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Method Article
该协议详细介绍了一种经过调整的方法,用于提取、扩展和冷冻保存通过区分人类诱导的多能干细胞而获得的大脑微血管内皮细胞,并研究 前体内 的血脑屏障特性。
脑微血管内皮细胞(BMECs)可以与人类诱导的多能干细胞(iPSCs)分化,以开发用于研究血脑屏障(BBB)功能 的前体内 细胞模型。此修改的协议提供了详细步骤,使用与先前协议中报告的不同供体和试剂从人类 iPSC 中提取、扩展和低温保存 BMEC。iPSC用必需的6种介质治疗4天,然后用2天人类无内皮血清培养基补充基本成纤维细胞生长因子、视网膜酸和B27补充剂。在第6天,细胞被分培养到胶原蛋白/纤维素基质上2天。免疫细胞化学在第8天进行,使用CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1和SLC2A1进行BMEC标记分析。执行西方印迹以确认 BMEC 标记表达,以及缺少 SOX17,这是一种内皮标记。血管生成潜力通过发芽检测进行证明。从第 7 天开始使用筷子电极和伏托姆计测量跨内皮电阻 (TEER)。ATP 绑定盒式子家庭 B 成员 1 和 ATP 绑定盒式子家庭 C 成员 1 的 Efflux 运输器活动在第 8 天使用多板读取器进行测量。BMEC 的成功衍生通过相关细胞标记的存在、SOX17 的低水平、血管生成潜力、运输器活性和 TEER 值 ~2000 Ω x cm2来证实。BMEC 被扩展至第 10 天,然后传递到新涂层的胶原蛋白/纤维素板或低温保存。该协议表明,iPSC 衍生的 BMEC 至少可以扩展和通过一次。然而,在低温保存后,观察到低TEER值较低,BMEC标记的本地化较差。BMEC可用于与其他细胞类型(神经元、胶质、心室)的共培养实验, 用于三维大脑模型(器官芯片和水凝胶),用于脑器官的血管化,以及神经精神病中的BBB功能障碍研究。
血脑屏障功能
血脑屏障(BBB)形成了一个边界,限制物质从血液向大脑的移动。BBB由大脑微血管内皮细胞(BMECs)组成,形成血管内单层。BMEC与星形细胞、神经元、近层细胞、微胶质和细胞外基质一起形成神经血管单元。BMEC具有一个严格监管的半细胞结构,允许BBB保持高跨内皮电阻(TEER),这限制了被动扩散,并作为屏障完整性的指标1,2。BMEC还含有蛋白质,有助于细胞外运动,如内分泌、转细胞增多症和移位,以及白细胞在免疫反应3期间的外流。BMEC依靠流入和排泄运输机来滋养和清除废物,以维持大脑的平衡。例如, 溶质载体家庭 2 成员 1 (SLC2A1) 是负责葡萄糖在 BBB4中移动的涌入运输机,而 EFFLUX 运输器(如 ATP 绑定盒式子家庭 B 成员 1 (ABCB1) 和 ATP 绑定盒式子家庭 C 成员 1 (ABCC1) 负责将基板返回血流 3、5、6、7。ABCB1基质包括吗啡、紫杉醇4和抗精神病药,如奥兰沙平和利司酮8,而ABCC1运输机有各种基质,包括硫酸盐结合体、葡萄糖氨酸和葡萄糖苷结合物4。
BBB模型在精神疾病中的应用
BBB功能障碍已牵连到一些神经和精神疾病,包括精神分裂症和双相情感障碍9,10。最近,iPSC衍生的外体细胞模型被用来询问精神疾病的细胞和分子基础,但这些模型目前没有考虑到神经血管11,12,13所发挥的潜在作用。据推测,血液中循环的外周炎症细胞因子会对BBB14、15、16、17产生不利影响,但也有证据表明,准细胞18、19、20、21、22、转细胞23、24、25、26、27、28、29和细胞外矩阵20、29、30、31、32异常导致BBB功能障碍。BBB的破坏可能导致血液进入脑膜瘤和激活星形细胞和/或微胶质释放前炎细胞因子,这反过来启动炎症反应33,可以对大脑34产生有害影响。BMEC 是 BBB 的主要成分,检查这些细胞的结构和功能可以增进对神经和精神疾病中 BBB 功能障碍的理解。
替代 BMEC 型号
在制定从 iPSC1 、6 、35、36中推导 BMEC 的有效协议之前,研究人员曾使用不朽的 BMEC37来研究 BBB 功能。然而,许多这些模型未能达到理想的BBB表型,这种生理范围的TER值38,39。利用iPSC具有保留细胞从中提取个体的遗传背景的优点。科学家们正在积极研究建立iPSC衍生的外生微环境模型,这些模型可以重述人脑的结构和功能。研究人员已经开发出一些方法来推导结构和生理上与体内发现的BMEC相似的生物元。获得iPSC衍生BMEC纯化种群的方法需要采取一些不同的步骤,在过去几年中优化了协议1、6、35、36。一般来说,iPSC衍生的 BMECs 在基本 6 (E6) 介质中培养 4 天,然后在人类无皮血清介质 (hESFM) 中培养 2 天,辅以基本的成纤维细胞生长因子 (bFGF)、转氨酸 (RA) 和 B27 补充剂。然后,这些细胞在胶原蛋白 IV (COL4) 和纤维素 (FN) 基质上培养,以获得 + 90% 均匀的 BMECs1。
BMEC的身份通过免疫荧光得到确认,显示BMEC蛋白的共同表达,包括血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM1)、SLC2A1和紧密结蛋白,如紧密结蛋白1(TJP1)、奥克鲁丁(OCLN)和克劳丁-5(CLDN5)6。发芽检测已用于确认 iPSC 衍生 BMEC 的血管生成潜力。6 BMEC 的 BBB 完整性由体外TEER 值 (+2000Ω x cm2)37的存在和 ABCB1 和 ABCC11、6、36等流体运输机的可测量活性进行评估。利普曼小组最近的方法进展导致iPSC衍生的BMEC协议,减少了实验变异性和增强了可重复性1。然而,不知道它们是否可以扩展到和通过超越子培养阶段。我们修改后的协议旨在通过第 8 天之后通过 iPSC 衍生的 BMEC 并评估它们是否可以进一步扩大以保留低温保存后的 BBB 属性来解决这个问题。虽然没有研究描述iPSC衍生的BMEC的传递,但BMEC冷冻保存存在一个协议,该协议在经历冻结-结冰周期40后保留生理BBB特性。但是,尚不清楚低温后保存 BMEC 是否可以通过并保留 BBB 属性。
利用利普曼协议从iPSC中提取的BMEC已被用于模拟BBB在神经紊乱中的紊乱,如亨廷顿舞蹈症7。这些由 iPSC 衍生的 BMEC 也被用来研究细菌感染的影响,如奈塞里亚脑膜炎或B 组链球菌对血液-CSF 屏障和 BBB 的破坏分别41,42。此外,研究人员利用来自22q删除综合征精神分裂症患者的iPSC衍生的BMECs,观察到细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的增加,这是BMEC中一种主要的粘附分子,有助于白细胞进入大脑43。综合起来,这些研究表明,iPSC衍生的BMECs对于研究复杂神经精神病的BBB干扰有用。
人类iPSC是根据马萨诸塞州总医院和麦克莱恩医院机构审查委员会批准的协议从健康捐赠者的成纤维细胞中重新编程的,其特征在先前的研究中被描述为44、45、46。
注:简言之,成纤维细胞通过基于mRNA的基因再编程47重新编程到iPSC。iPSC 保存在干细胞介质 (SCM) (见材料列表)中,并储存在 ±1.2 x 102 细胞/mL 的密度中,具有 1 mL 的 SCM, 10 μM 与 rho 相关的蛋白激酶抑制剂 (ROCKi) Y-27632 和 10% (v/v) 二甲基硫化物 (DMSO), 在低温小瓶液氮在 -160 °C. 除非另有说明,否则以下所有程序均在生物安全柜中执行。
1. 地下室膜矩阵稀释和板涂层
2. iPSC 维护
注:6井平底板中每口井的最大汇合量为~1.2 x 106 单元。
3. iPSC 与 BMEC 的区分
注:非酶EDTA将细胞分离成团块。酶EDTA(见 材料表)将细胞分离成单细胞悬浮。视网膜酸(RA)应受到保护,免受光线照射。
4. 涂层胶原蛋白 IV (COL4) 和纤维素 (FN) 矩阵,用于净化 iPSC 衍生的 BMEC
5. iPSC 衍生 BMEC 的亚培养和净化
注:根据分化第6天细胞的结合情况,用酶EDTA孵化可能需要超过15分钟的时间。
6. 发芽检测
7. 免疫细胞化学(ICC)
注:ICC在24口井平底板上进行。
8. TEER 测量和分析
注:康宁12-Transwell过滤板配有由1.12厘米2 聚乙烯四甲酸酯膜和0.4微米孔隙组成的过滤器。TEER 测量是在技术(每口井 3 口)和生物复制(每细胞系 3 口井和/或条件)中获得的。
9. Efflux 运输机活动和分析
注:Efflux 运输器活动检测在 24 井平底板上执行。感兴趣的埃夫勒克斯运输商包括 ABCB1 和 ABCC1。建议每个条件应与控制井(即没有相应抑制剂的空白井)一起进行三重处理。
10. 通过、扩展和冷冻保存 BMEC
BMEC 差异化
应精确遵循此协议中的几个关键步骤(图1)。第 1 天的 E6 介质使用很重要,因为它通常用于在相对较短的时间内从 iPSC 中提取神经直肠系,从而在多个细胞系36中产生可重复的结果。另一个重要步骤是在差异化的第 4 天,其中 E6 介质应切换到带有稀释 (1:200) B27、20 ng/mL bFGF 和 10 μM RA 以扩展 iPSC 衍生的 BMEC 的 hESFM。增加B27补充?...
修改和故障排除
在此协议中,我们在 iPSC 培养过程中使用常用的细胞外矩阵和细胞培养介质进行一些修改,以获取 BMEC(图1)。这些变化并没有影响从人类iPSC中提取BMECS的能力,如利普曼协议1所述。来自不同健康捐赠者的 iPSC 线用于证明此修改的协议显示的结果可与其他行1的先前研究相媲美。对于冷冻?...
作者没有什么可透露的。
这项工作得到了国家精神卫生研究所创新新科学家生物行为研究奖(BRAINS)奖R01MH113858(R.K.),国家卫生研究院奖KL2 TR002542(PL)的支持。国家精神卫生研究所临床科学家发展奖K08MH086846(R.K.),悉尼R Baer Jr基金会赠款(给P.L.)多丽丝杜克慈善基金会临床科学家发展奖(给R.K.),瑞安·利希特桑双极基金会(给R.K.),菲利斯和 杰罗姆·莱尔·拉帕波特基金会(R.K.)、哈佛干细胞研究所(R.K.)和史蒂夫·威利斯和伊莉莎·弗洛伊德(R.K.)。我们感谢安妮·卡图里亚博士对手稿的批判性阅读和反馈。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | |
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A-31572 | |
B27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb | Cell Signaling | 3528S | |
CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 8670 | |
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) | Corning | 353046 | |
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) | Corning | 353047 | |
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) | Corning | 3460 | |
Countess slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
DMEM/F12 (without phenol red) | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F2442 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Human endothelial serum-free medium | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Services | 15710 | |
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
Recombinant Human VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
Versene solution | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
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