质谱分析，用于识别 EYFP 标记 CENP-A （EYFP-CENP-A） 的泛化

摘要

CENP-A泛化是CENP-A在中心区沉积的重要要求，通过细胞分裂之间的二化遗传，对细胞的生存能力不可或缺。在这里，我们描述质谱分析，以确定EYFP标记CENP-A（EYFP-CENP-A）蛋白的泛化。

摘要

研究基诺胆和中中心体的结构与动力学对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展非常重要。染色体的位置和功能如何确定中心（即中心体特性）并参与准确的染色体分离是一个根本问题。CENP-A被建议为中心鉴定的非DNA指标（表观遗传标记），CENP-A泛化是中心体沉积所需的，通过细胞分裂之间的二化遗传，对细胞的生存能力不可或缺。

在这里，我们描述质谱分析，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，这表明，由于CENP-A K124R突变蛋白中的EYFP标记，在不同的LyFP标记诱导了不同莱氨酸的泛基化。通过质谱分析，成功识别了EYFP-CENP-A K124R中的莱辛306（K306）泛化，与CENP-A中的莱氨酸56（K56）相对应。使用GFP/EYFP或标记高分子量蛋白质作为分析蛋白质功能的工具时讨论了一个警告。目前还讨论了对泛基带的检测、对位点特异性泛基化的识别以及活细胞或整个细胞周期中特定单细胞泛化的可视化的技术限制。

本文介绍的质谱分析方法可应用于具有不同标签的人类CENP-A蛋白和其他中分蛋白。这些组合方法由几种分析/分析组成，可以推荐给有兴趣识别泛基化功能作用的研究人员。

引言

在大多数真核生物中，主轴微管必须附着在每条染色体的单个区域上，称为中心。基内托多尔是位于百分中心附近的蛋白质复合体。研究中胸和基内托多尔蛋白运动的时间以及基内托丘尔和中心体的结构对于了解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展非常重要。关键问题是如何确定中心仪的染色体位置和功能（即中心身份），以及它们如何参与准确的染色体分离。在大多数物种中，含有一种称为CENP-A的特定组蛋白的特殊核细胞的存在定义了中位认同。因此，建议CENP-A是中心标识的非DNA指标（表观遗传标记）。阐明CENP-A如何定义人类中中心身份的机制非常重要。

Holliday结识别蛋白（HJURP）是CENP-A特异性伴郎，它沉积在中中心核^{,体,1、2、3}中。³我们之前曾报道过，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连结对于Lysine124（K124）和中圆素定位4的CENP-A泛基^{酶是必需的}。此外，我们的结果表明，新合成的CENP-A的中程招募需要预先存在的泛基化CENP-A^5。因此，提供了一个模型，表明CENP-A泛基化是通过细胞分裂之间的二化遗传的。

与我们的发现和余等人的调查结果相反，最近发表了关于CENP-A及其中心定位的负面^结果。文章称，CENP-A对莱辛124（K124）的修改对于人类中心体的建立、维持和长期功能是可有的，基于其负面结果表明，K124R的突变不影响CENP-A中心体定位，两者细胞的生存能力^6。然而，在他们的结果和结论中有足够的空间进行辩论，我们已经在他们以前的出版物7中描述了^什么问题。需要注意的是，它们将蛋白质与CENP-A融合在一起，其分子量比内源CENP-A大得多:例如，它们将+30 kDa增强性黄色荧光蛋白（EYFP）融合到+16kDa CENP-A，并分析了RPE-1 CENP-A K124R融合蛋白中的RPE-1^CENP-A-F-F淘汰系统。根据结构预测4，K124泛素预计不会直接与HJURP^结合，但是，单泛素的添加预计将对CENP-A的蛋白质构象产生影响。CENP-A构象的蛋白质可以通过大型融合蛋白的存在来改变，这种构象变化可能掩盖由泛基化损失引起的结构变化。我们建议，大尺寸蛋白质的融合在EYFP-CENP-A K124R突变体中诱导K124以外的Lysine泛基化，而另一个站点的这种泛基化抑制/掩盖原始的K124R单突变表型。CENP-A K124R突变蛋白中具有大标签蛋白（EYFP）的不同莱辛发生泛基化的证据，在我们的上一份出版物^8中报道。研究发现，EYFP标记诱导EYFP-CENP-A K124R的另一个莱辛站点的泛化，EYFP-CENP-A K124R突变体与HJURP结合。因此，在另一个站点的这种泛化抑制/掩盖了原始的K124R单突变体，EYFP-CENP-A WT和K124R突变体都显示出百分位定位（我们使用并比较了pBabe-EYFP-CENP-A WT和K124R突变体，以及pBabe-FPEY控制）。结果表明，标记或未标记的CENP-A K124R突变体是致命的，但可以通过单比素融合来拯救，这表明CENP-A泛化对于细胞的生存能力是必不可少的。

近年来，许多研究已经开发出不同的分析方法，以识别CENP-A蛋白和其他中端细胞-基内托托蛋白的翻译后修饰（PTMs），包括体内和体外^{,9、10、11。,1011}与组蛋白的PTM类似，作为调节染色质功能的主要机制，中分色染色质成分的PTM也参与调节中分素整体结构和功能的基本机制。大多数CENP-A PTM位点特定于CENP-A含核糖体，尽管其中一些在组蛋白H3中保存，这表明这些残留物的修饰有助于中分中心特异性功能。CENP-A的PTM包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛化^，9日曾报道过，这表明CENP-A在其氨基元和C-术语组蛋白折叠域上受到各种PTM及其组合阵列的影响。CENP-A 在多个函数中修改的重要性被包括我们在内的许多团体所揭示。这些功能涉及CENP-A在中心沉积，蛋白质稳定性，和CCAN（构成中心相关网络）^的招募9。然而，CENP-A PPTM 的有限研究和发现是预先形成，其中比较与直接或间接调节其功能的规范组体之一进行比较。侧重于确定这些 CENP-A PPTM 方法的技术报告也有限。

由于CENP-A泛化是CENP-A在^{中心12的沉积所需要，通过}细胞分裂5之间的二化^遗传，对^{细胞活力8}不可或缺，因此，识别CENP-A泛化的方法在未来对于研究中心的功能活性、定位和结构至关重要。因此，在这里我们描述质谱分析，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，表明EYFP标记在CENP-A K124R突变蛋白8中诱导不同莱辛的^泛基化。提出了其他控制测定和分析（免疫荧光分析、菌落生长测定和体内泛化分析）的规程，以恰当地讨论主要质谱分析的结果。

研究方案

1. pBabe-EYFP-CENP-A构造的细胞培养和逆转录病毒转染

注:EYFP-CENP-A 以与内源 CENP-A 相似的蛋白质水平从 pBabe-EYFP-CENP-A 表示。总细胞CENP-A蛋白被这种EYFP-CENP-A所取代，在CENP-A-/F等位^-/F基因被Cre重组酶破坏后，如RPE-1 CENP-A-/--细胞^6。

1. 使用293T包装细胞制备含有逆转录病毒的上一症。
   1. 第 0 天:将 293T 包装细胞铺在 6 井培养板（1.0 x 10⁶细胞/井）上。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。在 37 °C 的大气中孵育细胞，在 5% CO_{2 的大气中}孵育 24 小时。
      注:为了获得最佳结果，实证确定用于播种的细胞密度。
   2. 第1天:在扩散后23小时左右准备转染反应（24小时点是转染的0小时点）。每个 pBabe-EYFP （B3182）、pBabe-EYFP-CENP-A WT （B3161） 和 pBabe-EYFP-CENP-A K124R （B3164） 的异质表达质粒（参见表 1）。
   3. 选择表2中列出的帮助器/包装质粒组合，并将其添加到包含上面列出的质粒之一的管中。帮助者/包装质粒的这3种组合大多有这3种组合（表2）。任何组合在这些实验中都有效，并显示出类似的转染效率。
   4. 制备 50 μL 的减少血清介质，并混合每个 pBabe-EYFP （B3182）， pBabe-EYFP-CENP-A WT （B316） 的 2.0 μg 1）和 pBabe-EYFP-CENP-A K124R （B3164） （见表1） 添加表 2 中列出的帮助器/包装质粒的一种组合（见下文）。在室温下孵育这种混合物5分钟。这种混合物是溶液 A。
   5. 再制备 50 μL 的减少血清介质，并分别混合 1.5 μL 的转染试剂 I 和 II（材料表）。在室温下孵育这种混合物5分钟。这种混合物是溶液B。
      注:可选地，在溶液B中只添加6.0μL的转染试剂III（聚乙烯胺[PEI];1.0mg/mL），或在溶液B（材料表）中添加6.0μL的转染试剂III和II。
   6. 将溶液 A 和 B 混合在一起，在室温下孵育 15 分钟。
   7. 使用 PBS 洗涤培养细胞一次后，将溶液 A 和 B（即 DNA 脂复合物）的混合物直接添加到具有 500 μL 减少血清介质的 6 井培养板的每个井中。质粒的最终浓度为3.3μg/mL。
   8. 在 37 °C 下在 5% CO₂的大气中孵育细胞 4.5 小时后，使用 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素将中高葡萄糖 DMEM 更改为高葡萄糖 DMEM。在6井培养板中介质变化后，将培养介质的2mL/井。
   9. 转染后48小时，在37°C的大气中培养细胞，₂在5%CO2的大气中。使用含有逆转录病毒的上一名上一名，于第3天进行逆转录病毒感染。
2. CENP-A-/F^-/F RPE-1靶细胞的逆转录病毒感染。
   1. 第2天:感染前一天，传播^CENP-A-/F RPE-1靶细胞，在6井培养井（2.25 x 10^{5细胞/井）}中转染。DMEM中的培养细胞:F12培养基（材料表），具有10%FBS和1%青霉素链霉素。
      注:传播细胞的菌落生长分析，免疫荧光，和西部印迹分析作为控制。为了获得最佳结果，实证确定用于播种的细胞密度。
   2. 第3天（病毒感染日）:在293T包装细胞转染后48小时，收集含有病毒的上清液，并通过0.45μm过滤器过滤（不要使用0.2μm过滤器，将剪切病毒包络）。建议使用聚氨酯 （PES） 过滤器。
   3. 感染^CENP-A-/F RPE-1细胞与病毒。对于 6 井培养板的一个井，在 8 μg/mL 的最终浓度中加入 1 mL 新鲜介质、1 mL 病毒上细剂和多纤维素。在37°C的大气中孵育CENP-A-/FRPE-1细胞，在5%CO2的大气中_孵育4天，直到转染后的第7天。^-/F
      注^:CENP-A-/F RPE-1细胞生长的潜伏期必须通过以下分析确定，以获得最佳结果。

2. 含有pBabe-EYFP-CENP-A的细胞的免疫荧光分析

1. 第 7 天: 在 pBabe - Eyfp - cenp - A 构造的逆转录病毒感染后 4 天， 通过渴望去除培养基。用 TBS 冲洗细胞一次（25 mM Tris-HCl，pH 7.5;125 mM NaCl）。将 TBS 涂抹在培养井的一侧，以避免干扰细胞表面。
   注:必须根据经验确定细胞固定的最佳时间点。EYFP-CENP-A WT 和 K124R 的免疫荧光信号在 pBabe-EYFP-CENP-A 构造的逆转录病毒感染后至少 4 天在中心可检测到，即使没有 Cre 感染（数据未显示，图 1C-E用于 Cre 感染数据）。
2. 执行甲醇细胞固定和免疫荧光染色，如前面所述^13。
3. 由于原抗体使用抗GNP抗体（1:1，000稀释）和抗CENP-B抗体（稀释比1:200）在含有4%山羊血清的TBS中用于百分之一色位置标记（参见使用抗体的材料表）。
4. 用纸巾去除多余的安装介质，并在最后一步用指甲油密封盖玻片的边缘。
5. 请参阅前面描述的方法^13，用于免疫荧光图像观察、采集、定量和分析 EYFP-CENP-A 在百分中心的剩余信号。
6. 使用软件 A 或软件 B1 和 B2 执行图像采集、处理，包括去卷积、量化和分析（参见材料表）。可选地使用软件C1-C3（见材料表）作为共和激光扫描显微镜。
   注:有关软件 A 中使用的所有命令，请参阅补充编码文件中的 2.6.1。有关软件 B1 和 B2 中使用的所有命令，请参阅补充编码文件中的 2.6.2。

3. 在复古克里病毒感染后使用 pBabe - Eyfp - cenp - a 进行殖民地生长分析

注:进行此检测的原因是比较 EYFP-CENP-A WT 和 K124R 突变体之间的细胞生存能力，在 Cre 重组酶^中断后（在完全细胞 CENP-A 蛋白替换后）。

1. pBabe-EYFP-CENP-A 构造的逆转录病毒转染。
   1. 执行CENP-A-/F RPE-1细胞的逆转录病毒转染，如第1节所述。^-/FDMEM 中的培养细胞:F12 培养基，病毒感染后 72 小时，具有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素。
   2. pBabe-EYFP-CENP-A构造的逆转录病毒感染三天后（第6天），在含有转染细胞的井中加入沙基丁S（10μg/mL），用于菌落生长测定和控制实验。细胞在病毒感染后至少14天生长，在爆炸性S.每5天改变一次含有爆炸基丁S的介质。
      注:如果细胞在种子化菌（3.2.7.和3.2.8）播种前达到约80%的汇合，则通过6井培养板的三聚和电镀以1:2和1:5的比例通过细胞。
   3. 收集细胞的西部印迹第7天，以确认pBabe-EYFP-CENP-A构造的蛋白质表达没有Cre感染。执行西部印迹分析，如第 4 节所述。结果如图1B（通道1-4）所示。
   4. 对于与Cre病毒感染的菌落生长检测，保持细胞生长14天后，病毒感染存在爆炸性S（即，生长细胞在爆炸基丁S含有介质，直到第17天这里显示的结果）。
2. pBabe- puro - cre 的复古克雷病毒感染
   注:步骤 3.2.1 中的第 0 天对应于第 3.1 节的第 13 天。
   1. 第 0 天至第 3 天:使用 pBabe-puro-Cre （B3027） 作为表达质粒，执行^CENP-A-//F RPE-1 细胞的逆转录病毒转染（详情见第 1 节）。确保在培养基中添加气砂基丁 S （10 μg/mL）。
   2. 第4天:对细胞进行尝试，将其从盘子中分离出来。在6井培养板中，板500或5000个细胞三分之一。DMEM 中的培养细胞:F12 培养基，具有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素。
   3. 第5天:向培养基中加入气砂基丁S（10μg/mL）。对于 5，000 或 500 个细胞的电镀，选择具有气化 S （10 μg/ml） 的细胞 3-24 天（直到第 14 天在 [3.2.7]） 或 3-28 天（直到第 18 天在 [3.2.8]） 病毒感染的构造 （pBabe-EYFP-CENP-A 构造）。
      注:在这个殖民地的外延检测中，pBabe-puro-Cre的转染与pBabe-EYFP-CENP-A的转染一起添加。pBabe-EYFP-CENP-A 的转染在 3.1 中执行。pBabe-puro-Cre 的转染在 3.2.1 中执行。
   4. 第10天（逆转录病毒感染后7天）:收集细胞进行西部印迹分析，以确认逆基病毒感染后内源性CENP-A的蛋白质耗竭和/或pBabe-EYFP-CENP-A构造在同一天的第10天。
   5. 执行西部印迹，如第 10 天第 4 节所述。结果如图1B 所示（通道 5-7）。
   6. 执行免疫荧光分析（上文第 2 节），确认 EYFP-CENP-A WT 和 K124R 在剩余内源 CENP-A 等位基因灭活 7 天后局部化到中心。结果如图1 C-1E所示。
   7. 第14天:用5000个细胞种子的盘子进行菌落生长测定。在水晶紫罗兰溶液中修复10分钟的甲醇和染色10分钟（2.3%水晶紫罗兰，0.1%的氧化铵，20%乙醇（见图2B）。计算使用 OpenCFU 软件的殖民地数量（参见图 2C）。
   8. 第18天:使用用500个细胞播种的盘子。修复和染色细胞，如步骤3.2.7所述（参见图2B）。计算菌落的数量（参见图2C）。

4. 使用 pBabe-EYFP-CENP-A 进行西方印迹分析

注:请参阅前面描述的方法^13，使用图1B和图2A所示的抗体进行西式印迹分析，以及EYFP-CENP-A蛋白材料表。 Table of Materials

1. 通过分离不同病毒感染的细胞来分离蛋白质。然后，在SDS PAGE凝胶的一个井中使用20μg的蛋白质。如前13所述，将蛋白质转移到PVDF^膜上。
2. 用初级二级抗体孵育后洗膜3倍。使用红外成像系统和/或化学发光成像仪检测和分析膜上的蛋白质带，用于免疫光。这些结果如图1B和图2A所示。
   1. 有关红外成像系统检测和分析蛋白质波段，请参阅补充编码文件中的步骤4.2.1。 Supplemental coding files
   2. 使用化学发光成像器检测和分析蛋白质波段，参见补充编码文件中的步骤4.2.2。 Supplemental coding files对于该系统，请使用超灵敏增强型化学发光（ECL）基板（材料表）。
   3. 可选地，使用西印脱液缓冲液从PVDF膜中剥离预孵化的抗体，并结合不同的抗体进行再剥离，用于下一轮西方分析。通过经验确定优化的孵育时间和使用温度。

5. 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行细胞培养、转染和体内泛化测定

注:从pQCXIP载体表达的EYFP-CENP-A蛋白水平比内源性CENP-A蛋白水平高10倍。这种载体的使用有助于免疫沉淀更高数量的EYFP-CENP-A蛋白，观察EYFP-CENP-A的泛基化带，并通过质谱分析鉴定EYFP标记CENP-A（EYFP-CENP-A）蛋白的泛基化。

1. 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行体内泛化测定的转染。
   1. 种子 36.2 x 10⁵ CENP-A^-/F RPE-1 细胞在10厘米组织培养皿中。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。
      注:为了获得最佳结果，实证确定用于播种的细胞密度。为一个免疫沉淀（IP）样品准备至少2个菜，以获得至少1毫克的总蛋白质。
   2. 在37°C的大气中孵育细胞，在_{5%CO2的大气中}孵育18小时。
   3. 播种后17小时，准备转染试剂。
   4. 通过混合每个 pQCXIP-EYFP （B3252）， pQCXIP-EYFP-CENP-A WT （B3254）， pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R （B3256） （表1） 在 335 μL 的减性血清介质中， 并在室温下孵育5分钟，在所有样品中加入6.7μg的pCGN-HA-泛素（B2806）。
      注:所有向量都列在表1 中。
   5. 将10.1μL的转染试剂II和II混合，分别混合在335μL的血清介质中，并在室温下孵育5分钟，使溶液B化。
      注:可选步骤是仅在溶液B中添加40.2μL转染试剂III（聚乙烯胺[PEI];1.0mg/mL），或在溶液B（材料表）中添加40.2μL转染试剂III和II）。
   6. 将溶液 A 和 B 混合在一起，在室温下孵育 15 分钟。
   7. 使用 PBS 清洗培养细胞一次后，将溶液 A 和 B（即 DNA 脂复合物）的混合物直接添加到每个具有 3.35 mL μL 减少血清介质的单个 10 厘米组织培养盘中。
      注:质粒的最终浓度为1.67μg/mL。
   8. 用5%CO 2孵育细胞，4.5小时₂。4.5小时后，用10%FBS和1%青霉素链霉素将中高血糖DMEM改变。
   9. 转染后48小时，在37°C下用_5%CO2培养细胞。收集细胞，用于细胞酸盐制备。
2. 制备蛋白质 A 珠与抗 GFP 抗体结合。
   1. 服用25μL（50%v/v）蛋白质A珠，用于免疫沉淀（IP）的一次反应。用缓冲器 A1 （材料表） 清洗至少 3 倍以去除 EtOH， 使用缓冲液 A1 （20 mM Tris-HCl， pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% 非化物 P-40; 0.5% 脱氧二酯; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; 完整的无 EDTA 蛋白酶抑制剂试剂）
   2. 将2.0μL的抗GP抗体（抗#76:自制抗体）添加到上面制备的珠子中，并加入10倍的缓冲量 A1 与净珠体积进行比较。
   3. 在 4 °C 下进行端到端旋转 4-18 小时。端到端旋转的最佳时间长度必须根据免疫沉淀的效率从经验上确定。
   4. 将珠子以 100 x g离心 1 分钟，然后取出未绑定的上一代。添加缓冲区 A1 以重新制作珠子的 50% （v/v） 溶液。使用此溶液的 25 μL （50% v/v） 进行 IP 的一次反应。
3. 使用蛋白质 A sepharose 珠与抗 GFP 抗体结合的免疫沉淀 （IP）。
   1. 在缓冲器 A1 中通过声波和冷冻解冻过程获得步骤 5.1.9 中的 Lyse 细胞。
   2. 测量不同IP样品的蛋白质浓度并使其蛋白质含量正常化。从每个管中取出 5% 的样品，以 SDS-PAGE 中的 5% 输入样品运行。
      注:如果一天内未加载，5% 输入样品可冷冻在液氮中，并储存在-80°C。
   3. 将其余95%的解酶与25μL（50%v/v）的蛋白质 A 珠混合，该珠子结合在步骤5.2中制备的抗GFL抗体。在 4 °C 下进行端到端旋转 4-18 小时。
      注:端到端旋转的最佳时间长度必须以经验方式确定。
   4. 离心蛋白与蛋白质结合的珠子（即免疫沉淀物）与100 x g1分钟，并去除上清液。用缓冲液 A1 用缓冲液洗涤免疫沉淀物，在 100 x g下离心 1 分钟。执行此步骤 4x。
   5. 将 5% 输入和其余 95% 免疫沉淀物分别与 2x 和 4x SDS-PAGE 加载缓冲液¹⁴混合。将这两个样品煮5分钟，然后将它们装在10.0%的变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，用于不同通道中的电泳。使用更大的 SDS-PAGE 凝胶（例如，17 厘米 x 15 厘米）进行电泳。如果样品在较小的凝胶中运行，则可能无法观察到透明/锐利的泛化带。
   6. 使用上一份报告8中所示的抗体进行西方印迹分析，如第^4节所述。结果如图2A所示。
   7. 使用西印迹剥离缓冲液从PVDF膜中剥离预孵化的抗体，并结合不同的抗体进行下一轮西部印迹分析。

6. 质谱法，用于识别EYFP-CENP-A K124R突变体泛基化位

1. 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行质谱分析的转染。
   1. 种子^CENP-A-/F RPE-1细胞在10厘米组织培养皿。检查细胞密度是36.2 x 10⁵细胞每个菜。高血糖DMEM培养细胞，10%FBS和1%青霉素链霉素。为一个免疫沉淀（IP）样品准备至少20个菜，以获得至少10毫克总蛋白（见5.3）。
      注:为了获得最佳结果，实证确定用于播种的细胞密度。
   2. 在 37 °C 的大气中孵育细胞 5% CO₂ 18 小时。在扩散后准备转染试剂 = 23 小时（24 h 点是转染的 0 h 点）。
   3. 播种后17小时，将转染试剂和转染细胞准备为（4.1.3）。转染细胞有pCGN-HA-泛素（B2806）和pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R（B3256）。
   4. 转染后，在5%CO2的大气中孵育细胞，48小时₂。收集细胞的细胞。
   5. 缓冲液A1中的酶细胞，执行免疫沉淀（5.2）和（5.3）。运行这两个免疫沉淀物如下 （6.1.6） 和 （6.1.7）。
      注:在 （6.1.6） 中，在标准三叶甘油凝胶中运行样品。在 （6.1.7） 中，在市售的 4%-12% 的 Bis-Tris 蛋白凝胶中运行样品。另请参阅讨论。
   6. 保留一个样本，用于总免疫沉淀物的 10%，以确认 EYFP-CENP-A 泛化，并精确确定泛化 EYFP-CENP-A 的位置，如第 5 节所述。在标准的三叶甘油凝胶中运行此示例。SDS-PAGE 和西部印迹执行为 （5.3）。
   7. 为 90% 的总免疫沉淀物保留另一个样本，用于质谱分析。在市售的 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶的两口井内运行此样品。使用库马西蓝色溶液执行库马西蓝色染色。切入并切出50-70 kDa的凝胶区域（单-Ub-EYFP-CENP-A K124R区域）。使用此凝胶区域进行质谱分析。
2. 使用凝胶内消化进行质谱分析。
   1. 将每个凝胶片切成小块（1 mm^2），放入0.5 mL的蛋白质低结合管中。
   2. 用 100 μL 50% （v/v） 乙酰二角液在 25 mM NH₄HCO₃中洗涤，涡流 10-15 分钟，向下旋转，丢弃上流水线，重复 3 倍。
   3. 使用台式真空浓缩器将样品浓缩 30 分钟，以干燥凝胶片。
   4. 加入10μL的10纳克/μL测序等级的三辛，让凝胶片补充水分5分钟。
   5. 加入 25 mM NH₄HCO₃足以覆盖凝胶片，在 37 °C 下消化过夜。
   6. 将消化的上清液转移到干净的0.65 mL硅化管中。加入50%（v/v）乙酰酸/5%（v/v）甲酸（30μL或足以覆盖），涡流10分钟，旋转并转移到同一个萃取管中。重复 3x 。
   7. 将 10 μL 乙酰酸盐加入凝胶片中，涡流 5 分钟，然后向下旋转。将上一液转移到同一管。
   8. 使用台式真空浓缩器将样品浓缩至 2 μL，将 8 μL 3%（v/v） 乙酰酸 /2% （v/v） 甲酸添加到样品中，涡流 15 分钟，以 16，000 x g 旋转30 分钟。样品可进行质谱分析。
   9. 使用液相色谱系统（材料表）和质谱仪（材料表）使用LC-MS/MS执行MS数据采集。
   10. 将8μL的重组样品注入反相液相色谱（RPLC）柱上。
   11. 在60分钟内用2-80%的溶剂B梯度分离肽。 确保梯度由溶剂 B 在 40 分钟内从 2% 到 22% 增加百分比组成，在 12 分钟内从 2% 到 35% 溶剂 B 增加百分比，然后在 4 分钟内爬升至 80% 溶剂 B，最后保持 80% 溶剂 B 的最后 4 分钟。将流速常数设置为 300 nL/min。
       注:溶剂甲含有0.1%的甲酸和2%的乙酰三叶酸，甲酸溶剂B含有0.1%的甲酸和98%的乙酰三叶酸。所有浓度都显示为体积/体积。
   12. 使用依赖于数据的采集模式收集质谱数据。简言之，在 250 ms/z 中收集 MS 光谱 250 ms. 选择充电为 2~5 的 50 个强烈前体，以进一步分段。收集MS/MS光谱在100~2000米/z100 ms，排除前体离子从15 s的重选。
   13. 对于数据库搜索，请打开商业软件（参见材料表），分析桌面上的质谱数据。
   14. 要进行新的搜索，请单击顶部菜单上的"LC"按钮。然后单击"添加"按钮上传原始 MS 原始数据文件。
   15. 选择"人蛋白ID"中的"Paragon方法"作为数据库搜索方法。根据 UniProt Homo Sapiens 数据库（包含 160，566 个序列（包含 160，566 个序列）搜索原始 MS 原始数据http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640）。
   16. 将搜索参数设置为以下内容:选择trypsin作为消化酶，允许多达 3 个缺失的裂解，4 个修饰和每个肽 2-5 个电荷。为第一次搜索设置高达 20 ppm 的质量误差，为碎片离子设置 0.02 Da。为小于1% 的蛋白质、肽和修饰位点指定错误发现率 （FDR） 阈值。将软件中的所有其他参数设置为默认值（有关质谱分析，请参阅图3）。
   17. 单击顶部菜单右侧的"另存为"按钮，选择用于存储搜索结果的文件夹，输入搜索名称，然后单击"保存"按钮。
   18. 单击顶部菜单右侧的"进程"按钮开始搜索。搜索结束后，输入的搜索名称的数据将自动存储在所选文件夹中。软件 F 可以轻松打开数据。
   19. 要获取任何特定肽的 MS/MS 光谱，请双击搜索结果以通过软件 F 打开它。首先，单击菜单顶部蛋白质列表中的蛋白质，然后单击菜单中间的肽。此肽的 MS/MS 显示在菜单底部。
   20. 要导出和保存 MS/MS 光谱，请右键单击菜单底部的 MS/MS 光谱，选择复制，然后粘贴到合适的文件，如 PPT 或文档格式。

结果

EYFP-CENP-A K124突变体显示泛基化，与HJURP相互作用，且百分位定位无缺陷，两者无细胞杀伤性。在这里，Fachinetti等人（2017年^{）报告的系统被}重新构成:在二倍体人类（RPE-1）细胞携带一个中断和一个'漂浮'CENP-A等位基因（CENP-A-/F），EYFP-CENP-A从pBabe-EYFP逆转录病毒载体表达。CENP-A^-/F在这个系统中，CENP-A-/F等位基因的内生CENP-A的表达可能被Cre重?...

讨论

在这里，我们描述了质谱分析的方法，以确定EYFP-CENP-A K124R突变体泛化，这表明EYFP标记在CENP-A K124R突变蛋白8中诱导不同莱辛的泛^基化。在我们的结果中，我们通过质谱分析成功地确定了EYFP-CENP-A K124R中莱辛306（K306）的泛化，与CENP-A中的Lysine 56（K56）相对应。此处描述的质谱分析是一种模拟方法，因为我们之前识别的是 CENP-A WT-Flag¹²的 Lysine 124 （K124） 泛化位点?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes	Eppendorf	022431064	For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish	BIOFIL/JET, China	700224	10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6-well culture plate
CentriVap	LABCONCO	-	Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm	Eksigent Technologies	805-00120	Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE	100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS	63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope	Leica	-	motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source	Leica		External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)	Surgipath	105	Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus	Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences	31071010	Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D	Eksigent Technologies	-	liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher	NP0335BOX	The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	-	Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera	Hamamatsu	C10600-10B	CCD camera
PAP Pen	Binding Site	AD100.1	For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM	VWR	25382-166	10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size)	Junyi, China	JY-SCZ6+	Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted	VWR International	48312-013	Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody	Novus Biologicals	H00001059-B01P	Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH	ABCAM	ab37168	Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH	Invitrogen	PA1987	Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody	ANTI #76 (Homemade antibody)		Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10)	Roche	11815016001	Rat monoclonal antibody
anti-HJURP	Proteintech Group	15283–1-AP	Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin	Bethyl Laboratories	A300-317A-1	Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	Microtip for sonication
Buffer A1	-	-	20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11-873-580-001	Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250	BBI Life Sciences	CAS 6104-59-2	Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)	SigmaI-Aldrich	HT90132-1L	For colony staining
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	For nuclear staining
DMEM: F12 Medium	ATCC	30-2006	DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol	Fisher	A412-4	Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)	Fisher Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	Non-fat skim milk
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	Reduced serum media
p-phenylenediamine	SIGMA-SLDRICH	P6001	For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml	Polysciences	23966–2	Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads	GE Healthcare/Amersham	17-0963-03	Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	PI21059	Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo	34095	Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)	-	-	Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software	Olympus	-	Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software	Olympus	-	Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18	Olympus	-	Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0	LI-COR Biosciences	-	Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System	Bio-Rad	-	Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System	LI-COR Biosciences	-	Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware	-	-	For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software	Improvision/PerkinElmer	-	Software A
ProteinPilot Software version 4.5	AB SCIEX	-	Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software	Bio-Rad	-	Software E
TripleTOF 5600+ System	AB SCIEX	-	Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)	PerkinElmer	-	Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)	PerkinElmer	-	Software B2