体外冲击波治疗后的外泌体分离

摘要

外泌体在体外施加冲击波时释放。在这里，我们描述了如何对培养的内皮细胞施加冲击波，然后分离外泌体以进行进一步研究。

摘要

冲击波疗法通常用于骨科适应症，包括肌腱病，如外上髁炎（网球肘）和跟腱炎（足跟骨刺）以及不愈合的伤口和骨骼。尽管病理学不同，但冲击波疗法的血管生成和抗炎作用相结合，可导致软组织和骨骼再生。在 30 多年的临床应用中，未观察到任何副作用。此外，基础研究甚至揭示了对缺血心肌的再生作用。

在以前的工作中，我们可以证明培养细胞的机械刺激通过外泌体释放转化为生物反应。然而，确切的机制仍有待阐明。在应用冲击波疗法时，机械耦合至关重要，因为即使是很小的气泡也可以吸收冲击波。前面描述的水浴方法是保证体外冲击波应用的充分和可重复的有效方法。

我们能够开发一种可行且可复制的方案，以在施加冲击波后从培养细胞中分离外泌体。因此，我们证明了研究机械转导的潜在机制以及冲击波释放的外泌体的再生和血管生成潜力的可能性。

引言

冲击波 （SW） 是在短时间内释放大量能量（例如，雷电）时出现在自然界中的声压波。在临床常规中，冲击波用于碎石术以分解肾结石，而 30 多年来没有相关的副作用 ^1,2。偶然发现，肾结石崩解后，在 X 光片中观察到髂骨增厚。这一观察结果为骨愈合障碍的研究提供了基础，并导致了长骨不愈合的治疗 ^3,4,5。

冲击波疗法的适应症得到了扩展，如今该方法已常规临床用于骨科适应症，包括肌腱病，如外上髁炎（网球肘）和跟腱炎（跟腱刺）^6,7。此外，基础研究表明冲击波疗法 （SWT） 具有很高的血管生成潜力。其中，一项研究表明，SWT 后血管生成⁸ 后血管生成生长因子，如 VEGF（血管内皮生长因子）、PIGF（胎盘生长因子）和 FGF（血管内皮生长因子）增加。

为了研究冲击波诱导的血管生成在其他病理中可能的有益作用，我们在缺血性心脏病的动物模型中应用了 SW 疗法 ^9,10。在证明缺血心肌的再生作用后，我们可以确定先天免疫受体 TLR 3（Toll 样受体 3）在冲击波疗法中不可或缺的作用^11,12。进一步的研究表明，SW 疗法的机械刺激通过外泌体释放转化为生物信号。与内皮细胞生理上释放的外泌体相比，SWT 释放的外泌体含有增加的血管生成 microRNA 货物。注射到缺血心肌中，SWT 释放外泌体诱导再生¹³。

由于空气会吸收 SW，因此涂抹器和细胞培养瓶之间的完美耦合至关重要。标准化水浴代表了在体外应用 SWT 的可行方法和可重复的实验设置。为了避免波的反射和干扰，楔形吸收器会破坏流向水浴背面的初级波。因此，我们建议仅使用所述水浴在体外施加冲击波。

在该方案中，我们描述了在体外应用冲击波以将血管生成外泌体释放到上清液中。该方案为研究外泌体在机械转导中的作用提供了可能性，并且是进一步研究 SWT 时外泌体释放的基础。

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研究方案

人脐静脉内皮细胞是从妇科剖宫产中获得的。因此，获得了患者的书面知情同意书。因斯布鲁克医科大学伦理委员会（No.UN4435）。

注意：在无菌层流罩下工作以避免污染。

1. 实验前 24 小时

1. 通过在 4 °C 和 120,000 x g 下超速离心胎牛血清 （FCS） 过夜来制备无外泌体的内皮生长培养基。
2. 使用 10% 明胶包被 75 cm² 细胞培养瓶。
3. 使用内皮生长培养基将人内皮细胞接种在细胞培养瓶中。
   实验日期：
   注：预热 4 L ddH₂O、不含外泌体的 FCS、内皮细胞生长基础培养基和 PBS 至 37 °C。

