通过CD47衍生肽固定，缓解血系细胞附着到金属植入物

摘要

此处介绍的是使用多磷酸盐化学将肽 CD47 （pepCD47） 附在金属支架上的规程。使用 pepCD47 使金属支架功能化可防止炎症细胞的附着和激活，从而提高其生物相容性。

摘要

与裸金属支架和药物椭圆支架相关的主要并发症分别是支架内性恢复和后期支架血栓形成。因此，提高金属支架的生物相容性仍然是一个重大挑战。该协议的目标是描述一种由生物活性肽进行金属表面修饰的强有力技术，以提高血液接触医学植入物（包括血管内支架）的生物相容性。CD47是免疫学物种特异性自我标记，具有抗炎特性。研究表明，22种氨基酸肽与细胞外区域CD47的Ig域（pepCD47）相对应，具有抗炎特性，如全长蛋白。大鼠体内研究，以及我们实验室对兔子和人类血液实验系统的外体研究已经证明，在金属上进行pecd47固定通过防止炎症细胞附着和激活，提高了其生物相容性。本文介绍了金属表面和肽附着功能化的分步协议。使用具有潜在硫醇组（PABT）的聚酰胺双磷酸盐进行改性，然后通过与安装在苯丙胺组（PEI-PDT）的聚乙烯胺发生反应，对硫醇脱保和硫醇反应位点进行扩增。最后，pepCD47通过双8-3，6-二甲苯基分离基器将最终半胱氨酸残留物与核心肽序列连接起来，通过二硫化物键附着在金属表面。这种肽附着在金属表面的方法是有效的，相对便宜，因此可以应用于提高几种金属生物材料的生物相容性。

引言

皮下冠状动脉介入是治疗冠状动脉疾病（CAD）的第一线，主要涉及支架患病动脉。然而，支架内性休息（ISR）和支架血栓形成是常见的并发症与支架部署^1。血-支架界面的血液相互作用的特点是几乎立即吸附金属表面的血浆蛋白，其次是血小板和炎症细胞附着和活化^2。从活性炎症细胞释放炎症细胞因子和化疗素导致血管平滑肌细胞 （VSMC） 在 tunica 介质中的表型修饰，并触发其向心迁移到刺激室。活性VSMC在内膜中的扩散导致刺激层增厚，流明变窄和支架内休息^3。药物吹风支架（DES）是为了防止VSMC扩散而开发的;然而，这些药物对内皮细胞^4，5有非靶对^{目标细胞毒性作用}。因此，后期支架血栓形成是一种常见的并发症与DES^6，,7。由可生物降解聚合物（如聚L-乳酸酯）制成的支架在动物实验和初步临床试验中显示出了许多希望，但最终在"现实生活"的临床应用显示出其^低于第三代DES^{8时被召回}。因此，有必要提高裸金属支架的生物相容性，以更好的患者结果。

CD47是一种无处不在的表达跨膜蛋白，当与同源受体信号调节蛋白α（SIRP+）9结合时，抑制先天免疫^反应。SIRP® 受体具有免疫细胞酪氨酸抑制因子 （ITIM） 域和 SIRP+ - CD47 相互作用时的信号事件最终导致炎症细胞活化^{10、 11,、12}、^13的调节。我们实验室的研究表明，重组CD47或其肽衍生物，对应于CD47（pepCD47）细胞外区域的22个氨基酸Ig域，可以降低宿主对一系列临床相关生物材料^{14、15、16,15的免疫反应}。最近，我们已经证明peCD47可以固定在不锈钢支架表面，并显著减少与神经症相关的病理生理反应。值得注意的是，pepCD47改性表面可满足长期储存和环氧乙烷灭菌等相关^使用条件。为此，pepCD47可能是一个有用的治疗目标，以解决血管内支架的临床局限性。

pepCD47与金属表面共价附着的策略涉及金属表面的一系列新颖的化学修饰。金属表面首先涂上具有潜在硫醇组 （PABT） 的聚酰胺双磷酸盐，然后对硫醇进行脱保，并附着已安装的二乙酰二硫磷酸组 （PDT）。在反应中未消耗的PET组与脱保护的PABT硫醇发生反应，然后用peCD47在终端半胱氨酸残留物中加入硫醇，从而通过二硫化物键^{,14、17、18,17}将pecd47结合到金属表面。¹⁸我们使用荧光结合肽CD47（TAMRA-pepCD47）来确定肽的输入浓度，导致肽的最大表面固定。最后，我们分别评估了pecd47涂层金属表面的急性和慢性抗炎能力，使用钱德勒循环装置进行外体检测，以及单细胞附着/巨噬细胞扩张测定。

本文为硫化肽附着在金属表面提供了系统化方案;确定肽的最大固定密度;并评估pecd47涂层金属表面暴露在全血和孤立的单核细胞中的抗炎特性。

研究方案

根据费城儿童医院的 IRB，获得了所有人工样本。所有动物实验都是经费城儿童医院的亚科中心批准进行的。

1. 用PEI-PDT涂覆裸金属表面

1. 在摇床中用 2 异丙醇（60°C，200 rpm 的速度）清洗不锈钢箔优惠券（1 厘米 x 1 厘米或 0.65 厘米 x 1 厘米）或不锈钢网盘，使用 5 分钟。执行此步骤 2x。然后用氯仿洗2x（60°C，转速200 rpm），每次洗10分钟。
2. 将清洗过的不锈钢样品在220°C的烤箱中放置30分钟。
3. 将 5 mL 的 0.5% 的 PABT 溶液溶解为 25 毫克聚酰胺双磷酸盐与潜在的硫醇组 （PABT） 和 5 毫克碳酸氢钾 （KHCO_3）在 5 mL 的 DDW 中，并在 200 rpm 的摇床中孵育 72 °C，持续 30 分钟。
   注:对于PABT合成参考以前出版的文献^18。
4. 将烤箔或网盘浸入 0.5% 的 PABT 水溶液中，并在摇床中孵育（72°C，转速为 200 rpm），持续 1 小时。
5. 用去维蒸馏水 （DDW） 清洗 PABT 改性样品 5 倍，将样品转移到新小瓶中，再用 DDW 清洗 5 倍。
6. 在 5 mL 中溶解 5 mL 的 0.1 M 醋酸缓冲液 （0.57 mL 的冰川醋酸，100 mL 的 820 毫克醋酸钠）， 总共准备 5 mL 的 TCEP 溶液 （12 mg/mL）。
7. 在室温 （RT） 下，在摇床上用 TCEP 处理 PABT 改性样品 15 分钟。
   注意:TCEP 用于取消硫醇组保护。
8. 使用真空生成装置（如冻干剂）将 DDW 在圆形底部烧瓶中除气，用脱气 DDW 清洗 TCEP 处理的箔片或网盘，使用脱气 DDW 5 倍。将样品转移到新小瓶中，然后用脱气 DDW 再洗 5 倍。
   注:快速工作对于防止大气氧气在金属表面氧化硫醇至关重要。
9. 通过稀释脱气DDW中212.5μL库存PEI-PDT和125μL的0.4M醋酸钠，制备5 mL 1%的PEI-PDT溶液。与步骤 1.8 同时执行步骤 1.9，以尽量减少样品暴露在大气中。
   注:PEI-PDT的合成在先前出版的文献^{18中描述。}
10. 用 1% 的 PEI-PDT 孵育洗净的不锈钢试样。将空气更换为气，密封小瓶气密，并在 RT 的摇床上混合 1 小时。要么立即进行肽结合，或在4°C储存长达1周。

2. 使用荧光显微镜和荧光法对金属表面的氟磷结合peCD47保持进行附体和质量/定量评估

1. 如第 1 节所述，用 DDW 5x 进行上述步骤 1.1-1.10 准备的洗涤箔优惠券或网盘。将样品转移到新小瓶中，用DDW清洗，再洗5倍。最后用脱气乙醇洗2x，用去气二甲酰甲胺（DMF）洗2倍。
2. 通过将脱气二甲酰甲酰胺（DMF）中的TAMRA-结合peCD47粉末溶解到最终浓度为1mg/mL，准备四甲酰乙酰胺（TAMRA）-结合peCD47库存溶液。在 1 mL 分配中对库存解决方案进行等分。在-20°C的砷气下存放在密封良好的管子中。
3. 使用脱气 DMF 稀释 TAMRA 结合 pepCD47 的库存溶液 1 mg/mL，以制备以下浓度的氟磷结合 pepCD47 - 10、30、100 和 200 μg/mL。
   注:如果TAMRA结合peCD47似乎沉淀，减少库存TAMRA结合peCD47溶液使用TCEP珠子在比率1:1，在RT20分钟。请注意，在将 TAMRA 结合 pepCD47 添加到 TCEP 磁珠之前，旋转 TCEP 珠子溶液，取出上流液，然后继续添加 TAMRA 结合 pepCD47。
4. 在RT的 argon 气氛下，在 RT 的摇床上，在 RT 的摇床上孵育 10、30、100 或 200 μg/mL 的 TAMRA 结合 pepCD47，每个条件在 RT 的摇床上孵育 1 小时。孵育PEI-PDT修改的网盘，以及未经过步骤1.2（裸金属控制）修改的网盘，在RT的argon气氛下，在摇床上300μg/mL的TAMRA-结合pecd47。
   注:从这一步开始，小瓶被包裹在铝箔中，以保护内容物免受光线的光。
5. 按以下顺序清洗荧光结合肽肽47涂层表面，以去除非共价附着肽:DMF （3x）、DMF/DDW 在 1:1、 DDW （3x），0.3% SDS 在 20 mM Tris pH 7.4 （3x， 5 分钟每个在 70 °C 在摇床上）， DDW （3x）， 更换小瓶， 和最后的 DDW 洗涤.
6. 将控制和共价结合网盘放在显微镜玻璃上，添加 50 μL 的 PBS 并放置盖玻片。使用配备罗达胺滤光片的倒置荧光显微镜进行图像网格盘。以 100 倍放大倍率拍摄具有代表性的图像。
7. 在1:1 v/v甲醇混合物和0.1M醋酸缓冲液中溶解180毫克TCEP，准备15 mL的12mg/mL TCEP溶液。
8. 在RT的摇床上用1 mL的TCEP溶液孵育每个洗涤的铝箔15分钟。
9. 通过连续稀释TAMRA-结合peCD47库存（1毫克/千升）=100微克/千升、10微克/千升、1微克/mL、0.1微克/mL和0.01微克/千升，准备以下标准。使用 TCEP 溶液作为稀释剂。
10. 根据 544/590 nm 激发和发射波长的荧光度法标准生成的校准曲线，分析从金属表面释放的 TAMRA 结合 pepCD47。

3. 将人类 pepCD47 连接到 PEI-PDT 改性表面

1. 用去气除气的DDW 5x，用脱气DDW 5x，清洗上面第1节第1步骤1.1-1.10中所述的PEI-PDT涂层样品，更换小瓶，用脱气DDW 5x清洗。
2. 通过溶解50%醋酸中的人类 pepCD47 粉末，准备人类 pepCD47 库存溶液 （1 mg/mL），达到浓度 1 mg/mL。
3. 通过溶解 4，500 μL 脱气 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中 500 μL 的人类 pepCD47 库存，制备人类 pepCD47 的工作浓度（100 μg/mL）。
4. 在RT中用100μg/mL的peCD47孵育洗涤的PEI-PDT涂层样品，摇动1小时。
5. 清洗人体 pepCD47 涂层样品，以以下顺序去除过量肽 PBS （3x）、DDW （3x）、0.2% Tween-20（各 3 倍、5 分钟）、DDW（3 倍）、更换小瓶和最终 DDW 洗涤。
   注:人类 pepCD47 涂层表面可以 4°C 干燥储存长达 6 个月。

4. 用搅乱序列（Scr）对PEI-PDT改性表面进行涂层

1. 将搅拌序列粉末溶解在脱气0.1%醋酸中，以准备1mg/mL的库存溶液。
2. 通过溶解 4，500 μL 中 0.1% 脱气 0.1% 醋酸中的 500 μL，制备 100 μg/mL 的炒肽溶液。
3. 在RT上用100μg/mL的炒肽将洗涤过的PEI-PDT试样涂上1小时。
4. 要去除未连接的炒肽，请按以下顺序清洗表面 0.01% 醋酸 （3 倍）、DDW （3x）、0.2% Tween-20 （3x， 5 分钟）、DDW （3x）、更换小瓶和一个 DDW 洗涤。

5. 钱德勒循环，用于分析细胞附着在金属表面

1. 按照第 1 节的描述，用人类 pepCD47 或炒肽（0.65 厘米 x 1 厘米）涂上金属箔（0.65 厘米 x 1 厘米）。
2. 将 1/4" PVC 管切成三块 38 厘米长的 PVC 管。
3. 在三个不同的管中插入多达8个未改性、炒肽或肽47改性金属箔。
4. 根据机构 IRB 协议，从健康的人类捐赠者那里收集 30 mL 的血液，不含任何抗血小板药物。预装注射器，含1 mL 4%柠檬酸钠，防止采集的血液凝固。
5. 使用 10 mL 注射器将 10 mL 的血液放入每个管中，并使用金属适配器连接两端。将充满血液的管子放在钱德勒循环装置的车轮上。
6. 以37°C的速度在37°C下沿金属箔传递血液，以计算速度产生25个dyns/cm^2的剪切4 小时。
7. 排出管中的血液，根据 IRB 要求处理血液。
8. 使用手术刀切割管子，从每个管子中取回铝箔。
9. 使用 10 mL 的二甲酸钠缓冲液和 0.1 M 氯化钠稀释 10 ml 的 4% 谷氨酸溶液，准备 2% 谷氨醛溶液。
10. 在2%谷胱甘肽溶液中孵育铝箔15分钟，在4°C下储存过夜。分析前，用PBS清洗金属箔3倍。

6. 使用 CFDA 染料分析金属表面的细胞附着

1. 在水浴设置为 37 °C 的 15 mL 管中加热 8 mL PBS。
2. 准备CFDA（碳磷酸二甲酸酯，苏西尼米耶酯）染料溶液如下 - 将90μL的DMSO添加到一个CFDA染料瓶中，以达到10 mM的库存浓度。接下来，通过将库存 CFDA 的 75 μL 添加到 8 mL 的暖 PBS，制备 93.75 μM 的工作浓度。通过反转管子几次进行混合，用铝箔盖住管子。
   注意:建议在每次使用前新鲜准备CFDA染料。
3. 在24井板中用1 mL的CFDA染料孵育每个铝箔。用铝箔盖住板，在37°C下孵育板15分钟。
4. 用 PBS 清洗金属箔 3 倍，以去除多余的染料。使用倒置荧光显微镜的图像。

7. pepCD47 改性和裸金属表面上的单细胞附着和巨噬细胞膨胀

1. 在牺牲 400-450 g 雄性斯普拉格 - 道利大鼠时， 通过 vena cava 通道收集 10 mL 的外周血。立即与1，000 IU的肝素钠混合，以防止凝固。
2. 移液 10 mL 密度梯度介质成 50 mL 锥形管。将血液与 5 mL 的 PBS 混合，并使用巴氏移液器将稀释的血液小心地分层到密度梯度介质上。在 800 x g 和 18-25 °C 的摆动铲斗转子中离心 20 分钟，加速和减速设置最小。
3. 使用巴斯德移液器，在等离子体和菲科尔之间的界面上收集一层不透明的薄漆。稀释布衣1:3与PBS和离心机在550 x g 和4°C10分钟，以抛光涂层细胞。
4. 将毛囊涂层细胞重新悬浮在3 mL的CK解压缓冲液中，以解压红细胞。在冰上孵育4分钟。添加 12 mL 的细胞分离缓冲液（CSB;0.5% BSA，0.5% FBS，2 mM EDTA/PBS）。
5. 在 550 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟。将颗粒重新悬浮在 10 mL 的 CSB 中。
6. 在 200 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟，以消除血小板。重复两次。
7. 将颗粒重新悬浮在 500μL 的 CSB 中。添加以下小鼠抗鼠抗体的10μg:CD8a（克隆OX-8）、抗CD5（克隆OX-19）、抗CD45RA（克隆OX-33）和抗CD6（克隆OX-52）。
8. 在4°C的垂直管旋转器上孵育1小时，加入9.5 mL的CSB。在 300 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟。丢弃上一级，在 CSB 的 10 mL 中重新悬浮颗粒并重复离心。
9. 将颗粒重新悬浮在 500μL 的 CSB 中。加入150μL的山羊抗小鼠IgG微珠。在4°C的垂直管旋转器上孵育20分钟，加入9.5 mL的CSB。在 300 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟。
10. 丢弃上一杯。将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 CSB 中。
11. 将 LS 列放在磁性分离器中。 使用 3 mL 的 CSB 为 LS 列提供总理。放弃列吞吐量。从步骤7.10中加入1 mL的再悬浮细胞颗粒。开始收集吞吐量。流停止后，添加 5 mL 的 CSB，并不断收集列吞吐量，直到流停止。
12. 在 300 x g 和 4 °C 下将包含 x g 负选定单核细胞的柱通量 （6 mL） 离心 10 分钟。在 2 mL 的 RPMI-1640 介质中重新悬浮产生的小颗粒，并辅以 10% FCS、1% 笔/链球菌和 100 ng/mL 大鼠巨噬细胞组刺激因子 （M-CSF）。
13. 使用血细胞计计算单细胞。将单细胞浓度调整为 5 x 10⁵ 细胞/mL。
14. 将 1 mL 体积的单核蛋白悬浮液添加到 12 孔板的单个孔中，并采用裸不锈钢箔样品 （N+3） 或不锈钢样品，根据 1.1-1.10 和 3.1-3.6 修改用 rat pepCD47 （N+3） 进行修改。
15. 在播种后的第 3 天和第 5 天更改介质。第6天，播种后用PBS清洗细胞，并在室温下用4%的甲醛固定15分钟。用 PBS 洗涤两次 5 分钟。
16. 拆下不锈钢箔，并将其单独放入新的 12 井板中。不要翻转铝箔。
17. 在0.5%Tween-20/PBS中孵育15分钟，使细胞渗透。用 PBS 洗涤两次 5 分钟。
18. 在10%山羊血清/PBS中阻断20分钟。吸气血清。不要洗。加入小鼠抗大鼠CD68抗体（在1%BSA/PBS中稀释1:100）。在室温下孵育1小时。在 PBS 中清洗 3 次，每次 5 分钟。
19. 添加山羊抗小鼠IgG亚历克萨氟546（稀释1:200在1%BSA/PBS）。在室温下在黑暗中孵育45分钟。在 PBS 中清洗 5 分钟。在室温下暗暗10分钟，用1μg/mL Hoechst 33342染料对面。在 PBS 中清洗 3 次，每次 5 分钟。
20. 使用荧光显微镜使用倒置光学元件翻转铝箔和图像。使用蓝色和红色滤镜设置以 200 倍的放大倍率捕获图像。
21. 计算单个图像中附加的单核，并计算组平均值和标准偏差。

