非洲爪蟾 用于可视化动态细胞质组织的蛋提取物制备和实时成像方法

摘要

我们描述了一种从 非洲爪蟾 卵中制备和实时成像未稀释的细胞质提取物的方法。

摘要

非洲 爪蟾 卵提取物传统上用于批量生化测定，已成为一种强大的基于成像的工具，用于研究细胞质现象，例如细胞分裂、有丝分裂纺锤体形成和细胞核组装。基于对在稀疏时间点采样的固定提取物进行成像的早期方法，最近的方法使用延时显微镜对实时提取物进行成像，揭示了具有增强时间分辨率的更多动态特征。这些方法通常需要对成像容器进行复杂的表面处理。在这里，我们介绍了一种无需化学表面处理的鸡蛋提取物实时成像的替代方法。它易于实施，并利用批量生产的实验室耗材进行成像。我们描述了一种可用于宽场和共聚焦显微镜的系统。它专为二维（2D）场中的提取物成像而设计，但可以轻松扩展到3D成像。它非常适合研究细胞质内的空间模式形成。通过代表性数据，我们证明了使用该方法制备的相间提取物中微管，细胞核和线粒体的典型动态组织。这些图像数据可以提供有关细胞质动力学和空间组织的定量信息。

引言

细胞质构成细胞的主要体积，具有独特的组织。真核细胞质的成分可以自组装成广泛的空间结构，例如微管紫苑和高尔基体，而微管紫苑又根据细胞的身份和生理状态动态排列和翻转。因此，了解细胞质的空间组织及其与细胞功能的联系对于理解细胞如何工作非常重要。非洲爪蟾卵提取物传统上用于批量生化测定¹，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，但最近的工作将它们确立为强大的实时成像系统，用于细胞质结构及其细胞功能的机制研究⁹，¹⁰，^11，12，13，14，15，¹⁶，^17，18.这些未稀释的提取物保留了细胞质的许多结构和功能，同时允许直接操作细胞质内容物，这是传统基于细胞的模型无法实现的^19，20。这使得它们成为表征细胞质现象和剖析其机制基础的理想选择。

现有的提取物成像方法需要化学表面改性或制造微流体装置。一种基于盖玻片的方法需要对玻璃盖玻片进行聚乙二醇（PEG）钝化²¹。基于微乳液的方法需要在玻璃表面上气相沉积三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷^22，23。基于微流体的系统可以精确控制提取物液滴的体积、几何形状和组成，但需要专门的微细加工设施¹¹，^12，24。

在这里，我们介绍了一种对卵子提取物进行成像的替代方法，该方法易于实施并利用现成的低成本材料。这包括制备带有载玻片和涂有氟化乙烯丙烯（FEP）胶带的盖玻片的成像室。该腔室可用于使用各种显微镜系统对提取物进行成像，包括立体镜以及正置和倒置显微镜。该方法不需要对表面进行化学处理，同时获得与上述现有玻璃方法相似的光学透明度。它旨在对 2D 视场中厚度均匀的提取物层进行成像，并且可以轻松扩展以对提取物的 3D 体积进行成像。它非常适合在大视场上对集体细胞质行为进行延时成像。

我们使用相间停滞的卵提取物来演示我们的成像方法。提取物制备遵循戴明和科恩布鲁斯¹⁹的方案。简而言之，在减数分裂II中期自然停滞的卵子被低速旋转压碎。该旋转将细胞质从减数分裂停滞中释放出来，并允许提取物进入间期。通常，在粉碎自旋之前添加细胞松弛素B以抑制F-肌动蛋白的形成。然而， 如果需要 F-肌动蛋白， 它可以省略.在粉碎旋转之前还添加环己酰亚胺，以防止中间提取物进入下一个有丝分裂。随后将提取物置于上述成像室中并置于显微镜上。最后，通过连接到显微镜的相机以定义的时间间隔记录图像，生成延时图像系列，在2D场中捕获提取物的动态行为。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 载玻片和盖玻片的准备

1. 用滚筒涂抹器将一层氟化乙烯丙烯（FEP）胶带涂在载玻片上。用干净的剃须刀片剪掉边缘上多余的胶带。以相同的方式制备FEP胶带包被的盖玻片（图1A）。
2. 将双面粘性成像垫片涂在载玻片的FEP胶带涂层面上。保持顶部的保护衬垫未剥落（图1A）。
   注意：载玻片和盖玻片应在实验前准备好。它们可以立即使用，也可以存放在盒子中，以防止灰尘积聚在表面上。成像间隔器中的孔深120μm，直径为9mm。

2. 相间停滞卵提取物的制备和实时成像

注意：以下协议改编自Deming和Kornbluth¹⁹，Murray²⁰以及Smythe和Newport²⁵ 。除非另有说明，否则所有步骤都应在室温下进行。

1. 取卵前三至十天，将成熟的雌性非洲 爪 蟾皮下注射到背淋巴囊中，并加入100 IU妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）。
2. 在计划取卵前16至18小时，向步骤2.1中的青蛙注射500 IU的人绒毛膜促性腺激素（hCG）。将青蛙在18°C的产卵缓冲液（100mM NaCl，2mM KCl，1mM MgSO 4.7H 2 O，2.5mMCaCl 2·2H₂ O，0.5mM HEPES，0.1mM EDTA）中，在pH_7.4下制备为20x储备溶液，并在使用前用干净的青蛙罐水稀释至1x）直到收集卵子。
3. 在实验当天，将鸡蛋收集在一个大的玻璃培养皿中并评估卵子质量。丢弃任何看起来像白色浮肿球或呈绳状出现的鸡蛋（图1B）。在立体镜下检查卵子，保持鸡蛋外观正常（图1C），并丢弃色素不规则或斑驳的鸡蛋（图1D）。
   注意：该协议适用于从单个青蛙收集的鸡蛋，通常在 hCG 注射后 25 小时产下 16 mL 的鸡蛋。通常，hCG共诱导3至6只青蛙，选择卵质最高的青蛙进行提取物制备实验。
4. 将鸡蛋转移到 400 mL 玻璃烧杯中，并通过倾析尽可能多地去除产蛋缓冲液。
5. 将鸡蛋在 100 mL 新鲜制备的脱冻溶液（2% w/v L-半胱氨酸在水中，用 NaOH 调节至 pH 8.0）中孵育，并定期轻轻旋转。约3分钟后，倒出溶液，加入100mL新鲜脱冻液。继续孵育，直到鸡蛋紧密包装（鸡蛋之间没有空间），但避免将鸡蛋留在脱冻溶液中超过 5 分钟。
6. 通过倾析尽可能多地去除果冻溶液，并在0.25x MMR缓冲液（25mM NaCl，0.5mM KCl，0.25mM MgCl₂，0.5mM CaCl₂，0.025mM EDTA，1.25mM HEPES，制备为10x储备溶液，用NaOH调节pH至7.8，并在使用前用Milli-Q水稀释）中洗涤鸡蛋加入缓冲液， 旋转鸡蛋，然后倒出缓冲液。重复几次，直到总共使用1L缓冲液进行洗涤。
7. 用总共 400 mL 的鸡蛋裂解缓冲液（250 mM 蔗糖、10 mM HEPES、50 mM KCl、2.5 mM MgCl₂、1 mM DTT，新鲜制作并用 KOH 调节至 pH 7.7）清洗鸡蛋几次。在洗涤之间使用巴斯德移液管去除外观异常的鸡蛋。
   注意：外观异常的鸡蛋是指那些看起来像白色浮肿球（图1B），有斑驳的色素沉着（图1D），随着白色区域的增长而恶化（图1E），或在动物半球显示深色和收缩色素区（图1F）。
8. 使用尖端切开的转移移液器，将鸡蛋转移到含有 1 mL 鸡蛋裂解缓冲液的 17 mL 圆底离心管中。在临床离心机中以400× g 旋转试管15秒以包装卵子。
9. 使用巴斯德移液管从包装鸡蛋的顶部尽可能多地去除鸡蛋裂解缓冲液。
   注意：重要的是从包装好的鸡蛋中去除尽可能多的缓冲液，以尽量减少鸡蛋提取物的稀释。有时需要去除一些松散的鸡蛋以及残留的缓冲液来完成此操作。
10. 确定包装鸡蛋的大致体积，然后直接在包装鸡蛋上添加 5 μg/mL 抑肽酶、5 μg/mL 亮肽酶、5 μg/mL 细胞松弛素 B 和 50 μg/mL 环己酰亚胺。
    注意：抑肽酶和亮肽酶是蛋白酶抑制剂。细胞松弛素B抑制肌动蛋白聚合，防止提取物收缩和胶凝²⁶。环己酰亚胺抑制蛋白质合成，从而使提取物保持在细胞周期的中间期。
11. 通过在摆动桶转子中以12，000× g，4°C离心管15分钟来压碎鸡蛋。
    注意：在离心结束时，鸡蛋应该已经破裂，裂解物分成三个主要层：顶部的黄色脂质层，中间的细胞质提取物（也称为粗提取物）和底部包含色素颗粒的深色致密层（图1G）。
12. 将18号针头连接到注射器上。针尖斜面朝上，从细胞质层底部的一侧刺穿管子，然后缓慢抽取提取物。
    注意：缓慢绘制细胞质提取物，以避免包含来自黄色脂质层的污染内容物。
13. 将回收的细胞质提取物转移到新的微量离心管中并将其保持在冰上。在 1 小时内使用提取物。
14. 准备好成像后，用所需的试剂和荧光成像探针补充提取物。
    注意：荧光成像探针标记特定的细胞质结构，以便可以通过荧光显微镜观察它们。
15. 从步骤1.2制备的载玻片上的成像垫片上取下顶部保护衬垫，并在孔的中心沉积约7μL提取物。立即使用FEP胶带涂层的盖玻片，FEP面朝向提取物以密封孔。快速进行成像（图1H，I）。
16. 将载玻片放在带有电动载物台和数码相机的倒置或正置显微镜上。在明场和荧光通道中以所需的空间位置和时间间隔对提取物进行成像。
    注意：通常使用5倍物镜进行成像。电动载物台可在多个定义的空间位置进行自动图像采集。明场显微镜以不同程度的透明度可视化细胞质结构。荧光显微镜可视化由步骤2.14中添加的荧光成像探针特异性标记的细胞质结构。相机记录这些结构的延时图像，从而捕捉细胞质组织的动态。

结果

非洲爪蟾卵提取物可用于研究间期细胞质的自组织。图2A显示了成功实验的结果。我们用浓度为 27 个细胞核/μL 的去膜爪蟾精子核¹⁹ 和 0.38 μM 纯化的 GST-GFP-NLS²⁷、^28、29、³⁰（由谷胱甘肽-S-转移酶^、绿色荧光蛋白和核定位序列组成的?...

讨论

非洲爪蟾卵提取物已成为一种强大的模型系统，用于各种亚细胞结构的成像研究¹⁰，¹⁴，15，^16，17，¹⁸，²¹，^31，32，³³，³⁴，³⁵

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M