在伊蚊中传播微孢子寄生虫Edhazardia aedis

摘要

培养微孢子寄生虫Edhazardia aedis的规程。寄生虫从一代伊蚊通过幼虫阶段的水平转移传递到下一代，随后在成人阶段垂直传播。活的精子在受感染的卵子中长期存活。

摘要

Edhazardia aedis是伊蚊的微孢子寄生虫，伊蚊是一种传播多种病毒的病媒，每年导致数百万例疾病病例。E. aedis导致蚊媒的死亡和繁殖能力下降，并已被探索其作为生物控制剂的潜力。我们为培养E.aedis而呈现的协议基于其自然感染周期，它涉及蚊子宿主不同生命阶段的水平和垂直传播。ae. aegypti蚊子在幼虫阶段暴露在孢子中。这些受感染的幼虫然后成熟成成人，并将寄生虫垂直传至后代。然后，受感染的后代被用作孢子的来源，用于未来的水平传播。鉴于寄生虫的生命周期的复杂性，培养E.aedis对未启动者可能具有挑战性，该协议提供了详细的指导和视觉辅助工具，用于澄清。

引言

伊蚊是多种病毒（如登革热、寨卡、黄热病）的蚊媒，估计每年可导致数亿例疾病病例，1²人死亡³万多人。这些病原体引起的疾病的治疗仅限于支持性护理，而且未来³日可能会出现更多的病毒。因此，控制蚊媒是首要的，因为它有效地防止了当前和新出现的病原体^的传播。传统上，病媒控制战略主要使用化学杀虫剂，但对许多常用杀虫剂的抗药性推动了对病媒控制新方法的需求。一个潜在的代理，已被探索的生物控制性质对艾吉普提是寄生虫Edhazardia aedis^5，6。

E.aedis，1930年由库多首次确定为诺塞玛伊迪斯，是一种微型寄生虫，是7种阿吉普提^{蚊子的微生物寄生虫}。 E.aedis的开发和繁殖是比较复杂的，其生命周期可以以^{多种方式进行7、8、9。}一个常见的发育周期在贝克内尔等人，1989^{年7日深入}描述，并用于实验室传播（图1）8。简言之，当Ae.aegypti卵子垂直感染E.aedis孵化成受感染的幼虫时，这个周期就开始了，幼虫体内会形成单核孢子，通常以幼虫或幼虫死亡。从死幼虫中释放的核孢子污染了栖息地，并由健康的Ae. aegypti 幼虫摄入。这些孢子主要在消化道发芽，感染暴露的幼虫的消化组织，导致水平传播。水平感染的幼虫发育成成人（父母生成），在那里形成双核孢子。在女性中，这些双核糖孢子侵入生殖道，其相关的孢子体感染发育中的卵细胞。这些卵子然后孵化成受感染的幼虫（孝长），导致寄生虫的垂直传播和循环的延续，如上所述。

多项研究已经调查了E.aedis在生物控制方面的潜力。感染E.aedis已经证明会导致¹⁰岁女性繁殖能力下降。此外，在半场实验中，E.aedis的淹没释放导致完全消灭了保存在筛选的外壳6中的一个测试Ae. aegypti ^种群。虽然E.aedis能够在多种蚊子中经历一些发展阶段，但只在E.aegypti中垂直传播，表明宿主特异性^11，12。同样，在实验室评估与E.aedis相关的潜在环境风险时，微孢子寄生虫未能感染非目标水生动物，包括摄入感染E.aedis¹³的食肉动物。这些结果突出了E.aedis在针对自然Ae. aegypti 种群的生物控制策略中使用的潜力。

尽管E. aedis 在矢量控制中显示出了使用的希望，但大规模培养和部署它却面临挑战。E. aedis孢子在低温（即5°C）下不到一天就会失去感染性。即使在温暖的温度（即25°C）下，孢子在三周14日之间迅速^{失去感染力}。此外，必须培养活的艾吉普提蚊子和控制给健康的幼虫蚊子给，以确保完成生命周期，并防止用于培养⁸的人口崩溃。体内培养的要求提出了挑战;然而，最近蚊子大规模饲养和机器人技术（如马萨罗等人^15）的进步可能允许大规模生成E.aedis孢子。我们预计，这种方法的可视化将增加对E.aedis饲养协议的可访问性，并允许更多的研究人员研究该系统的基本生物学和应用潜力。我们还预计，这将促进与工程师、机器人学家和更广泛的技术部门加强合作，从而有助于改善E.aedis的大规模饲养。

图1:E.aedis在艾吉普提的传播。 E.aedis 的传播始于孵化E. aedis 感染的卵子。受感染的幼虫被饲养^到第4个星，E.aedis孢子从这些幼虫中分离出来，孢子用于口头感染健康的2/3^第三星幼虫，这些幼虫从未受感染的卵子（水平传输）中饲养。这些口头感染的幼虫然后被饲养到成年（父母一代），并产卵感染E.aedis（垂直传播）。受感染的卵子（孝生代）然后孵化，以继续感染周期和寄生虫培养。请单击此处查看此图的较大版本。

研究方案

1. 第 0 天

1. 将 1升（DI） 水放入幼虫饲养托盘中，将蛋类蛋与 E.aedis 感染。加入50毫克的鱼食。
   注:在出版时 ，E.aedis的实验室 菌株只能从积极研究寄生虫的实验室获得， 因为E.aedis 不能长期储存，受感染的卵子目前不储存在储存库中。有兴趣与 E.aedis合作的研究人员 可以联系相应的作者，请求受感染的卵子。
   注:通常不需要孵化大量受感染的鸡蛋; 10个E.aedis 感染的 E.aegypti 幼虫足以给1000≥剂量。
   注:对于本协议的所有部分，我们在以下条件下安置蚊子:14 小时/10 小时光/暗循环、27 °C 温度和 80% 相对湿度。

2. 第 1 天

1. 孵化后，将幼虫密度降低至每托盘+100幼虫，必要时制作新托盘（也用1升DI水）。
2. 在每个托盘中加入一块干猫粮。耗尽食物后补充食物，但不提供过量的食物。每三天一块猫粮（约200毫克）就足够了。
   注:根据特定的饲养条件调整食物量（即，如果水变得浑浊或幼虫死亡，减少食物;如果幼虫发育严重延迟，则减少食物）。可以使用此处建议的其他喂养方案和/或饲养条件，但可能需要调整此标准协议的时间安排。

3. 第 4 天\u20125

1. 当受感染的幼虫是^3~4星时，在一个新的托盘中孵化出健康/未受感染的Ee.aegypti卵子。
2. 后方的密度， 使健康的 Ae. aegypti 达到^{2 +} 3^第 三星在 48 - 72 小时。在我们手中，这可以通过密度200\u2012300幼虫每1升水与 副利比 图姆获得食物。多日孵化一批健康卵子可以保证幼虫在需要的时候处于正确的阶段。

4. 第 7 天\u20128: 水平传输

注:在感染幼虫中，在单核孢子数量高（1 x 10^{4 =} 1 x 10^{6 6，}每个幼虫）中，不能对健康的幼虫进行对健康的幼虫的给给。这发生在第4^星阶段的后期（图2）。

1. 收获和量化单核孢子。
   1. 使用转移移液器（可能需要将尖端切到更宽的直径）将 10 个受感染的幼虫移动到 1.5 mL 微离心管。
   2. 用转移移液去除育种水，加入±1 mL的清洁DI水洗一次。用移液去除洗涤水，在10个幼虫中加入500μL的清洁DI水，并使用害虫和机械均质器均质化。
   3. 使用血细胞计以 400 倍的放大倍率量化孢子。
      注:核糖孢子可以通过其独特的火种形状（即梨形）来识别;图2A）。
2. 剂量 健康 Ae. aegypti 幼虫与 E. aedis.
   1. 混合1.2克肝粉、0.8克啤酒酵母和100 mL水，制作新鲜的幼虫食品浆料。
      注:如果食物被自动保存并储存在4°C，直到使用，就不需要新鲜。
   2. 将 100^{2 –} 3^第 3 个星健康 Ae. aegypti 幼虫转移到 150 mL 烧杯或标本杯中。
   3. 剂量每个烧杯100幼虫与5 x 10⁴ × 1 x 10⁵ 孢子。
   4. 将 2 mL 的幼虫食物浆料和 DI 水加入到 100 mL 的最终体积中。
3. 在12~24小时暴露后，按照标准的饲养方案16将暴露的幼虫转移到饲养托盘和^成年后。

5. 监测和垂直传输

1. 监测被点幼虫的幼崽，并在它们发育到笼子里出现杯时，将幼虫转移到它们。糖饲料成人广告（根据^{16，17）。}与成人接触的成人将被感染。
2. 血液喂养成人（根据^16，17）和收集鸡蛋。E. aedis 的垂直传输在此步骤中发生。
   注:如果一旦卵巢完成就提供额外的血餐，女性在成人遭受（通常是突然）高死亡率之前，至少可以多产一组卵子。
3. 使用这些 感染 E. aedis 的 Ae. aegypti 卵子 ，从本协议的第 1 步开始继续繁殖。
   注:鸡蛋在适当条件下可储存2~3^个月。
4. 用 10% 漂白剂和高压灭灭（如果可能）清洁所有与 E. aedis 接触的材料，以防止污染。

结果

E. aedis感染了Ae. aegypti利物浦 （LVP^1b12） 鸡蛋孵化，如上述协议所述。在第4^个星形阶段，可以观察到感染的视觉迹象，包括整个受感染幼虫的脂肪体中的白孢子囊肿（图2B所示）。核糖孢子是在500μL DI水中均质10幼虫，从第4个星体幼虫中收获的。这些孢子是火种（梨形），在400倍时很容易看到（图2A）。使用血细胞计计算孢子计数为4.05 x 10³孢子/μL。100个健康的Ee.aegypti幼虫随后在100 mL水中水平感染50，000个孢子，最终剂量为500个孢子/幼虫。幼虫被饲养到成年（父母一代）和血液喂养使用除颤的兔血加上1%（v/v）100 mM腺苷三磷酸盐。垂直感染的卵子被收集（孝代）和孵化，以继续E.aedis繁殖和量化感染成功。

在孵化后7天，25个孝感代幼虫被转移到单独的1.5 mL微离心管中，用DI水洗涤一次。在250μL的DI水和感染状态中，个体幼虫均质化，使用血细胞计评估E.aedis负载。发现孝感代E.aedis的垂直感染率为96%，孵化后7天感染者平均孢子负荷为3.31×10^5（范围:3.25×10⁴ ~1.47×10^6;图3.

图2:Ae.aegypti蚊子的E.aedis感染的可视化。（A ） E. aedis单核状孢子.10个E.aedis^{感染的第4}个星幼虫在孵化后大约7天在500μL的DI水中均质化。10 μL 的均质被加载到血细胞计上，以 400 倍的速度查看。红色箭头表示具有代表性的单核E. aedis孢子。（B） E.aedis^感染第4个星体幼虫在其脂肪体中形成独特的白色孢子囊^肿18。他们通常也有畸形和扩张的腹部部分。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:文化协议导致孝感 代有效 感染。孝感代的 Ae. aegypti 幼虫 （n = 25） 在 250 μL DI 水中单独均质，10 μL 的均质被加载到血细胞计上。单核孢子的存在表明感染呈阳性，孢子被量化为所有阳性样本。（A） 孝感幼虫感染的流行率。灰色对应于未感染的幼虫，黑色对应于感染。每个段上显示的数字给出每个组中个人的绝对计数。（B） 每个感染者的孢子负载。黑点表示每个_{幼虫的日志 10} 转化的单核孢子计数。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

我们在这里介绍最初在亨布里和瑞安中描述的方法，1982^年8月8日，在艾艾普提蚊子中饲养E.aedis微孢子。 本研究中使用的E.aedis菌株来源于1979年19月19日斯蒂芬·亨布里在泰国^{的原始现场收集}。该方法利用水平传播，这自然发生在E.aedis7的传输周期，以受控的方式传播寄生虫。对于不熟悉孢子外观、幼虫感染症状或成功完成多阶段饲养/给法协议所需的协调的新人，此方法可能具有挑战性。我们希望，伴随该协议的视觉辅助工具将减少研究人员的进入障碍，他们希望培养E.aedis。

我们如上文所述在艾吉普提传播了E.aedis，并量化了孝顺一代寄生虫的成功。简言之，我们孵化了E.aedis感染的E.aegypti卵子，把它们饲养^到第4个星，从受感染的幼虫中收集了单核E.aedis孢子。然后，我们通过口服摄入用这些孢子水平感染健康幼虫，并饲养水平感染的幼虫到成年。我们用血喂养受感染的成年人（父母一代），并采集卵子（孝生一代），我们假设这些卵子会垂直感染E.aedis寄生虫。我们从孝感一代孵化出卵子，在幼崽是第4个星时，采集并^同化了一部分幼虫。我们量化了感染E.aedis的幼虫百分比和所有感染者的总孢子数。我们发现绝大多数（96%）被感染者，被感染幼虫平均孢子负荷为+10^5。我们的结论是，我们的饲养协议在艾吉普提蚊子中非常成功地传播了E.aedis。

此协议有多个方面对未启动的用户可能特别具有挑战性。我们提供以下一些可能提供帮助的其他信息。对于一般蚊子饲养的问题，Ae. aegypti菌落维护的完整指南超出了本协议的范围。然而，许多常见问题可以通过来自生物防御和新兴感染研究资源^{库16，17的资源可以}解决，包括卵子孵化，一般饮食需求，住房和环境条件，以及血液喂养。关于感染的时间表，从受感染的卵子中孵化的幼虫直到4号星期^{后期才出现}感染迹象。在1~2天中，核糖孢子迅速出现。幼虫在孵化后6天可能看起来几乎未感染，但在第7天或第8天孵化后感染高度。此外，在均质样品中可视化孢子可能具有挑战性，因为整个蚊子同质质中存在许多其他微生物，包括与E. aedis单核孢子大小相类似的其他真核单细胞生物（例如酵母）。E.aedis孢子的独特形状（图2A）是一种高度可靠的识别方法，有助于将E.aedis与同质质的其他微生物区分开来。虽然不需要进行鉴定或定量，但如果需要孢子纯化，可以通过胶体二氧化硅密度梯度离心实现，从而允许将E.aedis孢子与同质质的其他污染元素分离。这个过程在Salter等人^{20中详细描述了}。

在饲养实践中使用的温度和饮食在实验室之间通常有所不同，但变异仍可能产生成功的寄生虫传播。幼虫食物类型的细微差异不会干扰成功感染，尽管我们没有明确测试此协议中不同的食物类型。温度对感染的影响已经过测试，在21日的广泛温度下，发现 E.aedis 感染^是健壮的。最大孢子产量发生在30.8 °C，但在饲养温度低至20°C时仍然强劲。 孢子计数在较高的饲养温度（36°C）下显著减少，因此本协议应避免这些温度。

在使用寄生虫时，污染始终是一个问题。 E. aedis 是 Ae. aegypti 的一种成功的寄生虫 ，因此必须与未受感染的实验室菌落分开以防止污染。如果可能，我们建议将受感染的蚊子储存在单独的孵化器中。我们还建议，用于微孢子工作的材料（如幼虫托盘、转移移液管、笼子、鸡蛋收集杯）指定用于微孢子工作，而不是在整个昆虫中更广泛地使用。所有饲养材料应在使用后用 10% 漂白剂消毒，并可用于补充漂白剂灭菌。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mL Specimen cup	McKesson	911759	Inexpensive alternative to beaker
150 mL beakers	VWR	10754-950	For larval dosing
2 oz round glass bottle	VWR	10862-502	Bottle for 10% sucrose in adult cages
3 oz. emergence cup	Henry-Schein	1201502	For transfer of pupae to cage
Adult mosquito cages	Bioquip	1462 or 1450ASV	For adult housing
Autoclave			For sterilization
Bleach			For sterilization
Brewer’s yeast	Solgar		For feeding larvae during dosing
Controlled rearing chamber	Tritech	DT2-MP-47L	Inexpensive small rearing chamber
Cotton roll	VWR	470161-446	Wick for sugar bottles
Defibrinated rabbit blood	Fisher	50863762	For blood feeding adults
Disodium ATP, crystalline	Sigma-Aldrich	A26209-5G	For blood feeding adults
Dry cat food	9Lives	Indoor Complete	For general larval rearing
Fish food flakes	TetraMin		For general larval rearing
Hemocytometer	Fisher	267110	For counting spores
Homogenizer/mixer motor	VWR	47747-370	For homogenizing infected larvae
Larval rearing trays	Sterillite	1961	Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4"
Liver powder	NOW foods	2450	For feeding larvae during dosing
Pipette 1 - 10µL	VWR	89079-962	For larval dosing
Pipette 100 - 1000µL	VWR	89079-974	For food during larval dosing
Pipette tips 1 - 10µL	VWR	10017-042	For larval dosing
Pipette tips 100 - 1000µL	VWR	10017-048	For food during larval dosing
Plastic pestles	VWR	89093-446	For homogenizing infected larvae
Sucrose, crystalline	Life Technologies	15503022	For adult feeding
Transfer pipet	VWR	414004-033	For larval transfer, must trim ends