非肝细胞293T-NE-3NRS细胞中乙型肝炎病毒感染的建模

摘要

本手稿描述了新型工程293T细胞（293T-NE-3NRS，表达人类NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+）和传统肝细胞（HepG2-NE，表达人类NTCP）中乙型肝炎病毒（HBV）感染的详细方案。

摘要

HBV主要感染人类肝细胞，但也被发现感染肾外组织，如肾脏和睾丸。尽管如此，基于细胞的HBV模型仅限于肝瘤细胞系（如 HepG2 和 Huh7）过度表达功能性HBV受体，钠陶罗胆酸盐共同运输多肽（NTCP）。在这里，我们使用293T-NE-3NR（293T过度表达人类NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+）和 HepG2-NE（HepG2 过行NTCP）作为模型细胞系。  这些细胞系中的HBV感染是通过使用来自 HepG2.2.15 的浓缩 HBV 病毒颗粒或与目标细胞系共同培养 HepG2.2.15 进行的。为HBcAg执行HBcAg免疫荧光以确认HBV感染。这里介绍的两种方法将有助于我们研究非肝细胞系的HBV感染。

引言

乙型肝炎影响20多亿人的生命，是公共卫生面临的主要威胁之一。全世界约有2.57亿人长期感染乙型肝炎病毒（HBV），给社会^{带来沉重负担}。肝细胞不是受HBV感染的唯一细胞，非肝组织中的其他细胞，如肾脏和睾丸，也感染了这种病毒^2,2，3。目前，HBV感染细胞模型仅限于人类肝细胞，只有很少的非肝细胞系模型。这妨碍了对乙肝病毒感染和非肝组织乙肝病毒相关病理学的研究。在这里，我们提出了在非肝293T细胞以及基于肝瘤的细胞中研究HBV感染的协议。

陶罗胆酸钠与多肽（NTCP）是人体乙型肝炎和D型肝炎病毒^{4的功能受体}。肝细胞核因子4°（HNF4°）、视网膜X受体+（RXR+）和过氧化物增殖剂活化受体（PPAR+）是限制HBV病毒性转录因子的肝状转录因子。它们已被验证，以促进HBV基因组RNA合成，并支持HBV复制在非肝瘤细胞系^5。我们构建了三种不同的细胞系，表示NTCP（HepG2-NE）的 HepG2细胞系，表达NTCP（293T-NE）的293T细胞系和表达四个宿主基因的293T细胞系;NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+（293T-NE-3NR）。基于293T-NE-3NRs开发了两种乙肝病毒感染方法（图1）。第一种方法使用接种293T-NE-3NR高病毒基因组等效性（高GEq（150），DMSO和PEG8000）24小时。第二种方法采用与 HepG2.2.15 共同培养 293T-NE-3NR 的方法，它可以产生 HBV 粒子（低 GEq（约 1.83），无需 DMSO 和 PEG8000），从而密切模拟自然条件。

HepG2.2.15细胞来自 HepG2 线和慢性分泌传染性 HBV，以及亚病毒颗粒进入培养^{基 6，7,7}。Cyclosporin A （CsA） 是一种免疫抑制剂，临床上用于抑制异种移植排斥。研究表明，CSA通过抑制NTCP的运输机活性，阻断NTCP与大包络蛋白8的结合，抑制HBV进入培养的^肝细胞。

HepG2-NE细胞用作阳性对照，而CsA处理细胞用作阴性对照。通过与阳性和阴性对照组进行比较，我们可以找出哪些宿主基因在HBV感染中起着关键作用。此外，通过这种乙肝病毒感染模式，我们还可以找到其他与乙肝病毒感染相关的新机制或宿主基因。

研究方案

根据国家的生物安全指南，应在生物安全II（P2）或生物安全III（P3）实验室进行从 HepG2.2.15 细胞和 HBV 感染中采集超级纳的培养。应遵循实验室安全做法，以确保实验室人员的安全，在进行HBV实验之前，应接种所有疫苗并检测出HBsAbb阳性。在继续下一步之前，观察每个步骤的单元格状态。根据汕头大学医学院审查委员会的批准，使用人体血清样本。

1. HepG2.2.15 细胞培养

注:HepG2.2.15细胞上流液，HepG2.2.15细胞上流液，以及所有与 HepG2.2.15 接触的尖端物、烧瓶、板和管，在浸泡在 2% 的维苏化剂中过夜后应予以处置。

1. 从液氮中去除含有 HepG2.2.15 细胞的小瓶，并在 37 °C 水浴中轻轻旋转小瓶解冻。
   注:为了减少污染的可能性，请将盖子远离水。解冻应快速（约 2 分钟）。
2. 当细胞解冻后，立即将小瓶从水浴中取出，用70%乙醇进行消毒。
   注:从这一点执行所有步骤在严格的无菌条件下。
3. 将细胞转移到25厘米²组织培养瓶中，加入4 mL的完整培养基（含有10%FBS、青霉素100 U/mL、链霉素0.1毫克/mL）的DMEM。在37°C的加湿培养箱中用5%CO2孵_育细胞。

2. HepG2.2.15 细胞培养上超常的集合

1. T25烧瓶中的培养物 HepG2.2.15 细胞在 37 °C 下，在加湿培养箱_{中培养 5%} CO_2。每 3 天更换一次介质。
2. 将细胞上一提液收集在 50 mL 离心管中。用石蜡薄膜牢牢合上盖子并包裹起来。
3. 将 HepG2.2.15 上流液储存在 -20 °C，以保持 HBV 病毒活性。

3. 集中 HepG2.2.15 上一液

1. 从-20°C中去除 HepG2.2.15 上因，并在 4 °C 下解冻。
2. 要去除细胞碎片，请用0.45μm膜过滤 HepG2.2.15 上清液，过滤到新的 50 mL 离心管中。首先，在过滤病毒之前，先用10%FBS过滤10mL的DMEM，然后过滤细胞培养物。
3. 将 14 mL 过滤的上一位液添加到病毒集中器柱中，然后合上盖子。在水平旋转离心机中，以 3，200 x g的离心柱离心 35 分钟。将 HepG2 . 2 . 15 上大（约 200 μL）收集到 1 . 5 mL 管中。
4. 加入 200 μL 的 DMEM，用 DMEM 清洗一次柱，然后收集到 1.5 mL 管中。

4 . 在上流中检测 HBVDNA

1. 打开干块加热器，将温度设置为 100°C。
2. 为确保 HepG2.2.15 上流液浓缩物中的 HBV DNA 浓度在标准曲线范围内，在 1.5 mL 微离心管中将 10 μL 的 HepG2.2.15 上流液浓缩物添加到 190 μL 的 DMEM 中，稀释浓缩物 20 倍。加入200μL的 HepG2.2.15 上流液，阴性对照（来自健康供体中的 HBV 阴性血清），HBV阳性对照（HBV患者对 HBV 阳性血清）和试剂盒中提供的四种定量参考的稀释（2.2. 0 x 10⁶、 2.0 x 10⁵、 2.0 x 10⁴、 2.0 x 10³ GEq /mL），分别分离 1.5 mL 微离心管。
3. 将 450 μL 的 HBV DNA 提取缓冲液从试剂盒添加到上述 8 个 1.5 mL 管中，旋转 15 s，在 100°C 下在干块加热器中孵育 10 分钟。在室温下以12，000 x g离心5分钟。
4. 将 27 μL 的 PCR 主混合物和 3 μL 的 Taq 聚合酶添加到放在冰上的 PCR 管中。
   注:套件中提供的 PCR 主混合物包含针对 HBV DNA 保存区域的底注。
5. 将 20 μL 离心上清液加入放在冰上的 PCR 管中。盖紧，旋转10 s。
6. 在实时 PCR 机器上使用以下条件:93 °C 2 分钟，10 个周期 93 °C 45 s，55 °C 60 秒;然后30个周期的93°C为30 s，然后55°C为45 s进行实时PCR。
   注:商用套件中提供的主混合物具有针对 HBV DNA 保存区域的底注。
7. 导出获得的 Ct 值并生成标准曲线，如表 1 和图2 所示。
8. 根据标准曲线，计算 HepG2 . 2 . 15 中稀释 20 倍的 HBV DNA 浓度，如表2 所示。计算 HepG2.2.15 上流液精的 HBV DNA 浓度 （表 2）.
9. 将 HepG2 . 2 . 15 上大分在等分中，储存在 - 80 °C，直到使用。

5. HepG2-NE和293T-NE-3NRs细胞的体外感染

1. 在DMEM/F-12中准备以下感染媒介:10%FBS， 4 mM谷氨酰胺补充剂，0.1 mM NEAA，1 mM丙酮钠，100 U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，1微克/mL纯霉素，40纳克/mL脱沙松，20μg/mL氢皮质松和5μg/mL胰岛素。储存在4°C。
   注:这些NTCP阳性细胞具有抗纯霉^素9。
2. 将0.1%明胶加入5口48孔板，每口井200μL。在37°C下孵育板2小时，丢弃上一液。在37°C下孵育板2小时。
3. 种子 HepG2-NE 密度为 1 x 10⁴细胞，每个孔为 2 个孔。种子293T-NE-3NRs细胞密度为1×10⁴细胞，每个孔（全转视网膜酸在1μmol/L和氯纤维酸在1 mmol/L最终浓度添加到介质中，以激活RXR+和PAR®核激素受体，分别）。种子293T-NE在1井的密度为1×10⁴细胞。
   注:使用0.25%的三辛在亚汇合通过细胞。计算细胞数，然后将细胞种子设定为适当的密度。
4. 在37°C下孵育细胞，在加湿培养箱_中孵育5%CO222小时。观察细胞24小时后，如果细胞健康，则继续感染。
5. 准备表3中提到的感染复合物，添加HBV（HepG2.2.15上流液）、DMSO、PEG8000和感染介质至1.5 mL微离心管。通过将 CSSO 中溶解到 5 mM，并使库存保持 -20 oC，准备 CSA 库存。CsA 的工作解决方案为 5 μM。种子 1×10⁴细胞每井 48 井板。加入100μL的 HepG2.2.15 上流液浓缩物（含有 HBV 1.5063 ±10⁷ GEq/mL），在 150 GEq/细胞下感染细胞。
6. 将500μL的感染复合物添加到每个井中，在37°C下孵育细胞，在加湿培养箱_中孵育5%CO 2，24小时。
7. 在更换介质之前，用500μL的PBS清洗细胞两次。在每个井中加入1 mL的介质。如果单元格状态较差，并且某些单元格是浮动的，则直接更改介质。这是感染的第一天。每2天轻轻更换一次介质。
8. 第11天，用500μL的PBS清洗细胞两次，用冰冷甲醇修复细胞，进行免疫荧光。

6. HepG2.2.15 与 Hepg2-NE / 293T-NE-3nrs / 293T-NE 共同培养

1. 在 6 个井板的 5 口井中加入 1 mL/0.1% 明胶。在37°C下孵育板2小时，然后丢弃上一液。在37°C下再次孵育板2小时，使井完全干燥。
2. 种子 1 x 10⁵细胞/井的 HepG-NE 成 2 孔，293T-NE-3NRs 到 2 孔，293T-NE 到 1 孔的板。种子 1 x 10⁵细胞/孔 HepG2.2.15 到五个膜插入 （24 毫米， 0.4 μm 孔径， 未涂层） 在一个单独的 6 孔板。在37°C下孵育细胞，在加湿培养箱中_孵育5%CO22，24小时。
3. 24小时后，如果细胞都粘附且状态良好，则为共培养做好准备。丢弃6孔板和细胞膜插入中的介质。将带 HepG2.2.15 的膜插入物放入 6 孔板中，用 HepG-NE、293T-NE-3NRs 和 293T-NE 用钳子播种。在37°C下孵育细胞，在加湿培养箱中_{孵育5%CO2，}每3-4天更换一次培养基。
   注:将组设置为如下:井 1:293T-NE 与 HepG 2.2.15 共同培养;井 2: HepG2-NE 与 HepG 2.2.15 共同培养;井 3: 293T - ne - 3nr 与 Hepg2.2.15 共同培养;好 4: Hepg2 - ne 与 Hepg 2.2.15 （添加 Csa） 共同培养;好 5: 293T - NE - 3nrs 与 Hepg2.2.15 共同培养 （添加 Csa）;将完整的介质添加到井号 1、2 和 3，将带 5 μM CsA 的介质添加到井号 4 和 5 井，每个井约 9 mL，确保介质接触，使病毒颗粒从转流井迁移至感染细胞。
4. 10天后，取出膜插入物，将PBS加入6孔板，轻轻清洗两次，用冰冰甲醇固定细胞进行免疫荧光。

7. 为HBcAg执行免疫荧光

1. 在-20°C下用冰冰甲醇固定细胞超过3小时，丢弃甲醇。在摇床的室温下用 PBS 清洗细胞 10 分钟，重复 3 次。
2. 加入 5% BSA（100 μL/48 井板、500 μL/6 井板），在 40 rpm 和室温下在水平摇床上摇动 1 小时。
3. 加入HBcAg原抗体溶液（原抗体:5%BSA溶液±1:200，100μL/48井板，500μL/6井板），在4°C下过夜。
4. 用 PBST（PBS，补间 20）洗井，在摇床室温下洗涤 10 分钟，重复 3 次。
5. 加入第二个抗体溶液（594标记抗体在山羊对兔子IgG:PBS = 1:1，000，100μL/48井板，500μL/6-井板，用铝箔覆盖板，并在室温下摇动2小时。
6. 用 PBST 再次清洗三次，每次摇动 10 分钟。
7. 加入1μg/mL DAPI，摇动2分钟，用PBST在摇床上清洗两次，每次5分钟。丢弃 PBST。添加PBS并在免疫荧光显微镜下观察。

结果

我们构建了pSIN-NTCP-EGFP质粒表达NTCP和EGFP融合，具有霉素耐药性。质粒被转染到 HepG2 和 293T 细胞中，以构建稳定的细胞系 HepG2-NE 和 293T-NE 表达 NTCP 和 EGFP。具有普洛霉素耐药性和表达的质粒（pSIN-HNF4+，pSIN-RXR+，pLV-PPAR®-puro-flag）被转染成293T-NE细胞，以构建一个稳定的细胞系，表达4个宿主基因⁹。NTCP-EGFP的表达可以通过绿色荧光来观察，并经qPCR和西印验证（数据未显示，但见上一?...

讨论

在这里，我们介绍非肝293T-NE-3NR和基于肝瘤的HpG2-NE细胞的HBV感染方案。293T-NE-3NR 适用于高低 GEq 的 HBV 感染。在使用我们的协议时，需要考虑以下关键步骤。细胞状态是成功感染的重要因素。在HBV感染的初始阶段后，必须及时改变感染媒介。293T-NE-3NRs细胞在感染高病毒滴答声后通常很脆弱。因此，这些细胞必须轻轻清洗，以避免在感染24小时后分离细胞。在使用膜插入物进行培养时，我们必须确保?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45μm membrane filter	Millex-HV	SLHU033RB	Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate	BIOFIL	TCP010006	For co-culture
Amicon Ultra 15 ml	Millipore	UFC910008	For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA	Beyotime	ST023	For immunofluorescence assay
Cyclosporin A	Sangon biotech	59865-13-3	inhibitor of HBV infection
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)	DAAN GENE	7265-2013	For HBV DNA detection
DMEM	HyClong	SH30243.01	For culture medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS)	CLARK Bioscience	FB25015	For culture medium
Fluorescence microscope	ZEISS	Axio observer Z1	For immunofluorescence assay
HepG2-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
HBcAg antibody	ZSGB-BIO	ZA-0121	For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS	ZSGB-BIO	ZLI-9062	For cell wash
PEG8000	Merck	P8260	For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Thermo Fisher	10378016	For culture medium
Transwell	CORNING	3412	For co-culture
Tween 20	sigma-Aldrich	WXBB7485V	For PBST
Virkon	Douban	6971728840012	Viruside