创伤性出血挫伤和神经炎症的临床前受控皮质影响模型

摘要

脑实质内出血和伴有脑挫伤的神经炎症可引发严重的继发性脑损伤。该协议详细介绍了小鼠控制的皮质影响 （CCI） 模型，允许研究人员研究出血、挫伤和创伤后免疫反应并探索潜在的治疗方法。

摘要

脑挫伤是一种严重的医学问题，每年影响全球数百万人。迫切需要了解病理生理机制并为这种毁灭性的神经系统疾病制定有效的治疗策略。由初始物理撞击诱导的实质内出血和创伤后炎症反应可加重小胶质细胞/巨噬细胞活化和神经炎症，从而使脑病理恶化。我们在这里提供了一种受控皮质冲击 （CCI） 方案，该方案可以通过使用气动撞击器系统将具有可控幅度和速度的机械力传递到硬脑膜表面来重现小鼠的实验性皮质挫伤。这种临床前模型允许研究人员在小鼠中诱导中度重度局灶性脑挫伤，并研究广泛的创伤后病理进展，包括出血挫伤、小胶质细胞/巨噬细胞活化、铁毒性、轴突损伤，以及短期和长期的神经行为缺陷。本方案可用于探索脑挫伤的长期影响和潜在干预措施。

引言

脑挫伤是一种创伤性脑损伤，在现代社会最致命的健康问题中名列前茅¹。它主要是由意外事件引起的，例如交通事故，导致外力向头部施加机械能。创伤性脑损伤影响了大约 350 万人，占美国每年所有急性损伤相关死亡人数的 30%²。脑挫伤幸存下来的患者通常会遭受长期后果，包括局灶性运动无力、感觉功能障碍和精神疾病¹。

脑挫伤的原发性损伤是由包括拉伸力和撕裂力在内的机械因素诱导的，导致实质结构立即变形和局灶性 CNS 细胞死亡³。出血挫伤是头部外伤部位血管撕裂引起的脑出血的总称⁴。具体来说，脑实质内出血发生在脑挫伤后立即导致延迟血肿形成。在血肿内，从裂解的红细胞中释放的血红蛋白和游离铁会进一步引发与血液相关的毒性 ^5,6，^从而导致脑疝、脑水肿和颅内压升高 ^5,6。神经元（轴突）、神经胶质细胞、血管和支持组织的协作功能也受到血肿占位效应的影响⁷。此外，持续性和弥漫性神经炎症伴进行性神经变性持续数月，并导致大脑继发性损伤⁸。

小胶质细胞活化是脑挫伤的许多重要病理特征之一 ^9,10。在感应到损伤相关分子模式 （DAMP） 和受伤组织中的渗血后，激活的小胶质细胞会触发神经炎症，从而进一步加剧继发性脑损伤¹¹。此外，小胶质细胞释放的趋化因子促进外周免疫细胞浸润到创伤区域，导致活性氧和促炎细胞因子的产生。这创造了一个自我延续的促炎环境，从而引发进行性脑损伤 ^9,12。同时，具有替代激活表型的小胶质细胞可以通过清除受伤组织中的碎片来促进组织稳态恢复和大脑修复¹³。通过减少有害的小胶质细胞免疫反应来预防继发性神经炎症已被证明对促进脑挫伤的大脑恢复特别有用 3,9,10,12。

已经开发了几种用于研究创伤性脑损伤的临床前模型，包括体重下降模型、侧侧液体叩击损伤和爆炸波模型^14,15。然而，这些模型各有其弱点，包括手术过程中的死亡率高、组织学结果的可重复性低以及实验室之间人为损伤的高可变性^16,17。相比之下，受控皮质影响 （CCI） 模型更适合研究局灶性脑挫伤，因为它具有精确的控制和高重现性 14,15,18,19。

此外，通过纵生物力学变形参数，例如冲击速度和深度，可以控制诱发损伤的严重程度以产生广泛的损伤幅度，从而使研究人员能够模拟患者经常看到的不同程度的损伤¹⁷。CCI 的临床前模型于 1896 年首次开发²⁰。从那时起，CCI 一直是最广泛的适用模型，可用于灵长类动物²¹、猪²²、绵羊²³、大鼠²⁴ 和小鼠²⁵。这些特征共同使 CCI 成为最合适的实验性脑挫伤模型之一²⁶。

我们的实验室使用市售的气动 CCI 冲击系统和经过测试的生物力学变形参数来产生中度严重的局灶性脑挫伤，该挫伤使初级感觉和运动皮层区域区域区域化，而不会损坏海马体^27,28。我们和其他人证明，这种 CCI 程序可用于研究人类脑挫伤的临床特征，包括脑组织丢失、神经元损伤、脑实质内出血、神经炎症和感觉运动缺陷 24,25,27,28,29,30.在这里，我们详细介绍了执行小鼠 CCI 的标准方案，该方案允许人们询问有关 CCI 诱导的髓鞘丢失、铁沉积、CNS 炎症、出血毒性以及小胶质细胞/巨噬细胞在局灶性脑挫伤后的反应的问题。

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研究方案

本协议中描述的所有程序均在正新综合医院和国立台湾大学医学院的机构动物护理和使用委员会的批准下进行。该方案使用 8 至 10 周龄雄性 C57BL/6 野生型小鼠。

1. 麻醉诱导

1. 在连接到异氟醚蒸发器的感应室中，用 ~4% 异氟醚与室内空气混合，以 ~0.2 L/min 的速度麻醉小鼠。
2. 确保呼吸模式顺畅。通过确认动物缺乏脚趾捏反射来检查麻醉深度。

2. 术前准备

1. 用电动剪刀沿尾部到喙部方向剃掉鼠标头。不要修剪鼠标胡须。
   注意:胡须丢失可能会影响后续行为测试结果的准确性。
2. 将鼠标放在立体定位框架上。小心地将耳杆插入耳道。确保鼠标头部由两个耳杆相等地稳定。
3. 带入鼻锥并在手术期间保持 1% - 2% 异氟醚的麻醉。
4. 在双眼涂抹眼药膏，以防止手术过程中干燥。将动物放在加热垫上，以保持 37 °C 的体温。
5. 用 betadine 消毒剃光的头，然后使用无菌棉签用 70% 的酒精消毒。重复 3 次。

3. CCI 手术

1. 在切口前使用 100 G 胰岛素针皮下注射 0.25 μL 布比卡因 （31%）。轻轻按摩注射部位以更好地吸收。
   注意:这种局部麻醉剂直接在手术部位缓解疼痛。
2. 用手术刀或剪刀沿着头皮的中线做一个纵向切口（~1.5 厘米）。使用止血钳将皮肤固定在右侧，让暴露的颅骨干燥 1 分钟。使用无菌棉签清除颅骨上残留的血液和组织。
3. 检查鼠标头在水平面上是否水平。
   1. 确定解剖标志前囟和 Lambda，并用无菌手术记号笔/铅笔标记这两个位置。
   2. 确保动物的头部在喙尾方向水平。通过使用连接到立体定位框架的 31 G 胰岛素针测量 Pregma 和 Lambda 的 Z 坐标来做到这一点。
      注意: 如有必要，垂直调整耳杆。
   3. 按照相同的步骤进行动物头部的水平定位，检查中线的 Z 坐标以及中线左右两侧的两个相应位置，并根据需要调整耳杆。
      注意:动物头部的水平和稳定放置对于 CCI 模型的可重复性和可靠性至关重要。
4. 使用相同的 31 G 胰岛素针头确定开颅手术部位。将 XY 原点设置为 Pregma 并将指针横向向右移动 3 毫米。将此位置标记为开颅手术部位，并用无菌手术记号笔/铅笔在颅骨上画一个直径为 4 毫米的圆圈。
5. 使用带有环钻（直径 4 毫米）的高速微型钻头沿着铅笔轮廓的圆圈切割，以创建一个直径为 4 毫米的开孔。使用 20,000 rpm 的速度设置。避免施加过大的压力。
   注意:快速执行此步骤（通常在 30 秒到 1 分钟内）以防止对大脑造成任何热损伤。钻孔时施加过大的压力可能会导致意外穿透，从而可能压迫和伤害大脑表面。
6. 用镊子小心地去除骨瓣，并将其暂时储存在冰冷的生理盐水中。用生理盐水轻轻冲洗孔洞，然后用棉签尖端按压大脑表面以止血。
7. 将 CCI 设备上直径为 2.5 mm 的圆形撞击器尖端设置为 22.5° 的角度。将冲击尖端对硬脑膜表面归零。将控制箱上的冲击参数设置为 4 m/s 的速度和 2 mm 的变形深度。缩回金属尖端。
   注意:当尖端在全行程位置静态和轻微地压在硬脑膜表面时，将尖端归零可以提高零点的准确性和伤害程度的可重复性。
8. 释放活塞以对大脑产生撞击。将无菌棉签放在受伤部位止血。
9. 将骨瓣放回小鼠大脑并用牙科水泥固定。用纸巾粘合剂（例如 3M Vetbond）闭合头皮。

4. 术后恢复

1. 将鼠标放在加热灯下的干净恢复笼中，并铺上垫料，直到完全恢复。
2. 手术后连续两天提供湿润的食物并皮下注射酮洛芬 （5 mg/kg）。
3. 执行上述程序，但假对照动物的步骤 3.7 和 3.8 除外。

5. 小鼠安乐死

1. 在研究当天通过异氟醚过量对小鼠实施安乐死，然后斩首。
   注意:在样品采集之前，可以使用几种策略对实验动物实施安乐死。
2. 收集脑样本进行组织学分析。

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结果

立体定向放置和开颅手术的插图。

CCI 模型以其在产生从轻度到重度的损伤方面的稳定性和可重复性而闻名¹⁸.适当的立体定向技术和开颅手术是产生稳定且可重复的 CCI 诱导的脑损伤的主要决定因素（图 1A、B）。理想的开颅手术将在假手术的大脑中造成最小的组织学损伤^27...

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讨论

CCI 协议对大脑产生高度可重复的机械损伤，用于脑挫伤研究。以下步骤对于使用此 CCI 协议在动物中产生一致的脑损伤至关重要。

首先，鼠标头应稳定安装在立体定位框架上，并且解剖标志前囟和 Lambda 始终位于同一水平面上。头部放置不稳定或不水平通常会导致动物之间的受伤程度不同。为确保动物头部得到安全固定，请使用一对镊子轻轻横向轻?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4mm Short Trephine Drill	Salvin Dental Specialties, Inc.	TREPH-SHORT-4
anti-Iba1 antibody	Wako chemicals	#019-19741
anti-Ly76 antibody	abcam	ab91113
carboxylate cement	3M	70201136010
cortical contusion injury impactor	Custom Design & Fabrication, Inc.	S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3	CCI device (S/N 49-2004-C, eCCI Model 6.3)
cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042
DAB staining kit	Vector	SK-4105
goat anti-rabbit IgG secondary antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034
goat anti-rat IgG secondary antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11007
Mayer's Hematoxylin	ScyTek	HMM500
tweezers	fine science tools	11252-20 NO. 5
isoflurane	Panion & BF Biotech Inc.
Bupivacaine 0.25%	Hospira
lithium carbonate	Sigma-Aldrich	62470
steriotexic frame	stoelting
scissors	fine science tools	14068-12
solvent blue 38	Sigma-Aldrich	S3382