细菌性心内膜炎小鼠模型中感染参数的内注射与定量

摘要

在这里，我们描述了一种细菌性心内膜炎小鼠模型中的内注射和随后的细菌定量方法。该协议可以扩展用于测量宿主免疫反应和细菌和宿主基因表达。

摘要

眼内细菌感染对视力有危险。研究人员使用动物模型来研究宿主和细菌因素以及与感染相关的免疫反应途径，以确定可行的治疗靶点，并测试预防失明的药物。体内注射技术用于将生物体、药物或其他物质直接注射到眼后段的玻璃腔中。在这里，我们演示了这种注射技术，以启动小鼠眼感染和量化眼内细菌的技术。 脑杆菌在脑 心输液介质中生长18小时，并重新灌注至浓度为100个菌落形成单位（CFU）/0.5μL。使用氯胺酮和西拉辛的组合对一只C57BL/6J小鼠进行麻醉。使用皮奥利特微注射器和玻璃毛细管针，将0.5μL 的杆 菌悬浮液注射到小鼠眼的中层。反向对照眼要么注射了无菌介质（手术控制），要么没有注射（绝对控制）。感染后10小时，小鼠被安乐死，用无菌手术钳子采集眼睛，并放入含有400μL无菌PBS和1毫米无菌玻璃珠的管子中。对于ELISAs或性内洛西达酶测定，蛋白质酶抑制剂被添加到管子中。对于RNA提取，添加了适当的解解缓冲液。眼睛在组织均质器中均质1-2分钟。在PBS中，同质酸盐被连续稀释10倍，并跟踪稀释到加糖板上。其余同质物储存在-80°C，用于其他测定。板孵育24小时，每只眼睛的CFU被量化。这些技术导致小鼠眼睛的可重复感染，并促进活体细菌的定量，宿主免疫反应，宿主和细菌基因表达的奥米。

引言

细菌性内膜炎是一种导致炎症的破坏性感染，如果治疗不当，可能导致视力丧失或失明。心内膜炎的结果是细菌进入眼睛内部^{1，2，3，4，5。}一旦进入眼睛，细菌复制，产生毒素和其他有害因素，并可能导致不可逆转的损害微妙的视网膜细胞和组织。眼部损伤也可以由炎症引起，由于炎症途径的激活导致炎症细胞流入眼内^1，5，6。内膜炎可能发生在眼内手术（术后），对眼睛的穿透性损伤（创伤后），或从转移传播细菌到眼睛从不同的解剖位点（内源）7，8，9，10。细菌性内膜炎的治疗包括抗生素、抗炎药或外科介入^{3、4、11。}即使有这些治疗，视力或眼睛本身也可能丢失。细菌性内膜炎的视觉预后一般因治疗效果、表现的视力和感染生物体的毒性而有所不同。

杆菌杆菌（B.cereus）是导致创伤后内膜炎^7，12的主要细菌^{病原体之一}。大多数乙型脑膜炎病例有一个快速的过程，这可能会导致失明在几天内。B. cereus 内皮炎的标志包括眼内炎症迅速演变、眼痛、视力迅速丧失和发烧。与其他通常引起眼部感染的细菌^相比，脑细胞在眼睛中生长迅速^，并且具有许多毒性因素。因此，成功治疗干预的窗口相对较短^{，即1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25。} 这种感染的治疗通常成功地治疗由其他毒性较低的病原体引起的内膜炎，但乙型脑膜炎通常导致超过70%的患者患有严重的视力丧失。这些病人中约有50%的被感染眼7、16、22、23等^眼睛被感染^或引化。乙基脑内皮炎的破坏性和快速性要求立即和适当的治疗。最近在辨别疾病发展的基本机制方面的进展已经确定了潜在的干预目标19、26、27。B. cereus 内皮炎的实验小鼠模型在辨别感染机制和测试可能防止视力丧失的潜在治疗方面仍然很有用。

