大鼠保留鞘的视神经横断术评估轴突再生和针对视网膜神经节细胞轴突的干预措施

摘要

该协议描述了一种保留大鼠视神经鞘的视神经横断法。来自显微注射到视神经的静水压力产生完整的横断面，允许横断视神经末端的无缝合再接，并在横断模型中直接瞄准轴突隔室。

摘要

视网膜神经节细胞 （RGC） 轴突在视神经头汇聚，将视觉信息从视网膜传递到大脑。青光眼、外伤和缺血性视神经病等病态会损伤 RGC 轴突，破坏视觉刺激的传递，并导致视力丧失。模拟 RGC 轴突损伤的动物模型包括视神经挤压和横断范式。这些模型中的每一种都有其固有的优点和缺点。视神经挤压通常不如横断严重，可用于检测病变部位的轴突再生。然而，挤压力和持续时间的差异会影响组织反应，导致可重复性和病变完整性可变。视神经横断术会发生严重且可重复的损伤，完全损伤所有轴突。然而，横切视神经会侵犯视神经鞘，使视神经暴露在外周环境中，从而显着改变血脑屏障。此外，如果不重新利用切割神经末梢，就无法评估横断位点以外的再生。此外，挤压伤或横断损伤会激活不同的退行性变化和细胞通路。

这里描述的方法结合了视神经压碎和横断模型的优点，同时减轻了缺点。通过显微注射输送到视神经的静水压力完全横切视神经，同时保持视神经鞘的完整性。重新分配横切的视神经末梢以进行轴突再生测定。这种方法的一个潜在局限性是无法可视化完整的横断面，这是可变性的潜在来源。然而，目测确认视神经的可见部分已被横断表明视神经横断完全，成功率为 90-95%。该方法可用于评估横断模型中的轴突再生促进策略或研究针对轴突区室的干预措施。

引言

轴突损伤和变性发生在创伤后的视网膜神经节细胞 （RGC） 或神经退行性疾病（如青光眼）^{中 1,2}。RGC 的丢失和视网膜舌尖投影的破坏会导致永久性视力丧失³。为了了解负责退行性过程的分子途径并制定减轻轴突和 RGC 丢失或再生 RGC 轴突的策略，已使用实验动物模型来模拟视神经损伤，包括视神经挤压和视神经横断模型。在选择实验模型时，必须考虑每种方法的优缺点以及损伤激活的分子途径⁴。

开发此处描述的方法的基本原理是利用视神经粉碎⁵ 和横断⁶ 模型的优势，同时减轻缺点。该方法的目标是产生可重复的视神经损伤，其中所有轴突都毫无疑问且完全横切，最大限度地减少暴露于外周免疫系统，并且很容易重新分配视神经的横断末端以允许评估 RGC 再生。此外，该方法的开发是为了允许对受伤 RGC 的轴突部分进行区室化通路，并将轴突特异性干预（例如，神经营养因子、细胞移植）局部输送到眶后视神经。

与其他方法相比，这种技术具有多种优势。与视神经挤压相比，这种方法完全可靠地横切视神经;这解决了不希望的轴突保留⁷ 的潜在问题。此外，所描述的方法会导致严重的轴突损伤，该损伤不依赖于作者施加的力的大小和持续时间，就像挤压伤那样，从而减少了变异性⁸。与已建立的横切视神经的方法相比，本协议中详述的方法保持了视神经鞘的完整性。保留视神经鞘的一个优点是它可以防止视神经暴露于外周免疫系统。此外，视神经鞘施加在横断视神经上的机械力重新分配切割的神经末梢，而无需具有挑战性的显微外科作 ^9,10,11。最后，在视神经鞘完好无损的情况下，该方法在视神经残端之间产生一个物理空间，干细胞、神经营养因子或聚合物可以直接引入受损的 RGC 轴突。

视神经挤压是金标准模型，其中评估视神经再生策略以确定治疗的有效性。啮齿动物视神经的大小限制了可能的作，尤其是神经的横断和再适应。然而，在脊髓损伤和再生领域，人们一致认为完全横断是区分轴突再生和备用轴突¹² 的理想模型。此处描述的方法减少了在视神经横断模型中评估再生策略的技术障碍。因此，该模型可用于验证在具有视神经横断面的视神经挤压范式中确定的有前途的策略。此外，由于该模型直接针对轴突隔室，因此可以研究对受伤的成人 RGC 轴突的干预以及负责轴突退行性和再生过程的机制。

本研究中描述的视神经横断模型完全横切视神经，同时保留视神经鞘。这种新颖的方法适用于旨在在横断模型中评估轴突再生的实验，而无需重新分配视神经末梢的技术挑战性过程。该技术的各个方面类似于进行视神经挤压;因此，该方法可以由对视神经挤压有经验的作员执行。手术方法不需要专门设计的器械，可以使用现成的手术器械和显微注射系统来完成，使其易于使用且经济。

研究方案

涉及动物的程序已获得圣地亚哥退伍军人事务部医疗保健系统的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。手术器械和溶液在手术前进行消毒，以限制术后感染和并发症。

1. 手术技术

1. 使用无菌技术并根据机构特定的动物使用方案进行实验。
2. 对接触活组织的器械和材料进行消毒，以防止感染，避免对动物福利产生负面影响，并最大限度地减少对研究的潜在负面影响。用水和清洁剂或酶产品彻底清洁手术器械，以去除异物并通过蒸汽或快速灭菌进行消毒。
3. 将液体分装到组织培养罩中的无菌容器中。用 70% 乙醇冲洗微升注射器，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗，对微量注射器进行消毒。

2. 麻醉

1. 使用异氟醚蒸发器系统麻醉大鼠。使用医用级氧气以 4.5 L/min 的速率将浓度为 1% 的异氟醚汽化到连接的麻醉盒中。将动物放入麻醉箱中，直到呼吸减慢并给动物注射镇静剂。
   注意：如果作员对非镇静动物注射麻醉剂感到满意并熟悉，则不需要使用气体麻醉剂进行麻醉的初始步骤。
2. 将足量的由氯胺酮 （50 mg/kg）、甲苯噻嗪 （2.6 mg/kg） 和乙酰丙嗪 （0.5 mg/kg） 组成的麻醉混合物吸入 30 G 结核菌素注射器中。从麻醉盒中取出镇静动物。腹膜内注射麻醉剂，以在整个手术过程中获得一致的镇静深度，并将动物放回笼子。
3. 当捏脚趾未能引起反应时开始该程序。评估动物的呼吸深度和频率，并在整个手术过程中每 5 分钟捏一次脚趾，以确保没有疼痛。
4. 手术完成后，将动物从立体定位框架中取出。皮下注射生理盐水 （3 mL）、氨苄青霉素 （0.15-0.2 mg/kg） 和班那胺 （2.5-5 mg/kg） 以提供镇痛和液体支持。将动物转移到加热的培养箱中以保持体温。

3. 手术方法

1. 将大鼠（7-8 周龄，Fischer 344 菌株）放在头部立体定位框架和加热垫的顶部。将立体定位框架放置在大鼠头部面向外科医生的左侧，并将左眼眶置于手术视野的中心。
2. 在左眼滴一滴丙美卡因，并在眼睑和眼睛上涂抹 5% 聚维酮碘来清洁眼睛。将眼药膏涂抹在双眼角膜上，以保持角膜水分并防止白内障形成。
3. 将 4-0 聚乳蛋白缝合线穿过上眼睑的表皮到达眼睑边缘的中央，在后续步骤中使用该缝合线进行临时睑缝合术。使用缝合线外翻眼睑并露出上穹窿。
4. 将聚乳糖缝合线粘在立体定位框架上，以施加持续的牵引和暴露。避免过度牵引，因为这会限制眶后内容物的暴露。
5. 使用 Colibri 镊子，抬高上结膜并用一把 Vannas 剪刀沿角膜缘切开结膜。沿上缘做一个 4 点钟方向的腹膜切开术。
6. 通过沿上缘放置环形聚丙烯缝合线，使自由端位于眼球下方，对眼球施加轻微的下牵引力。腹膜切开术后沿上角膜缘的残留组织足以在缝合环上提供牵引力，而无需将缝合线穿过巩膜或角膜缘。
   1. 用 bulldog 夹固定环的末端，并让夹子在半空中自由悬挂。夹子的重量将在眼球上施加较差的牵引力，并暴露更多的眶后空间。
7. 用 Vannas 剪刀沿着巩膜钝解剖，沿着眼球的后部和上直肌下方。用 Vannas 剪刀剪断肌肉肌腱以进入眶后间隙，从而将上直肌从眼球中插入。

4. 进入视神经

1. 用 Dumont #5/45 钝器沿眼球后颞面进行钝性解剖，并确定上侧涡静脉。进一步钝化解剖鼻至上侧涡静脉，以暴露视神经周围的眼眶肌锥，避免过早损伤视神经。避免伤害涡流静脉，因为这会导致大量出血。如果发生出血，可以使用棉签涂抹器直到出血停止。
2. 使用 Dumont #5/45 镊子，小心地将尖端插入眼眶肌肉锥体的颞侧，并平行于肌纤维走行打开镊子，露出视神经。使用镊子横向移位覆盖视神经的肌纤维并完全暴露神经。确保只有视神经鞘覆盖视神经，因为残留的肌肉纤维会阻止拉动的玻璃毛细管轻易刺穿视神经。
3. 沿着神经的两侧放置两个 Dumont #5/45 镊子并打开镊子，保持神经的暴露。暴露量应允许将视神经压碎至眼球后方 1.5-2.0 毫米，并将拉动的玻璃毛细管从背侧插入视神经。

5. 横切视鞘内的视神经

1. 使用 Dumont #5/45 镊子，将尖端放在眼球后至少 1.5-2.0 毫米的视神经两侧。确保镊子的尖端跨越神经的直径。完全关闭镊子 5 秒以压碎视神经并记下压碎部位的位置。
2. 使用微量注射器，将 1–2 μL PBS 填充到玻璃拉动的毛细管移液器中，然后将移液器连接到移液器支架上。将移液器支架安装到显微作器上，并将显微作器连接到立体定位框架上。
3. 调整显微注射系统，每按一下按钮，在 20 psi 的压力下提供持续时间为 4 ms 的单个脉冲。将移液器放入手术区域。
4. 在手术镜下，使用一对 #55 镊子将移液器吸头折断并斜切至能够提供小体积但足够大的刚度以穿透视神经鞘的尺寸（~20-30 μm 直径）。通过发出单个脉冲并观察移液器吸头处的液体来确认移液器吸头的通畅性。
5. 将移液器吸头的位置调整到视神经中心中视神经挤压部位的正上方，并与视神经鞘接触。注意移液器在显微作器上的垂直位置，以便稍后确定 200 μm 的深度。
6. 降低移液器，同时观察手术镜下的尖端，直到移液器进入视神经。如果移液器吸头弯曲且缺乏穿透视神经鞘的刚度，请缩回移液器并使用一对 #55 镊子减小移液器吸头的长度并增加移液器吸头的直径。调整移液器吸头后，再次尝试用移液器穿透视神经鞘。
7. 使用移液器吸头进入视神经后，如有必要，收回移液器。如立体定向显微作器所示，移液器吸头的位置应从步骤 5.5 中记下的初始位置在视神经表面以下 200 μm。
8. 在手术镜下观察视神经的同时，使用显微注射系统施加静水压力脉冲。当施加脉冲时，应注意视神经远端和近端之间的线性分离，以验证视神经的横断面。
   注意：250-500 nL 的注射量通常足以提供横切视神经所需的力。需要超过 1 μL 的进样可能表明需要重新定位进样部位。注射到完整实质中的较大体积可能不会造成额外的 RGC 损伤，因为该方法完全横切视神经，但更有可能沿着视神经束追踪。尽管注射了足够的液体量，但仍未观察到视神经的线性横切，这可能表明移液器在挤压部位的位置错误，需要重新定位。可能还需要将注射压力增加 50%。

6. 关闭和恢复

1. 缩回移液器并取下缩回的 Dumont #5/45 镊子。从眼球上取下 bulldog 夹和环形聚丙烯缝合线，将眼睛恢复到中立位置。
2. 将结膜重新定位到角膜缘，确保释放任何已倒置的结膜，以便组织正确并置和愈合。将眼科局部抗生素软膏涂抹在眼睛上。
3. 从眼睑 4-0 聚乳蛋白缝合线上取下胶带，并将缝合线保持在原位，用于临时睑缝合术。将缝合线穿过下眼睑的眼睑边缘，穿过皮下区域，然后通过表皮排出。以刚好足够的压力系住缝合线以闭合眼睛。
4. 根据机构规程和动物护理机构指南进行术后镇痛药给药。将动物独立地安置在加热的笼子中，以便在手术后恢复。请勿将床上用品放入回收笼中，以防止意外误吸。

结果

视神经横断通常会导致 80-90% 的受伤 RGC 在受伤后 14 天内凋亡丢失。所描述的技术横切视神经，同时保持视神经鞘完整性（图1）。RGC 丢失的程度与传统的视神经横断和视神经挤压模型相当，其优点是在使用此处描述的方法横断后可以毫不费力地将切割的神经末端贴上（图 2）。以这种方式重新连接切割的视神经末梢，可以通过提供轴突可以生长的基质，并且无需显微外科作来重新连接切割的神经末梢，从而在横断模型中评估 RGC 轴突再生（图3）。使用霍乱毒素 B 亚基 （CTB） 对 RGC 轴突进行顺行追踪表明，CTB 阳性轴突在保留鞘的视神经横断后被完全横切（图4）。在横切视神经的同时保留视神经鞘还创造了一个封闭的空间，可以将研究材料（例如神经营养因子或细胞）输送到受损的 RGC 轴突并保持在适当的位置（图5）。在训练的初始阶段，预计总横断面的成功率为 60-70%。根据经验，总横断面的成功率约为 90-95%。

图 1：横切视神经，同时保留视神经鞘。 （A） 手术区域图片显示横断前完整视神经暴露。（B） 横断后视神经的图片。一根细玻璃移液器刺穿横切部位的视神经鞘，并将细胞悬液（浑浊溶液）输送到视神经末端之间的空间。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：保留视神经横断面的视神经鞘后视网膜神经节细胞丢失。 14 天前具有 （A） 完整视神经，（B） 保留视神经横断面的视神经鞘，（C） 传统视神经横断或 （D） 视神经挤压的代表性全视网膜扁平支架被免疫标记为 γ 突触核蛋白 （SNCG）。使用 10 倍物镜从荧光显微镜获得图像，校正阴影，然后拼接以生成单个图像。在病变的眼睛中，整个视网膜神经节细胞 （RGC） 体的丢失很明显。插图显示视网膜的更高放大倍率图像，并显示视神经损伤后 RGC 的显着丢失。（E） RGC 存活率的量化表明，与对照完整的视神经相比，视神经损伤后 RGC 显着丢失。*p< 与完整相比为 0.05;单因素方差分析与事后 Tukey 检验。n = 每组 3 只动物;误差线代表 SD。SP-ONT，保留鞘的视神经横断面;ONT，视神经横断;ONC，视神经挤压。比例尺 = 1,000 μm。插图中的比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3：视神经损伤后的视神经切片。 （A-C） 视神经鞘保留横断、（D-F） 传统视神经横断或 （GI） 视神经挤压后 14 天通过视神经的纵切代表性图像。（A、D、G）神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 的免疫标记描绘了病变的范围，而用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的 （B，E，H） DNA 标记显示了沿视神经长度和病变部位内的连续细胞结构。（C、F、I）合并图像显示 GFAP 阳性神经组织和细胞结构在病变部位的定位。比例尺 = 200 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：保留视神经横断面的视神经鞘之后的视神经切片。 玻璃体内注射霍乱毒素 B 亚基 （CTB） 后，通过视神经鞘保留横断面的纵切代表性图像，并进行顺行轴突描记。（A） 可以观察到从眼球（左）向大脑（右）延伸的 CTB 标记的 RGC 轴突的完全损伤。（B） 神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 的免疫标记描绘了涉及整个视神经直径的广泛病变。（C） 用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 标记的 DNA 显示病变部位内的细胞结构。（D） 显示 CTB 标记的轴突、GFAP 阳性神经组织和病变部位细胞结构定位的合并图像。比例尺 = 200 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：接受细胞移植的横切视神经的纵切。表达荧光蛋白 tdTomato 的神经干细胞 （NSC） 的视神经鞘保留横断面和移植后 14 天通过视神经的纵切面的代表性图像。（A） 神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 的免疫标记显示横断视神经末梢完全分离。（B） 表达 tdTomato 的 NSC 包含在所述技术创造的空间内，并在移植后继续存活。（C） 移植的 NSC 直接贴敷在横断视神经的两端。比例尺，200 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

讨论

描述视神经横断模型的外科手术之前已发表⁶.然而，这些方案中详述的技术包括切开脑膜鞘以横切视神经。此外，为了评估先前横断模型中的 RGC 轴突再生，需要具有挑战性的显微外科作，以将切割的视神经末端或周围神经移植物移植到近端视神经残端^10,13。此处描述的方案在横切视神经的同时最小程度地破坏了视神经鞘，并允许在横切模型中评估 RGC 轴突再生，而无需技术上具有挑战性的显微外科作。

在该协议中，有几个步骤至关重要。应注意避免损伤眼动脉和供应视神经头的脉管系统。因此，步骤 5.1 应在眼球后至少 1.5-2.0 毫米处完成。如果眼动脉发生损伤并破坏视网膜血液供应，则应将眼睛排除在进一步实验之外，因为可能会随之发生肺结核。在步骤 5.4-5.6 中，重要的是要保持视神经鞘的完整性，并尽量减少玻璃移液管进入视神经的开口大小。这样做会在移液器吸头周围形成紧密密封，以减少液体反流，并允许产生足够的静水压力来横切视神经。玻璃移液器的尖端斜面将提高移液器进入视神经的便利性，而不会造成附带损伤。

作员可以进行一些潜在的修改来提高此方法的可访问性。所描述的程序包括最小解剖和去除眼眶组织，同时保留面部和三叉神经。虽然这降低了发病率和出血风险，但眼眶脂肪和泪腺等组织可能会限制关键结构的可视化。可能需要小心去除阻塞手术区域的组织以增强可视化，尤其是在老年动物中。外侧入路也可用于改善对视神经的通路。然而，侧清扫术可能会损伤包括三叉神经在内的其他结构，涉及更多，并且可能对指导注射器械带来挑战。

这种方法的一个可能局限性是无法直接纵视神经并完全可视化整个横断面。因此，存在不完全横断面的可能性。然而，我们已经观察到，在步骤 5.8 中神经末梢分离的视觉确认是成功和完整横断的可靠指标。如果神经末梢无法分离，重新定位注射移液管或将注射压力增加 50% 应提供足够的力以完全横切神经。

相对于现有方法，这种方法保留了视神经鞘的完整性。在维持视神经鞘的完整性时，横断视神经的末端不会暴露在眼眶环境和外周免疫系统中，从而限制了可能影响 RGC 反应的免疫因子的暴露。此外，在横切视神经的同时保持视神经鞘的完整性，可形成一个以视神经末梢和视神经鞘为界的封闭物理空间。神经营养因子、细胞或聚合物局部递送到受伤 RGC 的轴突隔室可以通过注射到新形成的空间来实现。¹⁴ 或者，可以通过允许横断视神经末梢吻合而无需具有挑战性的显微外科技术，在横断模型中评估 RGC 轴突再生。

该方法的应用包括通过轴突特异性干预评估受伤的 RGC 轴突隔室，以确定导致轴突变性的途径并防止横断损伤后轴突丢失。此外，这种方法消除了对技术上困难的视神经吻合手术的需求，使更广泛的研究界能够访问横断模型中的 RGC 轴突再生研究。旨在促进 RGC 轴突再生的干预措施可以使用这种严重损伤模型进行评估，并提供一致且可重复的结果，而无需担心保留的轴突。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL