小鼠河马兴奋和类特异性抑制神经元的不同组织型切片培养的单细胞电位

摘要

这里介绍的是一个单细胞电位化协议，可以在一系列体外海马切片培养年龄内提供兴奋和抑制神经元的基因。我们的方法提供精确和高效的基因表达在单个细胞，可用于检查细胞自主和细胞间功能。

摘要

电电已成为将特定基因转移到细胞中以了解其功能的关键方法。在这里，我们描述了一种单细胞电聚技术，它最大限度地提高了小鼠组织型海马切片培养中兴奋和类特异性抑制神经元的体外基因转染效率（+80%）。我们使用大玻璃电极、含四毒素的人工脑脊液和轻度电脉冲，将感兴趣的基因传递到培养的海马CA1金字塔神经元和抑制内窥镜中。此外，电聚可以在培养海马切片中进行长达21天的体外，而不会降低转染效率，从而可以研究不同的切片培养发育阶段。随着对检查不同细胞类型基因的分子功能的兴趣日益浓厚，我们的方法演示了一种可靠而直接的方法，可以在小鼠脑组织中进行体外基因转换，该方法可以使用现有的电生理学设备和技术进行。

引言

在分子生物学中，研究者最重要的考虑因素之一是如何将感兴趣的基因传递到细胞或细胞群中，以阐明其功能。不同的分娩方法可分为生物（如病毒载体）、化学（如磷酸钙或脂质）或物理（如电浸、微注射或生物毒性^）1、2。生物方法效率高，可以是细胞类型特异性，但受特定遗传工具的发展的限制。化学方法在体外非常强大，但变染通常是随机的:此外，这些方法大多只保留给原细胞。在物理方法中，从技术角度来看，生物处理是最简单和最简单的，但再次以相对较低的效率产生随机转染结果。对于需要转移到特定细胞而不需要开发遗传工具的应用，我们期待单细胞电聚变^3，4。

过去二十年来，电聚变只指场电电，而已开发出多个体外和体内单细胞电电化方案，以提高^5、6、7的特异性和效率，证明电电化可用于将基因转移到单个细胞，因此，可以非常精确。然而，这些程序在技术上要求高、耗时、效率低下。事实上，最近的论文已经调查了机械化电镀钻机^8，9的可行性，这可以帮助消除其中几个障碍，调查人员有兴趣安装这样的机器人。但对于那些寻找更简单的方法的人来说，电透电的问题，即细胞死亡、转染失败和移液器堵塞，仍然是一个问题。

我们最近开发出一种电透法，它使用大倾玻璃移液器、较温和的电脉冲参数和独特的压力循环步骤，在兴奋神经元中产生的转染效率比之前的方法高得多，并使我们能够首次在抑制性内窥镜中转染基因，包括小鼠组织性切片培养¹⁰海马CA1区域的索马托他汀表达抑制内周素。然而，这种电位法在不同抑制性内膜类型和神经元发育阶段的可靠性尚未得到解决。在这里，我们证明了这种电位技术能够将基因转化为兴奋神经元和不同类别的内窥神经。重要的是，无论在体外（DIV）切片培养年龄测试天数，转染效率都很高。这种既定的、用户友好的技术强烈推荐给任何有兴趣在体外小鼠脑组织环境中使用不同细胞类型的单细胞电聚变的调查员。

研究方案

所有动物协议都经过马萨诸塞大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。切片培养制备、质粒制备和电位也详细介绍了我们以前发布的方法，并可以参考其他信息^10。

1. 切片文化准备

1. 准备小鼠组织型海马片培养，如前所述^11，使用产后6至7天大的男女小鼠。
   1. 为由 （在 mM 中）: 238 蔗糖组成的有机切片培养物准备解剖介质， 2.5 KCl， 1 CaCl₂， 4 MgCl₂， 26 NaHCO₃， 1 NaH₂PO₄， 和 11 葡萄糖在去离子水中， 然后气体与 5% CO₂/95% O₂ 到 pH 值 7.4。
   2. 准备有机片文化介质，包括: 78.8% （v/v） 最低基本中型鹰， 20% （v/v） 马血清， 17.9 m M NaHCO₃， 26.6 mM 葡萄糖， 2 M CaCl₂， 2 M MgSO₄， 30m HEPES ， 胰岛素 （1 微克/mL）， 和 0.06 mM 抗坏血糖酸， pH 调整为 7.3.使用渗透计将渗透度调整到 310-330 渗透器。
   3. 使用两把铲子将海马从整个大脑中分离出来，然后用组织斩波器切片（400μm）。使用两个钳子将切片分离，并转移到插入器下方充满培养介质 （950 μL） 的 6 井板中的 30 mm 细胞培养插入。
2. 将有机细胞切片培养物存储在组织培养孵化器（35°C，5% CO_2）中，每两天更换一次切片培养介质。

2. 普拉斯密德准备

1. 为感兴趣的基因准备质粒。
   1. 亚克隆增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因成pCAG载体。
   2. 用无内毒素净化套件净化 pCAG-EGFP 质粒，并溶解在内部溶液中，该溶液由含有 140 mM K-甲烷硫酸盐的二乙基热碳酸酯处理水组成， 0.2 mM EGTA、2 m M MgCl₂和 10 mM HEPES，调整为 pH 7.3 与 KOH（质粒浓度:0.1 μg/μL）。

