使用刺激拉曼散射显微镜对 卡诺哈布迪炎电子人 中的脂质存储动力学进行无标签成像

摘要

刺激拉曼散射（SRS）显微镜允许选择性，无标签成像的特定化学莫伊蒂，它已被有效地用于图像脂质分子在体内。在这里，我们简要介绍了SRS显微镜原理，并描述了用于 在卡诺哈布迪炎电子群中成像脂质储存的方法。

摘要

脂质代谢是细胞和生物体健康必需的基本生理过程。脂质代谢的调节障碍经常导致肥胖和许多相关疾病，包括心血管疾病、II型糖尿病和癌症。为了推进目前对脂质代谢调节的认识，精确测量体内脂质储存水平的定量方法在时间和空间上变得越来越重要和有用。分析脂质储存的传统方法是半定量进行微观评估或缺乏生化测量的时空信息。刺激拉曼散射（SRS）显微镜是一种无标签的化学成像技术，能够快速和定量地检测活细胞中的脂质，具有亚细胞分辨率。由于对比度利用了内在分子振动，SRS显微镜还允许对活体动物的脂质进行四维跟踪。近十年来，SRS显微镜在生物医学研究中广泛应用于小分子成像，克服了传统荧光染色和脂质提取方法的主要局限性。在实验室中，我们结合了SRS显微镜与强大的模型生物体 Caenorhabditis电子人 可用的遗传和生化工具，以研究脂质液滴在不同细胞和组织中的分布和异质性，并最终发现调节脂质代谢的新型保守信号通路。在这里，我们介绍了SRS显微镜的工作原理和详细设置，并提供了方法，用于量化脂质储存在野生类型和胰岛素信号不足突变 C.elegans的不同发展时间点。

引言

肥胖已成为威胁全球三分之一人口的全球健康问题，并提出了严重的医疗问题，因为它与不良的心理健康¹ 和致命的疾病，包括糖尿病^2，心血管疾病³ 和某些类型的癌症^4。脂质代谢研究对于更好地了解肥胖背后的生物学问题至关重要。脂质储存的快速和具体量化需要检测脂肪酸及其衍生物，以及含有固醇的代谢物，具有高灵敏度，最好是空间信息。脂质是具有挑战性的图像目标，因为它们缺乏内在荧光，不容易被荧光标记。荧光标签通常大于脂质分子，因此，在体内应用中，可能具有化学侵入性和不切实际性。无标签或最小标签策略是必要的，以保持脂质分子⁵的疏水结构。成像技术的最新发展为活细胞、组织和生物体中脂质的无标签成像创造了令人兴奋的机会。

生物样本中脂质储存分析的传统方法包括生化检测和用脂质染料染色协议。涉及质谱仪 （MS） 的生化定量测定在其分子可解性方面是无可比拟的，但它们需要非常大的样本量，样品制备通常需要几个小时，从而限制了它们对生活系统⁵的实时成像应用。这些测定的另一个主要限制是缺乏空间信息。另一方面，脂质染料，如油红O和苏丹黑提供组织和细胞分布的脂质储存细胞器，与MS技术相比，这些染色方法成本低，易于执行。然而，这些染色协议需要固定，这可以影响脂质液滴的疏水性质，产生人为的变化，其结构，并导致实验之间的不一致^6。与生化和染色技术相关的技术困难导致寻找无标签方法来成像脂质分子，并导致在脂质成像中使用连贯的拉曼散射 （CRS） 显微镜的迅速增加。

拉曼效应首先被拉曼和克里希南所识别，他们报告说，在与光子相互作用时，分子可以产生散射光，波长（称为雷利散射）没有变化，或者很少改变波长（称为拉曼散射），波长的变化是^分子7内功能化学组的特征。当分子内部的化学键被一种称为泵光子的事故光子激发到更高的振动能量水平时，称为斯托克斯光子的分散光子的能量就会变低。否则，如果化学键最初处于较高水平，则可达到较低的振动能量水平，而分散的光子获得能量，成为抗斯托克斯光子。事件与分散光子之间的频率差异称为拉曼移位。分子内的每个化学键都有一个特征和可量化的拉曼移位。例如，CH₂ 键具有2，845厘米^-1的拉曼移位，富集脂肪酸链^8。这种自发的拉曼信号通常非常微弱，这极大地限制了传统自发拉曼显微镜的成像速度。多年来，已经开发出各种方法，以提高自发拉曼显微镜的成像速度和灵敏度。连贯拉曼散射显微镜，包括连贯的反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜和刺激拉曼散射（SRS）显微镜，是最新的进展。CARS 和 SRS 的工作原理略有不同，但两者都是无标签技术，具有实时成像能力，可以生成脂质存储动态的空间和时间信息，并且只需要少量样本。CARS显微镜具有非共振背景，来自各种非线性过程，而CARS信号也与分子浓度有非线性关系，共同使定量过程复杂化^。与 CARS 显微镜不同，SRS 显微镜不会生成非共振背景信号，并且对感兴趣分子的浓度提供线性依赖。因此，目前SRS显微镜更广泛地用于脂质成像。

在 SRS 显微镜中，当兴奋时，弱自发拉曼信号可以放大两个同步激光束，其频率差异与化学键振动频率相匹配。由于连贯的兴奋，分子将经历向兴奋状态的增强过渡。因此，斯托克斯光子发电的速度得到提高。因此，传输的"斯托克斯"光束的强度增加（刺激拉曼增益，SRG），传输的"泵"光束的强度降低（刺激拉曼损失，SRL）。SRG或SRL信号的检测是刺激拉曼散射（SRS）显微镜成像分子的基础与特定化学键^10。如果两个激光束之间的频率差异与感兴趣分子内化学键的振动频率不匹配，则不会生成 SRG 或 SRL 信号。SRS显微镜的成像速度约为每像素2微秒或每帧1秒，这比自发拉曼显微镜¹¹快得多。SRS显微镜的典型横向分辨率有限，约为300纳米。此外，SRS显微镜的双光子光学过程允许对相对厚的组织样本进行体积3D成像，成像深度可达300-500 μm。总体而言，SRS显微镜提供了一种高效、无标签的成像技术，可检测特定的生物分子，尤其是脂质。

脂质液滴是单膜细胞，是中性脂质的主要细胞储存部位，包括三氯丁二醇 （TAGs） 和胆固醇酯 （CEs）。这些脂质分子脂肪酸链中的CH₂键在兴奋⁸时产生2，845厘米^-1的强烈SRS信号，从而能够检测和量化完整细胞、组织部分甚至整个生物体12、13、14、15中的储血脂水平。特别是，C. elegans由于其透明度，对脂质成像研究很有用。与哺乳动物一样，C.elegans也在脂质液滴中储存脂质，脂质分子的合成和降解途径被高度保存^。在此协议中，我们将提供SRS显微镜的工作原理，其基本设置，并描述其在C.elegans脂质成像中使用的方法。

研究方案

1. 刺激拉曼散射显微镜的仪器设置

注:SRS显微镜系统采用皮秒激光器，泵集成光学参数振荡器和共聚焦激光扫描显微镜。振荡器提供两个象形脉冲列车，包括1，064 nm的斯托克斯光束和700-990纳米之间的泵束。两束光束的时空重叠在激光内部实现。内置的光电调制器 （EOM） 专为 SRS 显微镜设计。该协议将侧重于将激光与显微镜耦合，以及该系统的日常运行（图1）。SRS显微镜系统的配置在过去十年中不断演变。应当指出，以下描述仅表示几个配置之一。

1. 将激光束送入显微镜
   1. 设置潜望镜，将光束从皮秒光源出口提升到显微镜扫描仪上的 IR 激光输入端口。
      注意:在操作前阅读激光系统手册，并采取所有必要的预防措施，因为这种IV类激光系统产生的近红外辐射可能会对眼睛和皮肤造成严重伤害。完成机构环境安全部门要求的培训。佩戴防护护目镜和带袖口的实验室外套。
   2. 首先，将泵束设置为 750 nm，并将激光功率降低到 50 mW，可进行目视检查，从而将对齐与对齐相配。然后，使用光束扩张器（图 1、L1和 L2）调整光束直径，以适应显微镜目标的后孔径。使用两个继电器镜（图 1、M1和 M2）引导激光束到潜望镜（图 1、P1和 P2）。潜望镜将将光束提升到扫描仪开口的高度，并作为对齐的转向镜。
   3. 将旋钮设置在调谐范围中心的潜望镜上，并选择每面镜子的初始位置和角度，以便激光束击中镜面中心，大致。
   4. 使用目标炮塔上的空端口执行粗对齐，并放置功率计探头以测量传输光的功率。将显微镜的扫描仪设置在最高变焦（50倍），然后用聚焦激光束点测量传输光的功率。对每面镜子、M1 和 M2 上的旋钮进行优化，以实现最高的传输激光功率。
   5. 与对齐工具进行精细对齐。将荧光目标对齐帽放在空目标座椅上，并调整 M1 的旋钮以将位置中心。然后，引入目标的扩展管，并调整 M2 的旋钮以中心位置。
   6. 重复步骤 1.1.4 和 1.1.5，直到光束将目标集中在两个位置。
2. 连接检测和电子
   1. 设置 SRS 检测模块。在凝结器后放置光束分离器立方体，将传输的激光引导到光电二极管模块。该模块包括一个望远镜来中继和改变光束大小，以适应光二极管的活跃区域，以及一个光学过滤器，以消除调制的斯托克斯光束，让泵束通过降级。
   2. 设置电子连接（图1）。斯托克斯光束的强度由内置的 EOM 调节，其内部为 20 MHz，位于可调谐激光器内。激光的调制频率输出输入锁定放大器，作为降级的参考频率。将光迪奥的输出信号输入锁定放大器，以演示 SRL。
      注:单盒激光系统可以升级，因此其规格可能因生产日期不同而有所不同。本协议中使用的原版 picosed 可调谐激光系统具有 1，064 nm 的斯托克斯光束，但最近版本的斯托克斯光束为 1，031 nm。此协议中使用的 EOM 的调制频率定制为 8 MHz，但最近系统的默认调制频率为 10 或 20 MHz。
   3. 最后，将锁定放大器输出输入显微镜的模拟盒，将电模拟信号转换为数字信号。系统应准备好处理 SRS 信号。
3. 优化成像条件
   1. 为系统对齐制作化学样品。例如，使用多德坎优化显微镜，因为多德坎具有来自 C-H 键的非常强的 SRS 信号。使用安全密封件制作迷你密室;放5μL的多德坎，并覆盖它与盖子。
      注:一旦看起来不清楚或出现碎片，请更换多德坎样品，并使用可用于对齐 2-3 个月的新样品。
   2. 将样品放在显微镜舞台上。正确聚焦液体液滴。它可以通过寻找多德坎垫的边缘更快地完成。调整凝结器以进行科勒照明。
   3. 设置成像参数。检查延迟阶段是否在正确的数字上。将泵束波长设置为 795.8 nm。使用 IR 传感器卡和 IR 查看器，检查泵束路径是否仍然正确。
   4. 将泵束的功率设置为 200 mW，将斯托克斯光束设置为 400 mW 的 pic 秒系统控制面板。
      注:从激光出口到两束光束的后目标的激光吞吐量约为泵的 25%，而斯托克斯的激光吞吐量约为此系统设置的 14%。因此，泵束的后客观功率约为 50 mW，而斯托克斯光束的后客观功率约为 56 mW。近期第二激光系统的脉冲宽度从6 ps变为2ps，因此应用激光功率应更低。
   5. 将锁定放大器增益设置为最大。打开光束的快门以及激光的主快门。
   6. 扫描样本并检查计算机屏幕上的图像。在成像软件中将显示模式更改为 Hi-Lo。 调整范围，以看到约50%的饱和度。检查饱和度是否集中在图像中。如果没有，小心调整转向镜，M1和M2，以最大限度地提高图像强度和中心峰值强度。
   7. 微调延迟阶段，并从多德坎样本中找到最大 SRS 信号强度。然后，系统已准备就绪，可以使用。

2. 为 SRS 显微镜成像准备 C. elegans 样品

注:作为模型生物体， 卡诺哈布迪炎电子根 已被证明对多种成像技术非常有用。它们是全身透明的，因此各种组织可以在完整的动物中成像，而无需解剖。在 C.elegans中， 中性脂质储存在位于肠道的脂质液滴中，由20个上皮细胞组成，这些上皮细胞位于肠道流明¹⁶周围两个对称位置。皮下细胞和卵母细胞也储存脂质。 C. elegans 脂质液滴中的主要存储脂质形式是三氯二醇 （TAGs）^17，由于脂肪酸链中存在大量 CH₂ 键，因此产生强烈的 SRS 信号。本节将侧重于如何准备 C. elegans 样品，用于 SRS 显微镜成像和量化其总肠道脂质储存水平。

1. 成像幻灯片的准备
   1. 首先，在蒸馏H₂O中准备2%的蔗糖溶液，并确保所有蔗糖在准备阿加罗斯垫之前熔化。
   2. 将一滴2%的暖气添加到一张空白幻灯片（约100μL）上，该幻灯片放置在带有两层实验室胶带的支撑滑梯之间，并迅速将第二张幻灯片放在第一张幻灯片的顶部。轻轻按压，创建一个薄，甚至糖垫。
   3. 将这些幻灯片放在封闭位置，在蠕虫准备安装之前不要将其分开。在每次成像会话之前准备新的幻灯片，因为垫子将在 1 天后干燥。
      注:使用多井成像室，如果成像几蠕虫在高通量基因屏幕^18。使用实时成像设置，通过发育和老化¹⁹来成像脂质代谢的时态动力学。
2. 安装蠕虫
   1. 通过在 M9 缓冲器中加入钠阿齐德或利瓦米索尔，分别将麻醉剂添加到 100 mM 或 1 mM 的最终浓度中，为麻醉剂做好准备。
      注:如果蠕虫在基因筛选后成像后需要恢复，请使用利瓦米索。
      注意:吸入几种麻醉剂，包括阿齐德钠和利瓦米索尔，是有害的。在准备这些工作解决方案时，请戴上防护手套和衣服，并使用化学烟雾罩。
   2. 将一滴麻醉剂放在盖片上（约 4=5 μL 代表 10–20 蠕虫）。
      注意:根据蠕虫数量调整麻醉剂的数量，使蠕虫尽可能靠近对方。使用过多的液体很少蠕虫可能导致蠕虫在糖垫上传播。
   3. 挑选在解剖显微镜下成像的蠕虫，并将其转移到麻醉剂液滴中。将所有蠕虫添加到液滴中后，使用蠕虫拾取器移动它们，并确保它们不会相互重叠。
   4. 将玻璃滑梯（从步骤 2.1 中分离）分开，而不会扰动浮子垫。
   5. 用带有糖垫的玻璃滑梯盖住虫子液滴。确保阿加罗斯垫朝向蠕虫。或者，麻醉老化液滴也可以添加到糖垫和蠕虫可以覆盖盖片。
   6. 最后，使用玻璃滑梯上的永久标记标记蠕虫的位置。

3. 图像采集和分析

1. 使用 SRS 显微镜系统获取图像。
   1. 在成像任何样本之前，确定成像参数并验证 SRS 信号（如协议 1 中所述）。
   2. 将幻灯片安装在面向目标镜头的盖滑梯上。打开明亮的场光源，并将其引导到目镜中以定位蠕虫。
      注:使用20倍的客观透镜对整个肠道中的脂质储存进行成像。考虑使用 60 倍目标透镜来映像皮下脂肪存储或量化脂质液滴大小/数字。
   3. 将蠕虫集中到焦点中，并相应地调整凝结器位置。
   4. 关闭明亮的场光源并切换到激光扫描单元。开始以快速扫描速率（例如，512 x 512 像素）扫描第一个蠕虫，并调整精细对焦以查找感兴趣的区域。要对第一个示例进行成像，则将激光功率调整到 SRS 信号不饱和的水平。
   5. 切换到较慢的扫描速率（例如，2 μs/像素）和更高的分辨率（例如，1024 x 1024 像素），以获取 SRS 图像。
      注意:在成像过程中，每个样品的激光功率保持不变。
   6. 以允许高分辨率（如.tiff文件）所需的格式保存 SRS 图像。根据使用的成像软件和设置，在移动到下一个蠕虫之前保存第一个蠕虫的位置。
   7. 对安装在幻灯片上的所有蠕虫进行完整成像。关闭快门以阻挡激光束。在对所有样品进行成像之前，不要关闭激光源。
   8. 在放置下一个示例幻灯片之前，先删除幻灯片。重复步骤 3.1.2–3.1.7。
   9. 所有样品都成像后，将激光源置于待机状态，并关闭相关设备，包括放大器、探测器、显微镜和计算机。
2. 使用图像J分析图像
   1. 通过选择文件并拖动并将它们拖放到 ImageJ 窗口，打开图像文件（通常.tiff）以在 ImageJ 中进行量化。如果使用特定的奥林巴斯显微镜格式（如 .oib 文件），请下载适当的 ImageJ 插件。
   2. 选择要分析的属性（分析>集测量）。对于总脂质存储量定量，选择区域、最小值和最大灰色值以及平均灰色值。
   3. 使用多边形选择工具，并勾勒出蠕虫肠的区域进行量化。要测量步骤 3.2.2 中选择的参数，请单击 "分析 > 测量"。将弹出一个具有测量结果的新窗口。对于所有打开的图像重复此步骤。
   4. 选择给定基因型中所有蠕虫的测量结果，并将结果复制/粘贴到新的电子表格中。重复步骤 3.2.1– 3.2.4，用于同一成像会话中的所有基因型。
   5. 选择没有任何 SRS 信号的蠕虫附近区域，以量化为背景。确保选择用于背景测量的区域不包含任何可能发出 SRS 信号的细菌或碎片。
   6. 从每个蠕虫的测量中减去背景均值为灰色值。计算给定基因型/测试组中所有蠕虫的背景减去的平均灰色值的平均和标准偏差。将此值标准化为对照组的平均值。
   7. 最后，使用平均灰色值作为衡量每种蠕虫脂质水平的指标，进行适当的统计分析。通常，使用两组学生 t测试，并使用单向 ANOVA，对两个以上的组进行适当的多重比较测试。
      注意:在选择图像进行图形演示时，请确保所选图像具有相同的像素强度分布。设置相同图中所有图像的亮度和对比度（图像 > 调整 > 亮度和对比度）。

结果

胰岛素信号是影响发育、生殖、寿命和新陈代谢的重要内分泌途径。在蠕虫中，胰岛素信号包括大约40个胰岛素样肽配体、胰岛素样生长因子受体正牙DAF-2、下游PI3K/AKT激酶级联和FoxO转录因子正词，DAF-16^20。缺乏胰岛素受体的daf-2突变体，其肠道中脂质液滴较多，蠕虫脂质储存组织21，22。使用 SRS 显微镜，我们量化了成年后年龄同...

讨论

为了预防肥胖及其相关的代谢紊乱，已经开展了重要的研究工作，以更好地了解脂质平衡的调控机制。对于生物样本中脂质分子的定量检测，SRS显微镜的无标签成像已被证明是生化检测和其他染色方法的可靠替代品。我们小组和其他人通过结合使用C.elegans和SRS显微镜^{12、18、28、29、30、31，}揭示了脂质代谢调节?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool - adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool - target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool - tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP