基于RNA-Seq的嘌呤核苷酶基因挖掘和序列分析

摘要

在该方案中，描述了一种基于 RNA-Seq 的嘌呤核苷酶 （PN， EC：3.2.2.1） 的基因挖掘和序列分析方法。应用 ProtProm 分析来显示 PN 独特的二级和三级结构。此外，从转录组中克隆 PN 基因以验证 RNA-Seq 结果的可靠性。

摘要

冬虫夏草 （Ophiocordyceps sinensis） 是最有价值的真菌中药 （TCM） 之一，它含有大量的活性成分，如腺苷。腺苷被认为是一种生物有效的成分，具有多种抗肿瘤和免疫调节活性。为了进一步阐明嘌呤核苷酶 （PN） 在腺苷生物合成中的机制，成功挖掘了编码 PN 的基因，并基于毛虫真菌的 RNA-Seq 数据库进一步分析。 PN 的全长 cDNA 为 855 bp，编码 284 个氨基酸。BLAST 分析显示 NCBI 中与核苷水解酶的同源性最高，为 85.06%。ProtProm 分析显示，相对分子质量为 30.69 kDa，等电点为 11.55。PN 的二级结构由 Predict Protein 预测;结果表明，α 螺旋结构占 28.17%，股链结构占 11.97%，环结构占 59.86%。此外，从转录组中进一步克隆 PN 基因，并通过琼脂糖凝胶电泳检测以进行验证。本研究为中药真菌腺苷生物合成的遗传调控提供了更充分的科学依据和新思路。

引言

真菌中医 （TCM） 具有丰富的物种资源 ^1,2.冬虫夏草 （Ophiocordyceps sinensis） 是一种著名的中药真菌，被认为是创新药物的来源 ^3,4。毛虫真菌是一种蠕虫和真菌的混合物，分布于中国西南部的青藏高原，那里的中华毛毛虫寄生在毛虫身上⁵.目前，根据分子和形态学证据，H. sinensis 被报道为冬虫夏草真菌的唯一变形物 ^6,7，与野生冬虫夏草真菌相比，它具有较少的相关毒性和相似的临床疗效⁸。研究发现，H. sinensis 具有多种生物有效成分，如核苷、多糖和麦角甾醇，具有广泛的药理作用，如修复肝损伤 ^9,10,11。腺苷是从冬虫夏草中分离出来的典型活性成分，是一种嘌呤生物碱¹²。腺苷具有多种生物活性：抗肿瘤、抗菌和免疫调节活性^13,14。不幸的是，腺苷的生物合成机制以及所涉及的关键基因仍不清楚^15,16。

腺苷主要通过肿瘤微环境中的免疫抑制作用来显示其抗肿瘤作用¹⁷。据报道，腺苷显示出免疫抑制功能，这对于在受伤后启动组织修复和保护组织免受过度炎症至关重要^18,19。此外，研究表明腺苷介导的免疫抑制会严重损害癌症免疫监视并促进肿瘤生长²⁰。因此，迫切需要研究腺苷生物合成的机制，使其在抗肿瘤中得到广泛应用。

据报道，通过转录组²¹ 的下一代测序，可以系统地了解表达基因及其表达水平。此外，应用转录组测序和分析来预测参与活性成分生物合成途径的基因，并进一步研究不同生物合成途径之间的相互作用²²。嘌呤核苷酶 （PN， EC 3.2.2.1） 是一类对嘌呤核苷具有底物特异性的核苷酶，它可以将嘌呤核苷的糖苷键水解成糖和碱基²³。它通常在腺苷生物合成中起重要作用。据报道，腺苷在真菌中药的生物合成途径是预测的;qPCR 和基因表达表明，腺苷积累增加是 PN 基因下调的结果，表明 PN 基因可能在腺苷生物合成中发挥重要作用¹⁵。因此，必须紧急阐明 PN 在腺苷生物合成中的机制。然而，PN 的序列信息和蛋白质结构以及参与真菌中药腺苷生物合成的其他关键基因尚未得到进一步研究。

本研究从毛虫菌的 RNA-Seq 数据中挖掘出 PN 基因的新序列，并通过基因克隆进行验证。此外，全面分析了 PN 的分子特性和蛋白质结构，可为腺苷生物合成的基因调控提供新的方向和思路。

研究方案

注意：虫草真菌 （H. sinensis） 的变形菌株存放在我们的实验室中。 大肠杆菌 DH5 由北京中医药大学深圳医院保存。

1. RNA-Seq 的准备

1. 菌丝体的收获
   1. 准备用于发酵中华 花杆菌的发酵培养基：玉米粉粉 （1%）、蚕蛹 （1.5%）、酵母提取物 （0.5%）、胰蛋白胨 （1%）、葡萄糖 （1.5%）、麸皮 （1.5%）、糊精 （0.5%）、KH₂PO₄ （0.02%） 和 MgSO₄ （0.01%）。
   2. 用 10% 发酵培养基制备接种物，用于放大培养（每 100 mL 培养基添加 10 mL 培养基）。在 16 °C 的条件下，在旋转振荡器上以 150 rpm 的速度进行深层发酵 10 天。
   3. 无性繁殖并收获毛虫真菌变形菌丝体 10 天。离心发酵培养基，离心后弃去上清液。加入 100 mL 超纯水 3 次悬浮菌丝体，离心除去上清液。使用液氮将清洁的菌丝体研磨成粉末。
2. RNA-测序
   1. 根据制造商的方案（材料表）提取毛虫真菌变形物的总 RNA，并进一步用不含 RNase 的 DNase I（材料表）处理样品。
   2. 从总 RNA PolyATtract mRNA 分离系统中分离 mRNA，并根据制造商的方案（材料表）使用带有 oligo（dT） 的微珠分离 poly（A） mRNA。
   3. 以短片段为模板，根据制造商的方案（材料表）通过随机六聚体引物合成第一链 cDNA。根据制造商的方案进行第二链 cDNA 的合成。
   4. 随后，根据制造商的方案（材料表），使用 Ultra RNA 文库制备试剂盒生成测序文库。
   5. 根据制造商的方案（材料表）通过 PCR 提取试剂盒纯化短片段，并分别通过 EB 缓冲液解析。
   6. 根据琼脂糖凝胶电泳的结果，将短片段（阈值为 300 bp）与测序接头连接。
   7. 随后，使用从合适片段中选择的模板进行 PCR 扩增。
   8. 根据制造商的方案，通过 Illumina HiSeq 4000 和双端测序对文库进行测序。从原始序列数据中过滤脏原始读长以获得干净的数据。采用 denovo 组装以获得 Unigenes，具有最小的 Ns，不能在两端延伸。
   9. 通过 blastx 将 Unigene 序列与蛋白质数据库（如 nr、Swiss-Prot、KEGG 和 COG）进行比对（e 值< 0.00001）。检索与给定 Unigenes 具有最高序列相似性的蛋白质及其蛋白质功能注释。总结 RNA-Seq 结果（材料表）。
      注意：上述步骤中使用了商业试剂盒，所有作均根据制造商的方案完成。

2. 嘌呤核苷酶的基因挖掘

1. 在计算机上下载 RNA-Seq 结果文件。从 RNA-Seq 结果中找到组装的 Unigenes 的注释结果文件。
   注：双端读数再次用于支架的间隙填充，以获得不能在任一端延伸的最小 Ns 序列。这样的序列被定义为 Unigenes。Unigene 注释提供 Unigene 的表达和功能注释信息。
2. 打开 Annotation Files 路径，然后在搜索栏中输入 map 00230 ;然后在注释文件的 KEGG 分类中搜索 purine metabolism （map00230）。
3. 在注释的 map00230 中标记 EC：3.2.2.1 （PN） 红色，并表示存在已注释为 PN 的组装 Unigenes。
   注意：单击 EC 编号 3.2.2.1 后，有三个 Unigene（Unigene10777、Unigene14697 和 Unigene17827）被注释为 PN，并显示在注释的 map00230 中。
4. 单击 EC 编号 3.2.2.1 并显示带注释的 Unigenes 信息。
5. 打开 LTFViewer 软件，使用 Ctrl-O 快捷键导入 Unigene.fa 文件，并显示组装的 Unigenes 的序列信息。
6. 使用 Ctrl-F 快捷键搜索 Unigene10777、Unigene14697 和 Unigene17827 的序列信息。
7. 使用 Ctrl-C 和 Ctrl-V 快捷键下载 Unigene10777、Unigene14697 和 Unigene17827 的序列信息。
8. 消除 Unigene10777 和 Unigene17827 与过短的开放阅读框 （ORF） 序列。
   注：基本序列信息显示在 LTFViewer 软件中。
9. 选择具有合适 ORF 长度的 Unigene14697 （大小 1,705 bp，间隙 0 0%） 进行进一步研究。

3. 生物信息学分析

1. 通过 ORFfinder （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 分析 PN 基因的 ORF。
   1. 将序列粘贴到框中。选择参数如下，最小 ORF 长度 （nt）：75，遗传密码：1。标准，ORF 起始密码子使用：仅限 ATG。单击 Submit 按钮以获取 ORF 信息。
2. 使用 ProtParam 工具 （http://us.expasy.org/tools/protparam.html） 计算理论分子量和等电点。
   1. 将氨基酸序列（以单字母代码）粘贴到框中，然后单击 Compute Parameters 按钮以获取结果。
3. 应用 SignalP5.0 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 预测信号肽。
   1. 以 FASTA 格式输入蛋白质序列。选择参数如下，生物组：真核生物，输出格式：长输出。点击 提交 按钮获取结果。
4. 应用 BLAST （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 分析蛋白质序列的同源性。
   1. 单击 Protein Blast 按钮，然后在框中输入序列。选择参数如下，数据库：非冗余蛋白质序列 （nr），算法：blastp （protein-protein BLAST）。点击 Blast 按钮获取结果。
5. 应用 Clustal X 程序 （http://www.clustal.org/） 来比对来自不同真菌的 PN 的酸序列。
   1. 上传文件或将序列粘贴到框中。按如下方式设置参数，输出格式：ClustalW with character counts。点击 提交 按钮获取结果。Clustal X 只能识别 FASTA 格式的文件，并且文件的路径只能包含英文名称。
6. 使用 MEGA 4.0 （https://www.megasoftware.net/mega4/） 进行系统发育树。
   1. 打开软件并单击 文件 按钮上传序列。选择数据类型作为 蛋白质序列，点击 OK 按钮继续下一步。随后，单击 Phylogeny 按钮并选择 Bootstrap Test Phylogeny，然后单击 Neighbor Joining Tree。选择默认参数，然后单击 Compute 按钮以获取结果。
7. 应用 InterProScan （http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/） 识别 PN 的催化结构域。
   1. 在框中输入序列。选择默认参数，然后单击 Search 按钮以获取结果。
8. 在线应用 Predict Protein （http://www.predictprotein.org/） 来预测蛋白质二级结构。
   1. 在框中输入氨基酸序列（一个字母代码），然后单击 predictProtein 按钮以获取结果。
9. 应用在线工具 SWISS-MODEL （http://swissmodel.expasy.org/） 来评估 PN²⁴ 的三维结构。
   1. 单击 Start Modeling 按钮并将目标序列粘贴到框中。填写 Project Title 和 Email 信息，然后单击 Search for Templates 按钮以获取结果。

4. 重组质粒的基因克隆和构建

1. 设计反向引物包含 NotI 位点且正向引物具有 EcoRI 位点的引物。
2. 由 Primer Express 将正向引物显示为：AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT （5'–3'），反向引物显示为：ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA （5'–3'）。
3. 准备引物以及毛虫真菌的 cDNA 用于克隆 PN 基因。按如下方式进行PCR：在95°C下预变性5分钟，在94°C下变性45秒，在55°C下复性60秒，在72°C下延伸90秒，重复35个循环，并在72°C下延伸10分钟。
4. 获取 PCR 片段并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测以进行验证。用 pMD18-T 连接 PCR 片段。按如下方式进行 PMD18-T 的连接系统：1 μL PMD18-T、4 μL 溶液 1 和 5 μL 靶基因。设置条件如下：在 16 °C 下维持 16 小时，在 65 °C 下灭活 15 分钟。
5. 根据作手册²⁵ 将重组质粒转移到感受态大肠杆菌 JM109 细胞中。
6. 用 EcoRI 和 NotI 消化重组 pMD18-T/PN 质粒和载体 ppic9K。通过 T4 DNA 连接酶消化后连接片段。
7. 构建重组质粒 ppic9K/PN 以进一步异源表达。

结果

PN 基因的 ORF 序列长度为 855 bp，编码 284 个氨基酸，计算分子量为 30.69 kDa，预测等电点为 11.55，表明 PN 是一种碱性蛋白。应用 SignalP4.0 Server 鉴定信号肽，结果表明 PN 没有信号肽。此外，BLASTP 搜索结果表明，源自冬虫夏草菌的 PN 与丁香紫霉的核苷水解酶 （OAQ81830.1） 具有最高的同一性 （85.06%，E 值 = 1e-88）。此外，应用 ClustalX 程序进行 PN 的多序列比...

讨论

人类健康面临肿瘤、心血管和脑血管疾病等一系列重大医学问题^26,27。中药因其丰富的物种资源和多样的活性成分结构和功能而被视为创新药研发的源泉^28,29。毛虫真菌是鳞翅目幼虫上的真菌寄生虫，是中国传统的一种振奋剂，被认为是最好的振虫之一，有 Panax 和 Pilose 鹿角

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-free DNase I	TaKaRa	2270B
PolyATtract mRNA Isolation Systems	Promega	III
Random hexamer-primers	Thermo Scientific	SO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep Kit	NEB	E7530S
PCR extraction kit	QiaQuick
Agarose	TransGen Biotech	GS201-01
High-throughput sequencer	Illumina	HiSeq™ 4,000
LTF Viewer	LTF	V5.2
ORF program	NCBI
ProtParam tool	SIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP Server	DTU Health Tech	5.0
BLAST	NCBI
Clustal X program	UCD Dublin
MEGA	Center for Evolutionary Medicine and Informatics	4.0
InterProScan	European Molecular Biology Laboratory
Predict Protein	Technical University of Munich
WISS-MODEL	Swiss Institute of Bioinformatics
Primer Express	Applied Biosystems	3.0
EcoRI	NEB	R0101V
NotI	NEB	ER0591
pMD18-T Vector	TaKaRa	6011
agarose	Sigma-Aldrich	GS201-01
Trans2K® Plus II DNA Marker	Sigma-Aldrich	BM121-01
6×DNA Loading Buffer	Sigma-Aldrich	GH101-01
GelStain	Sigma-Aldrich	GS101-02
50 x TAE	Sigma-Aldrich	T1060
Gel imaginganalysis system	Syngene	G:BOX F3
E. coli JM109	Promega
T4 DNA ligase	EarthOx	BE004A-02
pPIC9K	Genloci	GP0983