3. 玻璃移液器制备

1. 在微管式拉拔器上拉玻色硅酸盐玻璃移液器（4.5 - 8 M？）（图 1A）。
   注:用于全细胞贴片夹录音的玻璃移液器非常适合电镀。
2. 在200°C下将玻璃移液器烘烤过夜进行消毒。
3. 在解剖显微镜下检查移液器尖端的大小，以接近电阻。
   1. 可选:通过将移液器连接到电极电极，并使用微操纵器将移液器尖端操纵到含有（mM）的过滤消毒人工脑脊液（aCSF）中，验证移液器的电阻: 119 NaCl， 2.5 KCl， 0.5 CaCl₂， 5 MgCl₂， 26 NaHCO₃， 1 NaH₂PO₄ 和 11 葡萄糖在去离子水中， 气体与 5% CO₂/95% O₂ 到 pH 值 7.4.使用电极器上的读数确认实际电阻。
      注:移液器尖端越清晰，电阻越大。移液器阻力应低于 10 MΩ。具有高移液器电阻（图1B）的玻璃移液器在反复电镀时经常堵塞尖端。

4. 电镀钻机设置

1. 将电热器安装到标准的全细胞电生理学钻机上，配备直立显微镜，安装在换档台上，配有显微操纵器和永久泵。
2. 将电极器的头顶安装到微操纵器上，并将一对扬声器连接到电极器。将电击器连接到脚踏板，当准备就绪时，脚踏板可用于发送脉冲。
   注:扬声器在打开时发出音调，这是电极电阻的指示器。这使得无需将注意力从程序中移开即可确定阻力的相对变化。

5. 电镀制备

1. 将切片培养物插入从 6 个井板转移到 3 厘米的 Petri 菜肴，里面装有 900 μL 的文化介质，并储存在桌面 CO₂ 孵化器中，直到准备好进行电镀。
   1. 在 3.5 厘米的 Petri 菜肴中，用切片培养介质 （1 mL） 将新鲜培养物插入到电后培养切片中，至少 30 分钟。
2. 清洁并准备钻机进行电镀。
   1. 在开始当天的实验之前，用 10% 漂白剂将线条香水 5 分钟，对管子和腔室进行消毒。
   2. 用去离子化的自动压水灌注线条至少30分钟，以完全冲洗。
   3. 用含有0.001m四毒毒素（TTX）的过滤消毒的 ACSF 给生产线注入香水。
      注:TTX将细胞毒性和死亡降到最低，因为内周¹⁰的过度兴奋。
3. 设置电击器的脉冲参数:振幅 +5 V、方脉冲、500 ms 的列车、50 Hz 的频率和 500 μs 的脉冲宽度。
4. 将玻璃移液器填充 5 μL 含质粒的内部溶液。
   1. 通过多次轻拂和轻轻敲击尖端，从移液器尖端移除任何捕获的气泡。
   2. 通过在解剖显微镜下可视化或重复步骤 3.3.1 来检查移液器的阻力，检查尖端是否损坏。
      注:如果尖端损坏，必须丢弃玻璃移液器，并且此步骤必须重复使用以前在第 3 步中准备的新玻璃移液器。
5. 将移液器尖端牢固地连接到电极上并打开扬声器。当尖端与 aCSF 介质接触时，记录电风机的读数（移液器的电阻）。
6. 使用锋利的刀片切割培养件插入膜，并隔离一片培养。使用锋利的倾斜钳子小心地将切片培养体转移到电位室，并用切片锚固定其位置。
   1. 不要将切片培养在孵化器外每次超过30分钟，以防止副作用，如神经元健康或功能¹²的变化。

6. 感兴趣的电聚电池

1. 用嘴或使用连接到管子上的 1 mL 注射器（0.2 - 0.5 mL 压力）对移液器施加正压力。
2. 使用微操纵器的三维旋钮控制装置在切片培养件表面附近操纵移液器尖端。
3. 选择目标细胞并接近目标细胞，保持正压力，直到细胞表面形成酒窝，在显微镜上可见。
4. 执行压力循环。
   1. 通过口腔快速施加轻微的负压，使移液器尖端和等离子体膜之间形成松散的密封，通过膜向上进入移液器尖端来视觉显示。通过听扬声器音调的增加，观察移液器阻力的增加（+2.5 倍的初始阻力）。快速重新施加正压，使酒窝重新形成。
   2. 立即完成至少两个压力周期而不停顿，然后保持负压力为 1s。
      注:在周期之间暂停、施加过大的压力或将负压保持太久可能会导致严重的细胞损伤，并可能导致细胞在电电过程中死亡。
5. 当扬声器的音调达到音高中稳定的顶点时，使用脚踏板快速脉冲电极器，表示峰值电阻。在发送脉搏之前，不要在峰值阻力超过 1s 时等待。
   注:我们在使用本协议¹⁰时未观察到任何脱靶电位。只有在压力循环期间与玻璃移液器接触的细胞被转染。将移液器定位到其他神经元附近不会导致基因转染。
6. 轻轻地将移液器从细胞中收回约 100 μm，而不施加压力。
7. 重新施加正压，验证电阻是否类似于第 5.5 步中录制的读出，然后接近下一个单元格。
   1. 通过施加正压，去除电镀后通过视觉或显著增加（>15%）移液器电阻指示的潜在堵塞。
      注意:如果没有可见的堵塞，并且阻力仍然显著提高，请丢弃移液器并使用新的移液器。平均而言，如果^{用户小心谨慎}，移液器可用于多达20个电位事件。
8. 电镀后，将切片培养转移到新鲜培养件上，并在孵化器中以 35°C 孵育长达 3 天。

