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摘要

该协议描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于神经-胶质-血管结构、相互作用和功能在健康和患病条件下的纵向成像。它是颅内成像方法的补充替代品，虽然通常倾向于，但具有一些关键限制。

摘要

中枢神经系统（CNS）由神经元、胶质细胞、频闪细胞和血管细胞的复杂相互作用调节，促进其正常功能。虽然在体外或体外一起单独研究这些细胞提供了有用的生理信息;在这样的语境中，神经细胞生理学的显著特征将会被遗漏。因此，有必要研究神经细胞在原生体内环境。此处详述的协议描述了啮齿动物皮层中神经细胞的重复体内双光子成像，作为在从数小时到数月的较长时间段内可视化和研究特定细胞的工具。我们详细描述使用严重稳定的脑血管作为粗糙的地图或荧光标记的树突作为特定大脑区域感兴趣的精细地图。使用这些映射作为视觉键，我们展示神经细胞如何精确重新定位，以便随后进行重复的体内成像。使用荧光标记微胶质、神经元和NG2+ 细胞的体内成像示例，该协议演示了该技术在较长时间段内允许在同一大脑位置重复可视化细胞动力学的能力，这进一步有助于理解这些细胞在正常生理学或病理侮辱中的结构和功能反应。必要时，此方法可与神经细胞的功能成像相结合，例如，与钙成像相结合。当基因小鼠模型或具有不同荧光标签的特定染料可用于标记感兴趣的细胞时，这种方法尤其具有一种强大的技术，用于可视化体内不同细胞类型中 CNS 的物理相互作用。

引言

中枢神经系统（CNS）受各种居民细胞类型（包括神经元、胶质细胞和血管相关细胞）之间相互作用的复杂相互作用的支配。传统上，神经细胞研究在分离，共培养1,21，2，3，4，5（体外）或切除脑组织（体外,3,4,5）6，7，8，9，10个上下文。6,7,8,9,10然而，需要进一步了解神经细胞行为和相互作用在原生环境中的完整的大脑体内。在此协议中，我们描述了一种在体内绘制感兴趣区域并在未来成像会话中精确重新成像这些区域的方法，以跟踪各种 CNS 细胞类型之间长时间的复杂相互作用。

体内成像方法的发展为正确理解神经,功能,11、12、13、14、15,1213,14提供了显著收益。具体来说，与传统的体外和体外方法相比，这些方法具有若干优势。首先，体内成像系统具有生理相关的细胞和组织成分，如血管与细胞相互作用的完整剧目，以提供神经网络生理学的全面了解。其次，最近的发现表明，当从原生环境中去除时，某些神经细胞（如微胶质）会失去其特性的重要特征，因此生理特性16，17,17可以保留在体内环境中。第三，体内成像系统为数周至数月的稳定纵向调查提供了研究CNS细胞相互作用的机会。最后，鉴于越来越多的证据表明来自周围免疫系统18、19和19中枢神经系统生理学中的微生物群20、21,21的贡献，体内系统提供了一个平台来询问这些贡献和对CNS细胞的影响。因此，使用纵向体内成像来研究健康、受伤和患病状态的神经免疫生理学和相互作用的方法是传统方法的一大补充。

在这个协议中，我们描述了一种可靠的方法，以图像大脑中不同的细胞类型，包括微胶质，神经元和NG2+细胞为例。开发了两种在体内可视化神经细胞的方法:瘦头骨方法和颅窗法的开放头骨。虽然瘦身的头骨方法正在使用，是首选，因为他们克服了开放性头骨方法的一些缺点，如胶质细胞活化，高于生理的脊椎动力学和使用抗炎剂22，23，24，25，瘦化头骨方法也显示了一些关键缺点。22,23,24,25首先，变薄过程是一个非常微妙的程序，许多研究人员发现很难完善，尤其是当重新变薄是必要的。这种情况之所以如此，是因为实验者往往很难确定他们把头骨稀释到±20μm的深度。其次，为了在小鼠之间进行适当的比较，变薄需要是相同的，成像会话或小鼠之间的各种变薄成功可能会使神经结构的可视化复杂化。第三，当用于纵向成像时，头骨变薄的动物只能在头骨重新变薄时用于数量有限的会话。第四，由于一些骨组织仍然存在，成像深度的清晰度可能会从薄的头骨方法中受损，从而能够对更肤浅但更深的区域进行出色的可视化。有鉴于此，更深的大脑结构，如海马，不能成功地用薄头骨的方法成像。这些考虑提出了需要采取替代和补充办法，以克服这些关切。

除了薄头骨方法外，开放的头骨窗口植入方法使用用光学透明玻璃盖玻片替换头骨的程序。这允许几乎无限数量的成像会话。此外，鉴于用玻璃盖玻片替换头骨，这种方法允许在数小时到数月的长时间内对荧光标记脑细胞进行清晰的观察，因此，可用于研究与生理学、衰老和病理学相关的细胞活动和相互作用。

