准备和注射 Culex 蚊子的胚胎，使用CRISPR/Cas9产生空突变

摘要

CRISPR/Cas9越来越多地用于非模型生物体的基因功能特征。该协议描述了如何产生 Culex皮皮恩斯的淘汰线，从准备注射混合，获得和注射蚊子胚胎，以及如何后方，交叉和屏幕注射蚊子及其后代所需的突变。

摘要

Culex 蚊子是多种疾病的主要传播媒介，这些疾病对人类和动物健康产生了负面影响，包括西尼罗河病毒和由犬心虫和象虫病等纤维线虫引起的疾病。最近，CRISPR/Cas9基因组编辑被用来诱导现场定向突变，通过注射一种Cas9蛋白，该蛋白质已经与导引RNA（gRNA）复合成几个昆虫物种的新鲜胚胎，包括属于 阿诺菲勒斯 家族和 伊蚊的蚊子。操纵和注射 Culex 蚊子稍微困难一些，因为这些蚊子将卵子直立在木筏上，而不是像其他种类的蚊子那样单独。在这里，我们描述如何设计gRNA，用Cas9蛋白复合它们，诱导 Culex皮皮恩斯 雌性蚊子产卵，以及如何准备和注射新铺设的胚胎与Cas9/gRNA进行微注射。我们还描述了如何饲养和筛选注射蚊子的所需突变。具有代表性的结果表明，该技术可用于诱导 Culex 蚊子基因组中的部位定向突变，并稍作修改，也可用于在其他蚊子物种中产生空突变体。

引言

Culex蚊子分布在世界各地的温带和热带地区，传播几种致命的病毒，包括西尼罗河病毒^1，圣路易斯脑炎^2，以及引起犬心虫³和象虫^病4的线虫。库莱克斯皮皮恩斯综合体的成员，其中包括Cx.五角星，Cx.皮皮恩斯皮皮恩斯和Cx.皮皮恩斯摩尔斯，显示其生物学的许多方面惊人的变化。例如，虽然Cx.五角星和Cx.皮皮恩斯骚扰者不能进入过冬的休眠^5，6，Cx.皮皮恩斯皮皮恩斯显示强大的季节性反应，并进入糖尿病，以回应短天^7，8。此外，Cx.皮皮恩斯的骚扰往往更人为的，而Cx.皮皮恩斯和Cx.五角星更动物性^6。然而，在美国和世界许多其他地方，这些物种杂交，这对疾病传播有很强的影响，因为Cx.pipiens皮皮恩斯和Cx.皮皮恩斯的杂交是....

研究方案

在大多数研究机构中，在产生或维持转基因昆虫之前，必须制定经批准的《生物安全议定书》，以确保转基因生物不会逃逸或被从实验室设施中移走。政府的其他法规也可能适用。在开始这种性质的项目之前，检查所有机构政策和程序，以确定需要哪些文件和批准。

1. 设计 gRNA 和准备注射混合物

1. 为每个目标基因设计 2-5 gRNA，因为某些 gRNA 比其他基因工作得更好。针对感兴趣基因的 gRNA 可以手动设计，也可以使用免费程序（如斩波）。
2. 设计和订购引物，将放大每个 gRNA 周围的 100-200 bp 片段。理想情况下，切割站点应位于 PCR 产品的中间三分之一到一半。请注意，切割的每个站点将产生多少 bp。
3. 获取 gRNA。
   1. 从综合DNA技术、费舍尔科学、基因记录等商业公司购买 gRNA。这是最简单的选择。
   2. 或者，使用 PCR 放大在实验室中创建 gRNA，以生成后续等热合成的模板。请参阅波特等人描述的²¹ 号和基斯特勒等人^22号议定书。
   3. 通过注入胚胎的质粒提供 gRNA。在这种情况下，gRNA 应由 U6 促销器驱动（详情请参阅 23、24）。

结果

使用上述协议，我们成功地注射了Cx.pipiens的胚胎，并观察到注射胚胎的存活率很高（+55%，图1）。早期的试验存活率较低，可能是因为卵泡前部附着在医用敷料条上，防止蚊子幼虫从胆汁中逸出并成功游入水中。确保前端延伸到医疗敷料条外，大大提高了幼虫的存活率，并导致高质量的后代，能够发展到成年和繁殖（图2B）。

讨论

该协议提出了将特定突变引入 Culex 蚊子基因组的方法，也可用于编辑其他蚊子的基因组。该协议意义重大，因为它不仅提供了如何准备注射材料的具体细节，而且还提供了如何诱导蚊子产卵以及如何准备和注射这些卵子的详细视频概述。我们还总结了如何利用雌性 Cx.pipiens 的生物学在单独的木筏上产卵，从而筛选出每个雌性子的较小比例的后代，以寻找所需的突变。这里提出的方法.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Membrane Feeder	Hemotek	SP5W1-3	Company location: Blackburn, UK
ATP	Invitrogen	18330019	Company location: Carlsbad, CA, USA
Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	World Precision Instruments	1B100-6	Company Location: Sarasota, FL, USA
BV10 Needle Beveler	Sutter Instruments	BV-10-B	Company Location: Nobato, CA, USA
Whatman Circular filter paper (12.5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Company Location: St. Louis, MO, USA
Conical tube (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	Company Location: Waltham, MA, USA
Fisherbrand course filter paper with fast flow rate	Thermo Fisher Scientific	09-800	Company Location: Waltham, MA, USA
Cover glass (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Company Location: Waltham, MA, USA
Dental dam	Henry Schein Inc	1010171	Company Location: Melville, NY USA
Scotch double-sided tape	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Company Location: Waltham, MA, USA
FemtoJet 4i microinjector	Eppendorf	5252000021	Company Location: Hamburg, Germany
Glass vial (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Company Location: Waltham, MA, USA
Halocarbon oil	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
P-2000 Laser Needle Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Company Location: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Company Location: Waltham, MA, USA
PC-100 Weighted Needle Puller	Narishige	PC-100	This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA
Phire Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F140WH	Company Location: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Company Location: Waltham, MA, USA
Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter	Capillary Tube Supplies Limited	QGCT 1.0	Company Location: Cornwall, UK
Guide-it™ sgRNA Screening Kit	Takara, Bio USA	632639	This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Company Location: St. Louis, MO, USA
Small petri dishes (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Company Location: Waltham, MA, USA
Sodium citrate chicken blood	Lampire biologicals	7201406	Company Location: Everett, PA, USA
Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Company Location: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Company Location: Melville, NY USA
Tropical fish food	Tetramin	N/A
Whatman filter paper	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Company Location: Waltham, MA, USA
Whatman filter paper, 4.25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Company Location: St. Louis, MO, USA