结果

金属表面通过一系列化学修饰呈现硫醇反应，如图1所示。PABT孵育后PEI-PDT处理使金属表面适合肽附着。肽CD47（pepCD47）含有半胱氨酸残留物在C-术语连接到核心peCD47序列通过一个灵活的双EEAC桥通过硫化物键共价连接到硫醇反应表面。使用此协议，我们已证明pecd47保持稳定连接到金属表面长达六个月，并能承受正常的生理剪切应力和灭菌程序^17。

讨论

我们演示并描述了一种相对新颖的化学策略，将治疗性肽莫伊蒂斯附在不锈钢表面，其首要目标是减少表面与血液中的炎症细胞的活性。本文描述的双磷酸盐化学涉及PABT的金属氧化物和双磷酸盐组之间的协调键的形成。在金属表面形成的多磷酸单层厚度不超过5纳米^18，因此，对厚聚合物涂层²⁰的潜在刺激作用无关紧要。PABT的脂质侧链中潜在硫醇组的脱保护使金...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCL	Invitrogen	15567-027	pH - 7.5
4% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16539-07
4% Sodium Citrate	Sigma	S5770
ACK lysing buffer	Quality Biologicals	118-156-721
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)	Biolegend	202301
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)	Biolegend	203501
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)	BD Biosciences	550979
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)	BioRad	MCA341
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)	Biolegend	201701
Chloroform Certified ACS	Fisher Chemical	C298-500
Dimethyl Formammide (DMF)	Alfa Aesar	39117
Embra stainless steel grid	Electron Microscopy Sciences	E200-SS	stainless steel mesh mesh disks
Ficoll Hypaque	GE Healthcare	17-1440-02
Glacial acetic acid	ACROS organic	148930025
goat anti-mouse IgG Alexa Fluor	ThermoFisher	A11030
Heparin sodium	Sagent Pharmaceuticals	402-01
Human pepCD47	Bachem	4099101
Isopropanol	Fisher Chemical	A426P-4
Metal adapters	Leur Fitting	6515IND	1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end
Methanol	RICCA chemical company	4829-32
Microscope	Nikon Eclipse	TE300
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	14190-136
Pottasium Bicarbonate (KHCO3)	Fisher Chemical	P184-500
PVC tubes	Terumo-CVS	60050	1/4" X 1/16 8'
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	11653
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad laboratories	161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2)	Alfa Aesar	A13184
Src peptide	Bachem	4092599
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen	Microgroup, Medway, MA	20097328	1 cm X 6 mm OD
Stainless steel foils (AISI 316L)	Goodfellow, Coraopolis, PA		100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)	Bachem	4100277
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	PG82089
Tween-20	Bio-Rad laboratories	170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit	Invitrogen	V12883