2. 准备冲击波疗法应用程序

1. 通过添加市售试剂盒（例如 Bullet 试剂盒）中的补充剂，并向内皮生长培养基中加入超速离心的游离外泌体 FCS 而不是普通 FCS，制备不含外泌体的内皮生长培养基。
2. 用大约 3.5 L 的 37 °C 预热 ddH₂O 填充水浴。
3. 将 SW 涂抹器连接到水浴。
4. 在 SW 设备上定义处理参数（能量通量密度、脉冲频率）。我们建议以 0.07 mJ/mm² 的能量通量密度和 5 Hz 的频率进行 500 次脉冲。

3. 冲击波应用

1. 通过显微镜使用 100 倍总放大倍率通过形态外观和内皮细胞的密度来检查细胞活力。使用具有高汇合度的培养瓶，仅用于增加外泌体的量。
2. 小心地用大约 250 mL 的 PBS 替换内皮细胞培养基，以完全填充培养瓶并抑制所有残留的空气。
3. 使用封口膜或密封盖密封培养瓶。
4. 将细胞培养瓶垂直放在水浴内，细胞覆盖面与 SW 设备相对。确保培养瓶与涂抹器的距离与指示的标记一致。对于 Orthowave 180c 设备，请使用 10 厘米的距离。
5. 对细胞培养瓶的下半部分进行 250 次 SW 疗法脉冲。
6. 将培养瓶旋转 180°，并对细胞培养瓶的上半部分进行 250 次脉冲。
7. 随后取下瓶密封，用 15 mL 含游离外泌体 FCS 的内皮生长培养基替换 PBS。
8. 在无外泌体培养基中培养 theraped 细胞，为实验设置适当的时间。SW 治疗后 4 小时可以收集最大量的外泌体（图 1）。
   注意：在假手术组中，将细胞培养瓶进行相同的处理（参见上一节），而不使用 SW 疗法。

4. 外泌体的分离

1. 将上清液转移到收集管中，并在 4 °C 和 300 x g 下离心 10 分钟。此步骤去除上清液中的所有细胞。
2. 为了去除细胞碎片，将上清液转移到新管中，并在 4 °C 和 3,000 x g 下离心 20 分钟。
3. 通过 200 nm 过滤器将上清液过滤到离心管中以去除凋亡小体。
4. 将过滤的上清液在 4 °C 下以 120,000 x g 离心 70 分钟。弃去上清液，用 300 μL PBS 重悬外泌体沉淀。
   1. 由于超速离心后看不到外泌体沉淀，因此将超速离心管涡旋 30 秒，以确保外泌体沉淀被重悬。根据实验需要和进一步实验调整 PBS 的体积。
5. 将重悬的外泌体储存在 -80 °C。
   注意：在将上清液转移到收集管中后或在超速离心之前通过将上清液在 -80 °C 下冷冻来暂停该方案。

5. 陷阱

1. 确保 SW 涂抹器与水浴紧密连接。连接不完整会导致水浴泄漏。
2. 确保培养瓶与涂抹器之间有准确的距离，以便对不同的培养瓶使用相同数量的能量通量密度。
3. 标记接受 SW 治疗的细胞培养瓶和作为对照样品的细胞培养瓶。
4. 在将培养瓶放回培养箱之前将其干燥，以避免污染。

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结果

使用所描述的方案，我们对人内皮细胞 （HUVEC） 以及人冠状动脉内皮细胞 （CAECs;PromoCell） 到冲击波疗法（例如，Orthowave 180c）。通过纳米跟踪分析 （NTA） 对释放的囊泡进行量化。因此，我们可以观察到 SW 治疗后微泡释放的增加（图 1A、B）。通过透射电子显微镜对释放的囊泡的 HUVEC 成像揭示了外泌体的特征 100 nm 大小（

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讨论

在多项基础研究工作中，可以证明冲击波疗法的再生效果，并常规应用于骨科适应症 ^3,4,5。在不同的动物模型中，可以证明对缺血心肌的再生作用，并导致 CAST-HF 试验的启动^9,10。这项随机对照试验旨在评估在冠状动脉搭桥手术期间额外应用直接心脏冲击波?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture flasks	Cellstar	658170	75 cm2
Collection tubes – Falcon Tube	Corning	352070
Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Endothelial Cell Growth Basal Medium	Lonza	CC-3121
Fetal bovine serum	Sigma	F0804
Parafilm	Pechiney	PM996
Phosphat buffered saline	gibco	14190-904
Shockwave applicator	MTS	Orthowave 180c