总的来说，我们详细介绍了通过立体轴颅切除术植入慢性颅骨窗口的步骤，这种颅骨切除术使感兴趣的大脑区域在体内成像。我们还描述了如何利用严重稳定的脑血管或荧光标记的树突分别生成感兴趣的大脑区域的粗糙或精细图。然后，此方法可用于多个会话的重复映像。因此，这种技术的重要性在于它能够成像大脑元素的长期变化或停滞，包括不同细胞类型的排列、形态和相互作用。

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研究方案

所有步骤都符合弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会制定和批准的准则。

1. 小鼠为颅窗植入做准备

注:各种带荧光标签的转基因小鼠线适合成像。

  1. 使用 CX3CR1GFP/+小鼠26在体内可视化微胶质。通常，使用体重为17-25克的幼鼠至4至10周大小鼠。
    注:虽然这种方法甚至适合预奶小鼠，但需要让小鼠与母亲一起回到笼子里喂养，如果母亲在手术后对幼崽没有适当照顾，可能会使恢复变得复杂。因此，建议使用奶后奶。
  2. 在麻醉室中使用异氟兰化（5% 氧气流量，诱导 1 分钟）麻醉小鼠。检查鼠标是否对头趾和/或尾部捏合没有任何移动或抽搐反应。将鼠标从室内拿出，在露天使用修剪器彻底剃光耳朵之间耳朵之间的头部头发，从眼睛水平到颈部顶部。
    注:所用异氟的浓度取决于感应室的大小。因此，对于较小的腔室，3-4%的异氟兰可用于有效诱导麻醉，而较大的腔室将需要高达5%。
  3. 将鼠标移到立体定向手术站鼻锥进行麻醉（手术维护为1.5-2%），使用耳杆稳定头部，并在加热垫上保持鼠标保持体温温暖。
  4. 用眼软膏润滑两只眼睛。注射100 μL的0.25%的布皮维卡因（为小鼠提供局部镇痛，将持续8-12小时）和100μL的4毫克/mL德沙米松（以减少手术过程中可能导致的炎症）在切口部位皮下。在移动到下一步之前，让鼠标至少坐 5 分钟。
  5. 用三个交替的贝塔丁拭子和 70% 的酒精清洁剃光头。使用手术刀片或剪刀从耳朵之间的头骨区域后面延伸到眼睛之间的前部区域，进行中线头皮切口。剩下的皮肤被切割，以暴露头骨。
  6. 用3%过氧化氢（H 2 O2）清洁头皮和下颅之间的结缔组织2，并定位大脑区域，用立体定向坐标进行成像。
    注:头骨表面的切口经常有一些出血（步骤1.5）。这种出血通常在3-5分钟内自行解决。先前的布普瓦卡因治疗（步骤1.4）也注意到，以限制在此期间的出血量。

2. 小鼠颅窗植入手术

  1. 使用牙科钻头（0.7 mm 尖端直径）将圆形开口 ±4 mm 钻入头骨中，并使用尖钳小心地取出头骨的这一部分。对于6-8周大小鼠的躯体感觉皮层成像，将颅骨切除术中心定位为-2.5后侧和+2.0侧向胸腺。在钻探过程中，定期用无菌盐水和棉签润湿头骨，以冷却大脑，清除骨骼碎片并软化头骨，最终去除头骨。
    注:颅骨切除术的坐标会因感兴趣区域和小鼠的年龄而异。
  2. 取出头骨后，小心地将小盖玻璃（尺寸#0厚度为 0.1 ± 0.02 mm）在颅骨切除术中用盐水润湿。使用无菌抹布擦干多余的盐水。
  3. 使用尖施器（如移液器尖端或破木棉签棒的尖端），在窗户周围涂抹氰酸酯胶水，并允许其附着在大脑和头骨上。将底胶涂抹在头骨的其余部分上，用固化灯固化20-40 s。用最后的胶水在窗户周围准备一个井，用固化灯固化20-40 s。
  4. 将一个小头板粘在颅骨切除术的反向半球的头骨上，首先用底面胶水作为底面，然后用最后一块胶水。用固化灯固化，每个固化灯为 20-40 s。
    注:如果头骨在此过程期间完全被胶水覆盖，不需要缝合。

3. 手术后护理

  1. 允许鼠标在没有麻醉的情况下醒来（在加热垫上完成恢复可缩短恢复时间），并在完全清醒后将其返回到其家庭笼中。注射一种皮下剂量的丁丙诺啡SR（0.5毫克/千克）作为术后镇痛，足以72小时。
  2. 为了促进手术的健康恢复，为小鼠提供额外的软食物，可以在水中以常规固体周的形式软化咀嚼或凝胶形式的食物。
    注:手术后立即提供一次软食物就足够了。
  3. 每天监测小鼠的健康和适当的恢复，在手术前72小时。之后，从窗口植入手术开始，从2周开始进行成像。
    注:如果做得好，小鼠恢复良好，表现出正常的流动行为，足够的笼探索，良好的水化，稳定的体重增加和广泛互动与其他小鼠在笼子里和在笼子里的其他项目。手术后显示嗜睡、脱水和超过10%体重减轻的小鼠被安乐死，并从研究中去除。

4. 初始成像的双光子脑图

  1. 麻醉鼠标（异氟兰、5 % 感应和 1.5% 维护）。使用螺钉将头板安装在双光子显微镜舞台上，在 35°C 的加热板上保持。注射100μL的血管染料，如罗丹胺B（2毫克/mL）。
    注:成像也可以在清醒的小鼠中进行，无需麻醉。然而，最近的研究表明，麻醉影响微胶质监测动力学27，28，29,28和29头部固定两个光子成像在清醒小鼠增加压力，即使在慢性成像至少25天（见Juczewski等人，2020年）30。
  2. 使用用 70% 乙醇涂抹的棉签轻轻清洁颅窗表面。将几滴水或盐水放在颅窗上，将客观透镜放入溶液中，因为目标是浸入式透镜。
  3. 手拉粗糙的地图，以表示实验室笔记本中的主要血管地标，同时通过墓志铭浏览目镜。使用此图形可以标识两次光子成像期间的特定区域。或者，通过安装在显微镜上的相机或手持相机或手机拍摄血管的照片。
    注:这些手绘图像和图片是为了便于在两次光子成像之前在显微镜下重新访问相同的广泛区域。这些不是精确的图像映射。
  4. 在两次光子成像下，根据需要收集荧光细胞和血管的图像。用适当的坐标仔细记录，以确保可以重新访问精确区域，以便进行后续成像。在此初始成像会话中收集多个视场，例如，通过组织体积每 1-2 μm 获取 z-stack 图像。
    注:通过两个光子收集图像时，血管地标用于粗略映射。如果需要精细映射，则使用 Thy1-YFP31小鼠的 YFP 标记树突。
    1. 使用这些推荐的成像参数:波长为880-900 nm是最佳的;用于 GFP 和/或 dsRed / Rhodamine 激发，使用 565 nm 双色镜，带 525/50 nm（绿色通道）和 620/60 nm（红色通道）排放过滤器;对于 GFP 和 YFP 分离，使用 509 nm 双色镜，带 500/15 和 537/26 nm 发射滤波器;大脑的功率保持在25mW或以下;图像分辨率为 1024 x 1024 像素，在 1.5 倍变焦系数下以 25X 0.9 NA 目标拍摄的视场为 295.24 x 295.24 μm。
  5. 在成像结束时，将鼠标从舞台上带走，让其从麻醉中醒来，然后回到其家庭笼子，直到将来进行成像。

5. 双光子成像和再成像

  1. 对于以后的后续成像会议，可能是在初始成像会议后几个小时到几个月的任何地方，麻醉小鼠（Isoflurane，5%诱导和1.5%的维护），安装在双光子显微镜上，保持加热板，并重新注入100μl血管染料，如罗达明B（2毫克/mL）。
  2. 打开 ImageJ 中以前获得的图像，并使用这些图像以及上一个会话中的注释，识别以前的图像区域并仔细重新成像它们。
  3. 只要成像窗口清晰或对研究范围至关重要，就重复此数据。

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结果

为了在体内可视化微胶质动力学，使用了双转基因CX3CR1GFP/+:Thy1YFP小鼠。Thy1-YFP H 线与 Thy1-GFP M 线相比，以避免微胶质 （GFP） 和神经元 （YFP） 的荧光重叠。替代方法可以使用记者行，其中微胶质标记为 tdTomato，然后可以使用 Thy1-GFP M 线。H 线的缺点是 YFP 标记大量神经元，并且标签随着年龄的增长而增加（个人观察）。M 线显示神经元的稀疏标记。在窗口植入手术的2~4周之间，微?...

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讨论

体内双光子成像的出现为探索健康大脑中过多的细胞相互作用和动态提供了机会。初步研究的重点是使用开放颅骨切除术的方法，通过急性和慢性成像37，38图像神经元树突图像。这也可以用来阐明大脑中的神经免疫相互作用。该协议描述了一种短期或长期对荧光标记细胞（特别是微胶质，大脑的常驻免疫细胞）进行可靠成像的方法。使用染料标记的血?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢 Eyo 实验室的成员讨论本手稿中提出的想法。我们感谢弗吉尼亚大学基普尼斯实验室的贾斯汀·鲁斯滕霍芬博士为NG2DSRed小鼠33的礼物。这项工作得到了国家卫生研究所神经疾病和中风研究所的资助，为U.B.E（K22 NS104392）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Coverglass (3mm)Warner Instruments64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)Amazonhttps://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light SystemDental Health Products, Inc910860-1
Dental DrillOsada: www.osadausa.eduEXL-M40
Drill BitFine Science Tools#19008-07
Eye OintmentHenry Schien1338333
iBond Total Etch (Primer glue)Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)66040094
Rhodamine BMillipore Sigma81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue)Top Dent (Ivoclar Vivadent)#595956
Wahl Brav Mini+Amazonhttps://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

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