. 在37°C下，用100μL的所需原抗体（例如，小鼠抗体对PRV糖蛋白B）孵育1小时。稀释含有10%阴性山羊血清的PBS中的主要抗体。
   3. 重复步骤 6.3.1。
   4. 在37°C下，用100μL的所需二次抗体（山羊抗小鼠Alexa Fluor 488）孵育部分50分钟。仅在 PBS 中稀释二次抗体。
   5. 在PBS中稀释的100μLDAPI（4°，6-二胺酰胺-2-苯胺醇）染料稀释到该部分。在37°C下进一步孵育样品10分钟。
   6. 重复步骤 6.3.1。
   7. 使用荧光安装介质将样品安装到玻璃滑轨上，并用盖玻片固定和盖板。

7. 石蜡嵌入组织部分的制备和H&E染色

1. 在4°C下将组织固定在10%形式内，24小时。
2. 执行固定组织的石蜡嵌入和切片的标准处理计划。将固定组织转移到70%乙醇，并通过升级的酒精加工到二甲苯，然后石蜡，如前所述^8。
   注:使用聚酯海绵将小组织样本（如 DRG）保存在盒式磁带内。
3. 执行标准去石蜡化，然后进行组织部分的 H&E 染色，如前所述⁹。

结果

小鼠脚垫接种模型允许对体内αherpes病毒感染的免疫发病机制进行表征，包括将感染从接种的脚垫复制和扩散到神经系统，以及诱导特定的神经炎症反应。

在这项研究中，我们首先对鼠标后脚垫进行了磨蚀，或者用PRV（PRV-Becker）的毒性菌株对磨损区域进行模拟接种或接种。在控制脚垫中可以看到磨损部位。作为愈合过程的一部分，在磨损部位形成地壳（图1，<...

讨论

此处描述的脚垫接种模型有助于调查在αherpes病毒感染期间神经炎反应的启动和发展。此外，这个体内模型用于建立从PNS到CNS复制和传播的αherpes病毒的动力学。这是其他接种模型的替代，如侧翼皮肤接种模型，它依赖于深皮肤划痕^13，或颅内路线，直接将病毒引入CNS 14，15，16。^14,15,16因此，使用脚垫模型，可...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-PRV gB	Made by the lab		1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red	Fisher scientific	2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)	Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks)	The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml)	Fisher scientific	62248	1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm	Sigma-Aldrich	P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
Fine curved scissors stainless steel	FST	14095-11
Fluoromount-G mounting media	Fisher scientific	0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Isothesia Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml	Denville Scientific	1000945
Microtube 1.5ml	SARSTEDT	72692005
Negative goat serum	Vector	S-1000
Penicillin/Streptomycin	Gibco	154022
Precision Glide needle 18G	BD	305196
Razor blades steel back	Personna	9412071
RNA lysis buffer (RLT)	Qiagen	79216
Stainless Steel Beads, 5 mm	Qiagen	69989
Superfrost/plus microscopic slides	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029	1/2000 dilution