小鼠在脑膜炎²⁸期间的实验眼内感染一直是了解细菌和宿主因素及其相互作用的工具模型。此模型模拟创伤后或术后事件，其中细菌在受伤期间被引入眼睛。这个模型是高度可重复的，并一直有用的测试实验疗法和提供数据，改善护理标准1，6，19，29，30。与许多其他感染模型一样，此模型允许独立控制许多感染参数，并能够高效且可重复地检查感染结果。过去几十年中，对兔子的类似模型的研究已经研究了B.cereus病毒因素对^{眼睛2、4、13、14、31的影响}。通过注射缺乏个体或多种毒性因子的乙型细菌突变菌株，这些毒性因子对疾病严重程度的贡献可以通过结果来衡量，如细菌在感染后不同时间浓度或视觉功能^{丧失13、14、27、31、32。}此外，通过感染缺乏特定炎症宿主因子的敲敲小鼠菌株，该模型中已对宿主因子进行了研究^{，这些菌株缺乏特定的}炎症宿主因子26、29、33、34、35。该模型也可用于测试潜在的治疗方法，通过注射新的化合物到眼睛感染^{后30，36。}在这份手稿中，我们描述了一个详细的方案，其中包括用B.cereus感染老鼠眼，感染后采集眼睛，量化眼内细菌负荷，以及保存标本以检测疾病严重程度的其他参数。

研究方案

所有程序都是按照《实验室动物护理和使用指南》和《眼科和视觉研究动物使用视觉和眼科声明协会》中的建议进行的。协议得到俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会的批准（协议号15-103、18-043和18-087）。

1. 无菌玻璃针

1. 打开 指针 移液器拉拔器。
2. 调整加热器 旋 钮，直到显示屏显示 12.6。
3. 打开门，通过上部夹具和加热器灯丝手动馈送 5 μL 毛细管，直到管子的一半延伸到灯丝以下（图 1A）。
4. 确认毛细管位于上夹的"V"槽中。拧紧上部夹具。
5. 打开下部夹具后，手动向上调整垂直滑动，直到下夹达到其上限。确认管子位于下夹的"V"槽中。拧紧下部夹具。
6. 关上门并确认"就绪"指示灯已打开。按下"开始"按钮启动加热器和拉力顺序（图 1B）。
7. 确保加热器在热和重力将毛细管拉开后自动关闭（图 1C），并且滑轨向下移动。
8. 开门。握住毛细管顶部时，请解开顶部夹紧。拆下上毛细管并将其放在一边。
9. 将毛细管放在底部滑轨中，并解开下夹紧。拆下下毛细管并将其放在一边。
10. 使用带 0.05 μm 氧化铝磨料磨削板的微电子斜面，将拉制毛细管斜面到喷射管上，以创建注射针。
11. 将足够的水移到磨削板上以覆盖表面（图 1D）。
12. 打开斜面，使斜面以 60 rpm 转速开始旋转。将拉拔的毛细管放入"V"槽中的移液器夹中。拧紧夹具，将移液器夹的角度调整为 30°。
13. 调整毛细管尖边缘的尖端，距离磨削板旋转中心大约三分之二的距离。
14. 通过调整操纵器顶部的粗控制旋钮，降低夹紧的毛细管。继续降低毛细管，直到毛细管的尖端延伸到水面以下，并接触磨削板的磨料表面。
15. 使用附着在斜面上的显微镜监控斜面进度。5 分钟后，调整精细控制，将玻璃针从磨削板中升起。
16. 取下玻璃针并将其放在10倍放大镜下，以检查毛细管的尖端（图1E，F）。
17. 为确保没有堵塞，将玻璃针插入注射器上的移液器支架，并将空气推入 99% 乙醇的 1 mL 管中。如果在针头上形成气泡，针头没有阻塞，可用于微注射。这个过程也确保了玻璃针的无菌性。
18. 一根毛细管可容纳多达5μL的液体。将毛细管标记为 10 个部分，以计算针上的距离，以标出 0.5 μL 体积。将该距离的刻度标记为 0.5 μL，以便将来进行准备。对于 5 μL 针，相距 0.7 mm 的距离等于 0.5 μL（图 1G）。

2. 杆菌培养

1. 在生物安全级别 2 条件下执行本节中的所有程序。
2. B. cereus ATCC 14579 的条纹冰柜库存，用于在 5% 羊血脂盘上分离单菌群，并在 37 °C 下孵育过夜（图 2A）。
3. 移液 5 mL 无菌脑心输液 （BHI） 汤放入 10 mL 无菌卡帽管 （图 2B）.使用无菌循环或针头，从加糖板 中选取一个 B. cereus ATCC 14579 的群体，并接种液体 BHI。
4. 短暂地漩涡样品。将卡扣管放入旋转培养箱中。将温度设置为 37 °C，将速度设置为 200 rpm。18 小时后，从培养箱中取出培养物（图 2B）。

3. 细菌稀释用于内膜注射

1. 在生物安全级别 2 条件下执行本节中的所有程序。
2. 计算隔夜 B. cereus 培养量 ，以添加到 10 mL 的新鲜 BHI，以实现每微升 （CFU/μL） 200 个菌落形成单位。例如，BHI 中的 B. cereus 的隔夜培养可复制到大约 2 x 10⁸ CFU/mL，然后通过将 10 μL 的隔夜培养液移入 10 mL 的新鲜 BHI 中，可以稀释至 200 CFU/μL。
3. 将新鲜稀释的培养成1.5 mL微离心管的移液器1 mL。保持这种管子在冰上，直到内脏注射。在稀释细菌培养的60分钟内进行内脏注射。

4. 鼠标内注射

1. 在生物安全级别 2 条件下执行本节中的所有程序。
2. 通过在手术台上放置医疗垫，准备手术现场。
3. 打开微喷射器并打开连接到微喷射器的压缩空气油箱上的气体阀。调整油箱调节器，直到气体输送量约为 60 psi。
4. 在微控制器上，按" 模式"， 直到屏幕显示 "平衡"。按 " 平衡"，将计算机鼠标放在操作台上。将不锈钢移液器支架连接到连接到喷油器"填充/输出"的油管上。此管始终连接到喷油器。
5. 将毛细管针插入移液器支架的另一端，将移液器支架接头拧紧。
6. 打开眼科显微镜，将光线打开，强度为 50%。在操作台上的手术台上调整显微镜，将显微镜调整到所需焦点。
7. 在程序开始之前，通过测试踏板退出反射确认鼠标已充分麻醉。请务必遵循 IACUC 批准的麻醉协议。
8. 将麻醉小鼠放在医用垫上，鼻子指向右侧，靠在左侧。
9. 通过眼科显微镜观察鼠标的右眼，通过打开眼睛两侧的反向动作钳的钳子打开盖子，露出注射部位（图3C）。
10. 左键单击连接到微注射器的鼠标垫，用 200 CFU/μL 稀释填充毛细管针（图 3D）。
11. 用左手固定动物的头，将针尖放在眼睛的肢体上。针头处于斜面位置，角度为45°，刺穿鼠标眼，但确保注射时仅插入针头的尖尖（±0.5 mm）。
12. 插入针尖后，将左手从鼠标头移到鼠标垫，然后右键单击鼠标垫，注射 0.5 μL的 B. cereus稀释剂。为防止渗漏，在取出（图3E）1、19、26、27、32、34、36、37、38之前，将针尖^留在鼠标眼内^2-3秒。
13. 松开钳子，将鼠标放入坐在加热垫上的笼子中。监测这些小鼠，直到它们从麻醉中恢复过来（图3F）。
14. 一旦小鼠从麻醉中恢复，将笼子返回到适当的机架。如果小鼠将接受视网膜功能分析的电雷学，笼子应返回到一个黑暗的房间，以适当的黑暗适应。

5. 收获管制备

1. 将 1 mm 无菌玻璃珠放入 1.5 mL 螺钉盖管中。
2. 在干燥环境中在自洗器中消毒这些管。使用前，让管子冷却至室温。
3. 将 10 mL 的 1x 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 添加到无菌 15 mL 离心管中。
4. 在管中加入1片蛋白酶抑制剂鸡尾酒片。混合由漩涡19，27，29，34，35。
5. 将含有蛋白酶抑制剂的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）移液400μL放入每个自 <3>开的收获管中。标记管子并放在冰上。（图4A）。

6. 收获眼睛

1. 在生物安全级别 2 条件下执行本节中的所有程序。
2. 通过_CO2 吸入使鼠标安乐死。使用辅助方法确认安乐死。
3. 将安乐死的鼠标头固定，并打开受感染眼睛两侧的细尖钳。朝下推向头部，支撑眼睛。一旦钳子在地球眼后面，把钳子挤在一起。从头上拉出钳子以分离眼球（图4B）。
4. 立即将眼球放入有标签的收获管中。将管子放在冰上不超过60分钟（图4C）。

7. 眼内细菌计数

1. 在生物安全级别 2 条件下执行本节中的所有程序。
2. 确认所有收获管都紧密闭合，在组织均质器中保持平衡（图5A）。打开组织均质器 1 分钟，使样品均质化。等待 30 秒，然后再打开一分钟。将管子放在冰上（图5B，C）。
3. 连续稀释每个样品10倍，按顺序将20μL的均质转化为180μL的无菌1x PBS。稀释，直到达到^10-7 的因子（图5D）。
4. 用适当的稀释因子标记每一排暖方形 BHI 板。将每一稀释的 10 μL 连续转移到倾斜约 45° 的顶部 BHI 板。让样品运行，直到它几乎到达板的底部，然后奠定板平（图5E）39。
5. 当样品被吸收到BHI阿加中时，将板转移到37°C培养箱中。在放入孵化器后，殖民地应开始可见 8 小时。
6. 在B.cereus菌落的生长干扰识别单个菌落之前，从培养箱中取出盘子（图5F）。
7. 要准确表示样品中的浓度，请计算有 10-100 个菌落之间的行。例如，具有 45 个菌落的稀释分数为 10^-4 的行的浓度为 4.5 x 10⁵ CFU/mL。
8. 要计算每只眼睛的细菌总数，将浓度乘以 0.4，表示用于使眼睛均质的毫升体积为 1x PBS。例如，4.5 x 10⁵ CFU/mL 浓度将转换为每只眼睛 1.8 x 10⁵ CFU B. cereus。

8. 样品保存

1. 将均质样品放入标有冰柜的冰柜中，然后将该盒放入 -80°C 冷冻箱中。这些样本可稍后由 ELISA 用于炎症中介分析。

结果

生成可重复的宫内注射过程和准确性是开发微生物内膜炎模型的关键步骤。在这里，我们演示了使用革兰阳性杆菌 的静脉注射程序。我们向5只C57BL6小鼠的中层注射了100个CFU/0.5μL的 B.cereus。 感染后10小时，我们观察到 B.cereus的眼内生长到 大约1.8 x 10⁵ CFU/眼睛。 图1 演示了玻璃针的构造，将细菌送入小鼠眼睛的中游。 图2显示了在 血脂板和?...

讨论

即使有有效的抗生素、抗炎药和玻璃切除术，细菌性内膜炎也可以使患者失明。临床研究对治疗内膜炎是有益的;然而，眼膜炎的实验模型提供了快速和可重复的结果，可以转化为护理标准的进步，从而为患者提供更好的视觉结果。

小鼠眼的玻璃体积约为7μL^40。这种小体积只允许注入有限的材料。不应注入大于 1.0 μL 的体积，以避免眼部损伤。该过程需要特?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA