使用下一代测序的 T 和 B 细胞受体免疫再剧目分析

摘要

当前协议描述了从血液样本和肠道活检中分离脱氧核糖核酸的方法、用于下一代测序的 TCR® 和 IGH PCR 库的生成、NGS 运行的性能和基本数据分析。

摘要

免疫记忆是适应性免疫的标志，由T和B淋巴细胞编排。在循环和不同的器官中，有数十亿个独特的T细胞和B细胞克隆，每个克隆可以结合特定的抗原，导致增殖、分化和/或细胞因子分泌。T细胞和B细胞中巨大的异质性是由不同基因片段的随机重组产生的。近十年来开发的下一代测序技术，使T和B细胞受体免疫剧目能够史无前例地深入观察。对各种炎症条件、免疫缺陷、感染和恶性肿瘤的研究表明，免疫资源在克隆性、基因使用和生物物理特性方面发生了显著变化，为适应性免疫反应在不同疾病中的作用提供了重要的见解。

在这里，我们为来自血液和组织的T细胞和B细胞的免疫剧目NGS提供详细的协议。我们通过图书馆准备、NGS测序仪测序和基本分析，提出从 DNA 分离开始的管道。这种方法能够在核苷酸或氨基酸水平上探索特定的T和B细胞，从而能够识别淋巴细胞种群的动态变化和不同疾病的多样性参数。该技术正在慢慢进入临床实践，具有识别新型生物标志物、风险分层和精密医学的潜力。

引言

自适应免疫系统由T和B淋巴细胞组成，利用免疫记忆识别以前遇到的抗原并启动快速反应。淋巴细胞在骨髓中生成，在胸腺（T细胞）或骨髓（B细胞）中成熟。T细胞受体 （TCR） 和 B 细胞受体 （BCR） 都显示独特的配置，允许识别特定的抗原。在平衡中，T细胞和B细胞不断循环和测量抗原呈现细胞上出现的数万亿种不同的肽。TCR 或 BCR 结对具有高亲和力的特定抗原，以及适当的共同刺激，导致细胞活化，导致细胞因子分泌、克隆扩张和抗体生成，在 B 细胞的情况下。

不同T或B细胞的巨大阵列统称为免疫剧目，能够识别无数不同的表皮。为了产生如此庞大的剧目，不同基因片段的随机组装过程非常复杂，产生几乎无穷无尽的受体组合，可以结合独特的抗原^1。这个过程称为V（D）J重组，包括不同变量（V）、多样性（D）和连接（J）基因的重新排列，同时在²号路口随机删除和插入核苷酸。

几十年来，适应性免疫系统的架构一直让不同领域的科学家感兴趣。过去，桑格测序、互补确定区域 3 （CDR3） 光谱和流动细胞测量用于描述免疫剧目，但分辨率较低。在过去十年中，下一代测序 （NGS） 方法的进步使人们能够深入了解个人 TCR 和 BCR 剧目^3、4的特征和组....

研究方案

这项研究得到了谢巴医疗中心机构审查委员会的批准，并获得了所有参与主体的书面同意。

1. DNA分离和量化

1. 肠道活检的消化和细胞裂解
   1. 检索肠道活检，无论是新收集的还是储存在-20°C或-80°C的活检。 如果使用冷冻活检，在冰上解冻。
   2. 在无菌的1.7mL微离心管中加入600微L核裂解溶液，在冰上冷却。
   3. 将活检放入带裂解溶液的微中性管中，在 65 °C 下孵育 15-30 分钟。
   4. 加入 17.5 μL 的 20 毫克/mL 蛋白酶 K，在 55 °C 的夜间孵化，轻轻摇晃。
   5. 允许样品冷却到室温5分钟，然后继续步骤1.3。
2. 全血细胞裂解
   1. 在EDTA、肝素或含柠檬酸管中获取3mL的全血。
   2. 轻轻摇管，直到彻底混合，并将血液转移到无菌的15mL离心管含有9mL的细胞裂解溶液。在室温下10分钟的潜伏期内倒置数次。
   3. 离心机在室温下在2，000 x g下10分钟，然后丢弃尽可能多的超自然，而不会干扰可见的白色颗粒。剩余液体将保留约50-100微L。
   4. 漩涡管大力为15s，直到完全恢复。加入3mL的核裂解溶液和多次管道。解决方案应变得粘稠。
3. 蛋白质沉淀
   1. 在组织中加入 200 μL 的蛋白质....

结果

在此，我们描述了一种从肠道组织和血液中分离DNA的方法，NGS的库的准备，以及免疫排泄测序测序运行的基本步骤。运行将生成 fastq 文件，可进一步转换为 fasta 文件，用于国际免疫基因 （IMGT） /HighV-QUEST 平台。此 HTS 在核苷酸级别¹⁵上执行和管理数万个重新排列的 TCR® 和 IGH 序列的许多分析。IMGT/高V-QUEST 能够分析健康和疾病中的不同 TCR 和 IGH 剧目。这可以导致新的"疾病特异性.......

讨论

B和T淋巴细胞的丰度和功能的变化经常遇到不同的恶性肿瘤^18，慢性炎症性疾病（如溃疡性结肠炎和类风湿关节炎^{）10，19，}并在各种免疫缺陷17，20。当前方法利用 NGS 促进对 TCR 和 BCR 剧目的深入观察，从而能够检测 T 和 B 细胞克隆的细微变化、克隆共享、V（D）J 基因的使用以及 B 细胞体细?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol	Sigma	I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes	Axygen	8187631104051
15 mL centrifuge tubes	Greiner	188261
Absolute ethanol	Merck	1.08543.0250
Amplitaq Gold	Thermo Fisher	N8080241
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
Heat block	Bioer	Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer	Agilent	5067-5603	For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584	For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit	Invivoscribe	TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019	Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)	Illumina	MS-102-2003	Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer	Illumina	SY-410-1003
PCR strips	4titude	4ti-0792
Proteinase K	Invitrogen	EO0491
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32854	Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker	Biosan	Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2940CA
ultra pure water	Bio-lab	7501
Wizard DNA isolation kit	Promega	A1120	Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer