从人体 iPS 细胞中提取的网状工程心脏组织用于活体心肌修复

摘要

本协议产生网状工程心脏组织，其中包含来自人类诱导多能干细胞的心血管细胞，以便研究心脏病的细胞植入疗法。

摘要

目前的协议描述了产生可扩展的网状工程心脏组织（ECTs）的方法，这些组织由来自人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的心血管细胞组成，这些细胞朝着临床使用的目标发展。HiPSC衍生的心肌细胞、内皮细胞和血管壁画细胞与凝胶基质混合，然后倒入具有矩形内部交错柱的聚二甲基硅氧烷（PDMS）组织模具中。到培养日，14个ETS成熟成一个1.5厘米x1.5厘米的网状结构与0.5毫米直径的硫纤维束。心肌细胞与每个束的长轴对齐，并自发地同步跳动。这种方法可以放大到更大的（3.0 厘米 x 3.0 厘米）网格 ECT，同时保持构造成熟度和功能。因此，从hiPSC衍生心脏细胞产生的网状EEC对于心脏再生范式可能是可行的。

引言

许多临床前研究和临床试验已经确认了细胞为基础的心脏再生疗法对心脏^{1，2，3,2失败的有效性}。在各种细胞类型中，人类诱导多能干细胞（hiPSCs）凭借其增殖能力、产生各种心血管血统^4、5,和全源性的潜力，^是有希望的细胞来源。此外^,，组织工程技术已经使得将数百万个细胞转移到受损的心脏^{5，6，7，8。6,758}

此前，我们报告了从hiPSC衍生的心血管系生成三维（3D）线性工程心脏组织（ECTs），使用商用的培养系统进行3D生物人工组织^5,5，7。我们发现，ECT内血管内皮细胞和壁画细胞与心肌细胞共存，促进了结构和电生理组织的成熟。此外，我们验证了在免疫耐受大鼠心肌梗塞模型中植入hiPSC-ECTs的治疗潜力，以改善心脏功能，再生心肌，增强血管生成^5。然而，此方法构建的线性 EC 是 1 mm x 10 mm 圆柱体，因此不适合植入临床前研究与较大的动物或临床用途。

基于成功利用组织模具利用大鼠骨骼肌细胞和心肌^细胞9、人类ESC衍生心肌^{细胞10和小鼠 iPSCs 11}生成多孔工程组织形成，我们开发了一种协议，利用聚二¹¹氧化硅氧烷 （PDMS） 霉菌生成可扩展的 hiPSC 衍生更大的可植入组织。我们评估了一系列模具几何形状，以确定最有效的模具特性。与缺少毛孔或结的薄板或线性格式相比，具有多个束和结的网状 EC 在细胞生存能力、组织功能和可伸缩性方面表现出出色的特性。我们把网状ECT植入大鼠心肌梗死模型，并确认其治疗效果类似于植入的圆柱形^ECT12。在这里，我们描述了生成 hiPSC 派生网格形状的 ECT 的协议。

研究方案

1. 维护高保和心血管分化

1. 在从小鼠胚胎成纤维细胞（MEF-CM）中提取的有条件介质中，在具有人类基本成纤维细胞生长因子（hbFGF）的中，在薄涂层基底膜基质（生长因子减少，1:60稀释）⁴上扩展和维护hiPSC。
   注:我们使用了hiPSCs（4因子（10月3/4，Sox2，Klf4和c-Myc）行:201B6）。在每个细胞系的适当浓度下添加 hbFGF。拉米宁-511片段也可用于培养皿的涂层，而不是地下室膜基质。专为无馈线培养的 hiPSC 培养而设计的商用介质可用作 MEF-CM 的替代品。
2. 当细胞汇合达到90\u2012100%时，使用宇宙（0.48 mM乙酰乙酸（EDTA）溶液分离和分离细胞。
   注:还可用于其他用于细胞分离的商用产品。
3. 在 MEF-CM 中具有 hbFGF 和培养的基质涂层细胞培养板上，以 10，000 个细胞/mm² 的密度进行板状细胞，培养两到三天。
4. 当培养成为完全汇合时，用基质覆盖细胞（1:60 稀释与 MEF-CM）一天。
5. 将 MEF-CM 更换为 RPMI 1640 + B27 介质。将 100 ng/mL 的 Activin A 和 100 ng/mL 的 Wnt3A 添加到介质中一天。
   注:这是区分的第 0 天。为了调节规范的Wnt信号，还可以使用GSK3+抑制剂代替Wnt3A。
6. 在差异化的第 1 天，将介质更改为新的 RPMI 1640 + B27，BMP4 的 10 ng/mL 和 hbFGF 的 10 ng/mL。培养细胞为两个（MC协议）或四个（CM+EC协议）天没有中等^变化5。
   注:CM+EC协议经过优化，可同时诱导心肌细胞（CM）和血管内皮细胞（EC）。MC 协议经过优化，可优先诱导血管壁画细胞 （MC）。
7. 用于电磁和 EC 诱导的 CM+EC 协议（图 1A）。
   1. 用 RPMI 1640 + B27 更换分化第 5 天的介质，并辅以 50 ng/mL 的 VEGF₁₆₅。
   2. 每 48 小时更换培养培养，直到第 13\u201215 天分化。
8. 血管壁画细胞诱导的MC协议 （图1B）
   1. 在分化的第 3 天，用 RPMI1640 ± 10% 胎儿牛血清 （FBS） 代替介质。
   2. 每 48 小时更换培养培养，直到第 13\u201215 天分化。

2. 分化日13\u201215细胞收获和血统分析

1. 用 Ca^{2+ 和} Mg²⁺ 自由磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗细胞。
2. 在细胞培养盘中加入细胞分离溶液（含有蛋白酶、胶原酶和DNAse）以覆盖盘子。在37°C下孵育板5分钟。
3. 孵化后使用移液器收集细胞，用培养培养培养培养体分离细胞。
4. 分配 1 x 10⁶ 个细胞进行流式细胞分析。为了消除死细胞，用可修复的可行染料染色细胞。
5. 用 5% FBS 用 PBS 中的膜表面标记染色细胞。在荧光活性细胞分选 （FACS） 染色缓冲液中使用以下抗体稀释剂:抗PDGFR®（1:100）、抗VE卡德林（1:100）、抗TRA-1-60（1:20）。
6. 对于细胞内蛋白质，在PBS中用4%的甲状甲醛（PFA）重新暂停和修复细胞。
7. 用5%FBS和0.75%的萨波宁用特洛平宁T（cTnT）的抗心脏异构体染色细胞，然后用488只小鼠IgG1（稀释1:50）标记cTnT抗体。
8. 用 5% FBS 将 PBS 中的染色细胞重新暂停，并用细胞过滤器将它们放入 FACS 管中。
9. 使用流式细胞分析每个分化协议的染色细胞的细胞组成，以方便生成具有明确谱系分布的细胞悬浮液。
   注:执行此程序时，ECT 的剩余电池悬浮液保存在 4 °C 冰箱中。

3. PDMS组织模具的制造

1. 通过以 10:1 的比例混合预聚聚合物和交联溶液，在 80°C 下固化 3 小时，施用 0.5 mm 厚且超过 30 mm x 30 mm 的聚二氧化硅氧烷 （PDMS） 层。
2. 切割 PDMS 板材，用硅胶粘合，以在交错位置制造 21 mm x 20.5 mm 矩形托盘，长 7 毫米、宽 0.5 毫米和 2.5 毫米高矩形柱。两行柱子之间的水平柱间距为 2.5 mm（图 2B）。
3. 在 120 °C 下将托盘自动保存 20 分钟。
4. 在 PBS 中用 1% 的马球 407 涂覆托盘 1 小时。冲洗马球 407，并在使用前用 PBS 充分冲洗模具。

4. ECT 结构

1. 细胞系分析后，结合CM+EC和MC协议的细胞，使MC的最终浓度为10-20%，每个构造的细胞数为600万个^细胞。
2. 悬浮在ECT培养基中混合的600万细胞（α最小基本培养基辅以10%FBS、50μM 2-甲醇和100 U/mL青霉素-链霉素）。
3. 矩阵解决方案的准备
   1. 将酸溶性大鼠尾胶原蛋白 I 型溶液（2 mg/mL，pH 3）与 17 μL 的最小基本介质 （MEM） 混合 133 μL。然后将溶液与 17 μL 碱缓冲液（0.2 M NaHCO_3、0.2M HEPES 和 0.1 M NaOH）混合。
      注:胶原蛋白必须保存在冰上（4 °C）。检查缓冲区颜色，如果混合所有溶液时介质未变粉红，则向介质添加额外的碱缓冲。混合步骤必须混合胶原蛋白 I = 10x MEM，然后添加碱缓冲液。不要更改此顺序。不要在混合物中产生气泡。
   2. 在中和胶原蛋白溶液中加入67μL的基底膜基质。
      注:混合溶液必须保存在冰上（4°C）。
4. 在1，100 rpm（240 x g）下将含有600万个细胞的制备细胞悬浮液离心5分钟，用167μL的高葡萄糖DMEM +20% FBS = 1% 青霉素链霉素 （100x） 重新悬浮细胞。
5. 混合细胞悬浮液和矩阵溶液。一个构造的细胞/基体混合物的总体积为 400 μL。
   注:在此步骤中，细胞/基体混合物应为非粘性和粉红色。保持在冰上，因为凝胶将在室温下凝固。胶原蛋白 I 型的最终浓度为 0.67 mg/mL。
6. 将细胞/基体混合物均匀地倒在 Poloxamer 407 涂层 PDMS 组织模具上，该模具被放置在六井培养板^{12 中}。
   注:小心倒注混合物，避免产生气泡，以防止灌装凝胶中的缺陷。
7. 在标准CO2培养箱_（37C，5 % CO_2）中孵育细胞/基质混合物60分钟。
8. 组织形成后，用4 mL的ECT培养培养培养中浸泡组织模具。
   注:虽然单元格/矩阵在 60 分钟内交联，但构造仍然非常脆弱。轻轻添加介质，以免损坏。
9. 培养组织14天，每天中等变化。
10. 在 ECT 植入之前，使用消毒的细钳将 ECT 从装载柱中轻轻取出。
    注:从模具中去除后的最终 ECT 尺寸小于原始模具。2.1 厘米 x 2.05 厘米模具可产生约 1.5 厘米 x 1.5 厘米的释放 ECT。较大的 3.9 厘米 x 4.05 厘米模具可生成约 3 厘米 x 3 厘米的 ECT。卸载ECT在温暖的文化媒介中表现出内在的自发跳动。尽管它最初维护网格结构，但卸载的 ECT 会随着时间的推移而收缩和凝结。有可能用细钳轻轻地握住组织，然后用 7-0 丝缝合将 ECT 连接到史诗上。

结果

图1A，B 显示了CM+EC和MC协议的示意图。从CM+EC协议和MC从MC协议诱导CM和EC后，细胞混合调整最终MC浓度，以代表10-20%的总细胞。2 厘米宽的组织模具是根据 0.5 mm 厚 PDMS 板材（图2A，B） 的设计图纸制造的。600万个CM+EC+MC细胞与胶原蛋白一结合，并用基质和马球407预涂的组织模具（图2C）在初步实验中，我们制?...

讨论

在完成对线性格式（hiPSC衍生的ECT^5）的调查后，我们调整了协议，将hiPSC衍生的CMs、EC和MC混合在一起，以促进ETC内血管细胞的体外扩张，以及ECT和接受者心肌之间随后的体内血管耦合。

为了促进更大、可植入的网格 ECT 几何的生成，我们使用薄的 PDMS 表设计 3D 模具，加载柱排列在交错位置。在初步实验中，我们注意到ETS在凝胶压实过程中粘附在PDMS柱上，因?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	761036
Reagents
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinant (10µg)	R&D	RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail	Sigma	C3867
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356231
Human VEGF (165) IS, premium grade	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)	Molecular Probes	P-6866
Recombinant human bFGF	WAKO	060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg)	R&D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg)	R&D	5036-WN
Versene solution	Gibco	15040066
Culture medium and supplements
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Ethanol	SIGMA	M6250
B27 supplement minus insulin	Gibco	A1895601
DMEM, high glucose	Gibco	11965084
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
L-Glutamine	Gibco	25030081
NaHCO3	Any
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medium	Gibco	21870092
αMEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solution	BD	340345
BD FACSFlow Sheath Fluid	BD	342003
BD FACSRinse Solution	BD	340346
EDTA	Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500)	Corning	352235
Fetal Bovine Serum (500ml)	Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Molecular Probes	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponin	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit	Molecular Probes	Z25002