无转基因生成血液衍生神经元细胞

摘要

我们提出了一种无转基因（无转基因）的方法，从重新编程的周围血细胞中获取具有神经元表型的细胞。激活与新型人类GPI相关蛋白质相关的信号通路，揭示了获得人类多能干细胞的高效无转基因方法。

摘要

许多人类神经系统疾病是由大脑中神经元和胶质细胞的退化引起的。由于药理学和其他治疗策略的限制，目前没有治疗受伤或患病的大脑的方法。细胞置换似乎是神经退行性疾病的有希望的治疗策略。时至今日，神经干细胞（NSC）已经成功地从胎儿组织、人类胚胎细胞（ES）或诱导多能干细胞（iPSC）中产生。通过激活新的人类GPI相关糖蛋白，导致多能干细胞的产生，启动了分化过程。这些血液衍生的多能干细胞（BD-PSCs） 在体外 分化成具有神经表型的细胞，亮场和免疫荧光显微镜就证明了这一点。通过电子显微镜对这些细胞进行超结构分析，证实了它们的原始结构以及神经元样形态和亚细胞特征。

引言

基础和临床前干细胞研究方法的开发鼓励了基于干细胞的神经系统疾病疗法的临床应用。这种潜在的治疗关键取决于人类神经细胞的生成方法，导致功能恢复^1。

神经干细胞（NSC）在称为成人神经生成的过程中，自更新并终生分化成新的神经元。只有非常有限的大脑区域才拥有 NSC，能够在成年后产生新生儿神经元。这种 NSC 可以产生成熟的神经元，这些神经元涉及学习和记忆，从而取代丢失或损坏的神经元。不幸的是，这些NSC存在数量有限，这种有限的神经发生在青少年发育过程中迅速减少^2。因此，神经细胞的其他来源必须在细胞治疗目标中考虑。

退行性神经系统疾病难以使用标准药理学方法治愈。接受许多不动的神经系统疾病的新治疗策略基于疾病和受伤组织的细胞替代疗法。NSC移植可以取代受损的细胞，并提供有益的效果。神经细胞替代的其他来源包括人类胚胎干细胞（ESC），它来自哺乳动物胚泡³的内细胞质量，以及iPSC4，它们具有广泛的自我更新能力，如ESC，能够分化成不同的细胞谱系。NSC也可以通过直接重新编程从人类成纤维细胞产生，避免多能状态^5。

细胞替代疗法仍然是一个具有挑战性的问题。虽然ESC、胎儿或iPS可以成为治疗许多不治之症的神经元细胞的来源，但自体成人SC细胞替代受损组织是规避免疫、伦理和安全问题的更好选择。

通过PLC+/PI3K/Akt/mTor/PTEN的磷酸化，通过抗体交叉链接激活人类GPI相关蛋白质，启动血液祖细胞的分化和血液衍生多能干细胞（BD-PSCs）6的生成。这些细胞通过亮场、免疫荧光和传输电子显微镜 （TEM） 分析确认，在体外向神经元细胞分化。

在这项研究中，我们描述了无转基因的BD-PSCs生成及其成功重新分化成具有神经元表型的细胞。

研究方案

在进行实验时获得了伦理学的批准。

1. 分离人类外周血单核细胞（PBMNCs）

1. 确保所有献血者在血液提取前签署知情同意书，以符合机构准则。
2. 根据标准协议，由训练有素的医务人员从健康献血者手中取出30兆L的血液。
3. 通过密度梯度介质隔离 PBMNC。使用 10 mL 的介质，25 mL 的 1:1 血液稀释磷酸盐缓冲盐水 （PBS），离心机在 300 x g 30 分钟。
4. 通过管道隔离等离子体和密度梯度介质之间的相间层。用5兆L的无菌PBS和离心机在300×g下清洗分离的细胞，10分钟重复两次。
5. 使用计数室使用标准方法计算细胞数。

2. 通过在 PBMNC 表面的抗体交叉链接激活人体 GPI 锚定糖蛋白

1. 将 6 x 10⁶ 单核细胞 （MNCs） 放入 15 mL 管中，通过在 PBS 中用人类 GPI 链接膜蛋白特异性抗体 （30 μg/mL） 孵育细胞，在 37 °C 下用 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 进行抗体交叉链接。
2. 用伊斯科夫改良的杜尔贝科介质替换孵化介质，辅以10%的胎儿牛血清（FBS）。
3. 在 15 mL 聚苯乙烯管中生长细胞，将管子在 37 °C 和 5% CO₂ 的孵化器中放置 8-10 天（不摇晃）。在 D5 上，在每 15 mL 管中再添加 1-2 mL 的 Iscove 介质，并辅以 10% FBS。

3. 对新生成的分化细胞进行排序

1. 用自动电池计数器（18 μL 细胞悬浮 + 2 μL 荧光染料）或计数室中计算细胞。
2. 离心培养细胞悬架（5-7 x 10^6）在300×g 10分钟，并吸气产生的超高纳特与无菌巴斯德移液器。
3. 将细胞颗粒重新悬挂在预冷却 PBS pH 7.2、0.5% BSA 和 2 m M EDTA 的 90 μL 中。
4. 将CD45正纳米大小的磁珠（80微升）加入细胞悬浮物中，在冰上孵育15分钟。
5. 通过在 300 x g 下添加 2 mL 的 PBS 缓冲器和离心机来清洗电池 10 分钟。
6. 将细胞重新悬挂在 500 μL 的 PBS 缓冲器中。
7. 用 500 μL 预冷却 PBS 缓冲器清洗柱子，并将其放置在磁场中。
8. 将电池悬架放在柱子上，用 500 μL 的 PBS 缓冲器（两次）和包含 CD45 负细胞的离心机流清洗。收集他们在伊斯科夫的介质补充1%的BSA。
9. 数计数室中的细胞。

4. 为新生成干细胞的神经元分化准备细胞培养皿

1. 用多L-兽人及层压素涂抹培养血管，以生长神经元细胞。
2. 将玻璃盖唇放在 4 井板中，涂上 1:5 稀释的多 L-ornithine（0.1 毫克/毫升（ddH₂O），在 ddH₂O 中将盖片放入 37 °C 孵化器中 1 小时。然后用 ddh₂O 清洗。
3. 慢慢解冻层压素（0.5-2.0毫克/毫升），并添加到盖片顶部。在 37 °C 下孵育 2 小时。
4. 准备神经感应介质N2，包括49 mL的D-MEM/F12，500微升的N2补充剂，400微升的非必需氨基酸（NEAA），基本FGF溶液在20 ng/mL最终浓度（从100微克/mL库存溶液中制备），肝素在2 ng/mL最终浓度。
5. 通过管道去除多余的层压素，并在培养皿中加入神经元介质N2。

5. 培养神经元分化血细胞

1. 培养BD衍生的CD45负细胞在层压素/兽人涂层玻璃盖片上2天在37°C的孵化器和5%的_CO2 在N2介质启动新BD生成细胞的神经元分化。
2. 神经元分化介质中的培养细胞进一步包括 48 mL 神经基础介质、500 微升 L-谷氨酰胺、1 mL B27 补充剂、500 微升 NEAA， 50 μL 重组人类胶质衍生神经营养因子 （GDNF） 在 PBS/0.1% BSA 中的 5 μg/250 μL 和 50 μL 重组人脑 衍生神经营养因子 （BDNF） 在 PBS/0.1% BSA 中为 5 μg/200 μL，在 PBS 中为 50 μL 的抗坏血酸溶液 2.9 g/50 mL。将板材放在37°C和5%CO2的孵化器中。

6. 血液衍生神经细胞免疫荧光显微镜分析

1. 培养上述细胞16天，并删除介质。
   1. 用预热固定剂孵育，包括75mL的无菌水，4克的副甲醛。根据需要添加 10 N NaOH 并搅拌，直到溶液清除。然后加入 10 mL 的 10 倍 PBS、0.5 mL 的 MgCl_2、2 mL 的 0.5 M EGTA 和 4 克蔗糖。据马尔琴科等人^说，Titrate到pH 7.4与6N HCl，并带来100ml的无菌水15分钟。
   2. 丢弃固定剂，每次洗3次细胞5分钟。立即添加新鲜制作的 0.3% Triton X 溶液，使细胞渗透 5 分钟。用 PBS 清洗 3 次，并添加由 PBS 和 5% BSA 制成的阻塞解决方案。
   3. 在室温下将细胞在摇摇盘上阻挡1小时。
   4. 在 1% BSA/PBS 中准备适当的抗体稀释，并在室温下用抗体稀释在摇板上孵育 1.5 小时的细胞。用 PBS 清洗细胞 3 次，每次 5 分钟，用 DAPI 孵育细胞，然后用安装介质安装盖片，在显微镜上进行可视化。
      注:本实验中使用的直接标记抗体列在 材料表中。

7. 新生成细胞的传输电子显微镜分析

1. 在 8 井室幻灯片中为 TEM 种子细胞。
2. 在 37 °C 下将 3.5% 谷胱甘肽中的细胞修复 1 小时，在室温下在 2% OsO₄ 中修复后再修复一小时，在 4 °C 时在 2°C 下在 2 小时 30 分钟在黑暗中染色 2% 的醋酸尿素。
3. 最后，在蒸馏水中冲洗细胞，将其脱水到乙醇中，并在一夜之间嵌入环氧树脂中。第二天将样品转移到 70 °C 烤箱 72 小时，用于树脂硬化。
4. 将嵌入的细胞培养物从室滑梯和胶水分离到咸土块。
5. 用机器切割串行半薄部分（1.5 μm），安装在玻璃滑梯上，轻轻弄脏 1% 的甲苯蓝色。
6. 胶水选择半薄部分到咸土块，并通过反复冻结（液氮）和解冻将其从玻璃滑梯中分离出来。
7. 使用机器准备超音速部分（0.06-0.08 μm），并与铅柠檬酸盐进一步对比。
8. 使用数码相机使用电子扫描显微镜获取显微图。

结果

研究结果证明，这种新型的无转基因方法能够将血液祖细胞恢复到最原始的状态，而无需直接作用于人类基因组。

我们之前已经表明，GPI链接蛋白特异性抗体交叉链接启动通过PLC+/IP3K/Akt/mTOR/PTEN对高度保存的发展相关基因，如WNT，NOTCH和C-Kit进行调节，从而启动分化过程，导致HSC的第一步，以及BD-PSc^6，8的第二步和最后一代。<...

讨论

本工作中描述的非转基因人体细胞重新编程方法基于GPI链接的人类膜糖蛋白背后的信号机制的膜到细胞核活化，该机制启动分化过程，导致从非受操纵的人类外周血液中获取的自续PC 的体外 生成和扩展。这些细胞在适当的介质中培养时，能够重新分化成属于不同生殖层⁶的细胞。

本研究中提供的数据表明，在神经元分化介质中培养时，无转基因生成的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400