7. 有机海马切片培养物的固定、染色和成像

1. 修复电浸状有机细胞片培养物 2 × 转染后 3 天与 4% 的副甲醛和 4% 蔗糖在 0.01 M 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 在室温下 1.5 小时。
2. 在 0.1 M 磷酸盐缓冲区 （1x PB） 中取出 30% 蔗糖中的固定和孵化切片，使用 2 小时。
3. 将切片放在滑动玻璃上，并将滑梯玻璃放在碎干冰上将其冻结。在室温下解冻切片，并将它们转移到装满 1 倍 PBS 的 6 井板中。
4. 在 GDB 缓冲区（0.1% 明胶、0.3% Triton X-100、450 mM NaCl 和 32% 1x PB、pH 7.4）中用鼠标抗 GFP 和兔子抗 RFP 抗体在室温下 2 小时染色切片。
5. 在室温下用 1x PBS 清洗片片三次，每次洗 10 分钟。
6. 在室温下，在 GDB 缓冲区用抗鼠标 Alexa 488 结合的二级抗体和抗兔亚历克萨 594 结合的二级抗体孵育片片，持续 1 小时。在室温下用 DAPI （4 μg/mL） 在 1x PBS 中孵育片片 10 分钟。
7. 在室温下用 1x PBS 清洗切片三次，每次洗 3 分钟。
8. 使用安装介质在玻璃滑梯上安装切片并执行荧光成像。

结果

我们的单细胞电位能够精确地将基因输送到视觉识别的兴奋和抑制神经元中。我们在三个不同的时间点对三种不同的神经元细胞类型进行电击。帕瓦尔布明 （Pv） 或车辆谷氨酸类型 3 （VGT3） 表达神经元通过交叉 Pv^cre （JAX #008069） 或 VGT3^cre （JAX #018147） 线与 TdTomato （红色荧光蛋白的变体） 记者线 （Jax #007905）， 分别命名为 Pv/TdTomato 和 VGT3/TdTomato 线。从C57BL/6J、Pv/TdTomato 和 VGT3/Td...

讨论

我们在这里描述一种电击方法，它以高效率和高精度同时转导兴奋神经元和抑制神经元。我们优化的电化方案有三个创新突破，以实现高效的基因转染。我们的第一个修改是增加移液器的大小相比，以前公布的协议^3，5，6。这种变化使我们能够电化许多神经元，而无需移液器堵塞。此外，与以前的方法相比，低电阻移液器允许...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid preparation
Plasmid Purification Kit	Qiagen	12362
Organotypic slice culture preparation
6 Well Plates	GREINER BIO-ONE	657160
Dumont #5/45 Forceps	FST	#5/45	Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation
Flask Filter Unit	Millipore	SCHVU02RE	Filtration and storage of culture media
Incubator	Binder	BD C150-UL
McIlwain Tissue Chopper	TED PELLA, INC.	10180	Tissue chopper for organotypic slice culture preparation
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm	Millipore	PIHP03050	Organotypic slice culture inserts
Osmometer	Precision Systems	OSMETTE II
PTFE coated spatulas	Cole-Parmer	SK-06369-11
Scissors	FST	14958-09
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	SCGPT01RE	Filtration and storage of aCSF
Electrode preparation
Capillary Glasses	Warner Instruments	640796
Micropipetter Puller	Sutter Instrument	P-1000	Puller
Oven	Binder	BD (E2)
Puller Filament	Sutter Instrument	FB330B	Puller
Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1
3.5 mm Falcon Petri Dishes	BD Falcon	353001
Airtable	TMC	63-7512E
CCD camera	Q Imaging	Retiga-2000DC	Camera
Electroporation System	Molecular Devices	Axoporator 800A	Electroporator
Fluorescence Illumination System	Prior	Lumen 200
Manipulator	Sutter Instrument	MPC-385	Manipulator
Metamorph software	Molecular Devices		Image acquisition
Peristaltic Pump	Rainin	Dynamax, RP-2	Perfusion pump
Shifting Table	Luigs & Neuman	240 XY
Speaker	Unknown		Speakers connected to the electroporator
Stereo Microscope	Olympus	SZ30
Table Top Incubator	Thermo Scientific	MIDI 40
Upright Microscope	Olympus	BX61WI
Fluorescence imaging #2
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X710