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摘要

克莱森-施密特凝结反应是产生甲氨酸桥结合双环芳香化合物的重要方法。通过利用阿尔多尔反应的基础介导变种，可以通过一种通常便宜且操作简单的合成方法访问一系列荧光和/或生物相关分子。

摘要

甲氨酸桥结合的双环芳香化合物是一系列生物相关分子的常见成分，如猪皮林、二苯酮和药物。此外，这些系统的有限旋转通常会导致高度到中度荧光系统，如在 3H，5H-迪皮罗洛 [1，2-c:2'， 1'f] pyrimidin-3- 1， 黄磷、皮罗林多利齐尼迪奥内类比、博迪皮类比以及绿色荧光蛋白 （GFP） 的酚类和伊米达佐林环系统。本手稿描述了一种廉价且操作简单的方法，即执行克莱森-施密特凝结，以产生一系列荧光pH依赖性皮拉佐尔/伊米达佐尔/异丙酮二苯酮类比。虽然该方法说明了二苯酮类比的合成，但它可以转化为产生广泛的结合双环芳香化合物。本方法所使用的克莱森-施密特凝结反应的范围仅限于在基本条件下（核嗜好成分）和不可抗性醛（电嗜酸成分）下可凝结的核嗜好者和电嗜好者。此外，核嗜血和电亲反应物必须包含不会无意中与氢氧化物反应的功能组。尽管有这些限制，这种方法提供了完全新颖的系统，可以用作生物或分子探针。

引言

一些共生双循环系统，其中两个芳香环由单体桥连接，通过键旋转进行异构，当兴奋与光子（图1A）1，2，3，4，5。兴奋的同位素一般会放松到地面状态通过非辐射衰变过程6。如果对键旋转的能量屏障增加得足够大，则有可能限制或防止光同步。相反，光子激发导致兴奋的单一状态，经常通过荧光放松，而不是非辐射衰变（图1B）。抑制光异构化最常通过机械地通过共价链系住两个芳香环系统来限制粘结旋转，从而将分子锁定在特定的同位素状态。这种方法已被用于创建几个不同的荧光三环二苯酮和二甲基甲烷类比，如:3H，5H-二倍丙酮[1，2-c:2'，1'f]皮里米丁-3-一（1），xan异种生物（2）6，7， 皮罗洛林多利齐尼迪安类比（3）8，和博迪皮类比9 （4，图 2），其中聚丙烯和 / 或苯乙烯环系统系上甲基， 碳基， 或波龙二氟链接器。通常，1-4 拥有ΦF > 0.7 表明这些系统作为氟合金单位非常有效。

也可以通过通过环系统共同连接以外的其他方法限制光异构化。例如，绿色荧光蛋白（GFP）的酚类和二胺酮环（图2）受蛋白质环境限制旋转:与自由溶液10中的同一色素单元相比，限制性设置使量子产量增加三个数量级。据认为，GFP的蛋白质支架通过固态和静电效应11提供了旋转屏障。最近，我们的小组与内华达大学的奥多小组合作，里诺发现了另一种氟化物系统，其结构与基于二苯酮的xanthoglow系统（图2）12具有相似性。然而，这些二苯酮类比不同于血管内氢键中的xanthoglow系统，而不是共价键，阻止光分母化，并导致荧光双环系统。此外，皮拉佐尔、伊米达佐尔和同位素二苯酮类比可以在质子和脱质状态下结合氢气:脱质导致兴奋和发射波长的红色转移，可能是由于系统电子性质的变化。虽然氢结合被报道通过限制旋转13、14、15、16来增加量子产量，但我们不知道任何其他荧光系统，其中受限异位化在分子质子和脱质状态中都起到荧光作用。因此，这些pH依赖二苯酮氟酚在这方面是独一无二的。

在本视频中，我们专注于荧光二苯酮模拟系列的合成和化学特征。特别是，人们强调克莱森-施密特凝结方法，该方法用于构建一系列完整的荧光模拟。这种反应依赖于一种以基础为媒介的恶毒的离子的产生，这种离子攻击醛组，产生一种酒精，随后被消除。对于二苯酮模拟系列，皮罗林酮/异丙酮被转换为一个归因，以促进对附着在苯丙烯或二甲基苯甲酸酯环上的醛组的攻击（图3）:消除后，形成了一个完全结合的双循环系统，由甲氨酸桥连接。值得注意的是，整个系列的二苯酮类比可以由现成的商业材料构建，可以以单一的单锅反应序列生产，通常为中等至高产量（产量范围约为 50-95%）。由于大多数二苯酮类比在性质上是高度晶体的，在标准工作条件之外，很少需要纯化来生产分析纯样品。因此，这种氟化物系统只需几步即可从现成的商业材料中获取，并且可以在相对较短的时间内合成、纯化和准备进行分析或生物研究。

研究方案

1. 二苯酮模拟合成通用程序 16-25

  1. 在圆底烧瓶中溶解5.0 mL乙醇中的苯丙酮/异丙酮（1.00 mmol）和相应的乙醇/二甲醛（1.00 mmol）。
  2. 将无瓶KOH（24.0 mmol，10M，2.40 mL）加入烧瓶中的一部分。
  3. 搅拌并倒流混合物，直到反应完成由 TLC 确认（有关反应时间列表，请参阅 表 1）。使用了二氯甲烷中10%甲醇的TLC，并观察到这些类比在0.62到0.86范围内或周围具有Rf 值。在玻璃接头的相间涂抹足够的真空润滑脂或使用PTFE套管，以防止冷凝器和圆底烧瓶的玻璃在高温和基本条件下被抓住。
  4. 允许反应混合物冷却到室温，并使用旋转蒸发器在减压下蒸发挥发物。
  5. 使用冰浴将反应混合物冷却到0°C。
  6. 通过在一个部分中加入醋酸（30.0 mmol，1.70 mL），中和剩余的油性混合物。
  7. 使用真空过滤（见第 2 步，化合物:17、18、20-22、24和25）净化所产生的产品材料，或使用液体提取/柱色谱（参见步骤 2b，化合物:16、19和 23）。

2. 程序净化

  1. 通过真空过滤
    1. 使用安装的橡胶适配器将赫希漏斗安装到侧臂烧瓶中。
    2. 将一张圆形滤纸涂在 Hirsch 漏斗上，然后用除离子水轻轻湿润，以便粘入漏斗。
    3. 将真空源连接到烧瓶的侧臂，确保真空密封充分，确保真空下不能拆开任何玻璃器皿。
    4. 将含有结晶产品的烧瓶倒入真空过滤器，并允许过滤。用10mL的冰冷除离子水冲洗晶体。
    5. 允许过滤后的晶体在过滤所有液体后继续干燥，同时仍连接到真空源。
    6. 收集过滤后的晶体，放在 25 mL 的圆底烧瓶中。
    7. 将圆底烧瓶连接到碎碎的地面玻璃接头/真空线适配器上。用桶夹固定玻璃联合。
    8. 在玻璃高真空线适配器的肋端，将真空线连接到高真空泵上，并充分冷却真空陷阱（使用液氮或干冰/蛋酮等冷却剂）以凝结可能从晶体材料中蒸发的任何挥发性材料。打开高真空泵，确保从晶体中完全蒸发剩余的微量溶剂。
    9. 允许晶体在高真空下干燥至少1小时。从真空管/适配器中取出圆底烧瓶，关闭高真空泵，清理真空陷阱。
  2. 通过柱色谱净化程序
    1. 将醋酸处理后的反应混合物含量（从步骤 1.6）稀释 10 mL 的除离子水，并转移到分离漏斗中。在分离漏斗中加入 10 mL 的二氯甲烷。轻轻摇动和排出分离漏斗，以分离两层。
    2. 使用二氯甲烷（3 x 5 mL）的后续部分提取水层。结合有机分数和干燥使用无水娜2SO4。使用旋转蒸发器在减压下降低所有挥发性。
    3. 稀释从步骤 2.2.2 获得的残留物。与5mL的CH2Cl2。使用大约 75 克硅胶执行闪光柱色谱。用二氯甲烷中10%甲醇溶液将样品放出。
    4. 使用旋转蒸发器在减压下去除所收集的溶剂分数。使用大约 10 mL 的 CH 2 Cl2将固体残留物转移到25mL 圆底烧瓶中。使用旋转蒸发器在减压下去除溶剂。
    5. 在高真空下干燥剩余的固体残留物，如步骤 2.1.7 - 2.1.9 所述。

3. 摩尔吸收性获取和紫外线/视觉pK 模拟研究 16-25

  1. 为模拟 16-25创建紫外/维斯光谱光度测量复合库存解决方案。
    1. 称出所选二苯酮模拟的 10μmol（16 - 25），并将其添加到 10 mL 体积烧瓶中。
    2. 将DMSO添加到体积烧瓶上的10.0 mL标记。
      注意:如果化合物不能完全溶解，请使用热枪加热烧瓶，并根据需要搅拌烧瓶以完全溶解化合物。
  2. 在不同的pH值制作磷酸盐缓冲盐水（PBS）解决方案。这些模拟在 PBS 缓冲器中具有特征，其范围从 pH 到 4 到 15 不等。
    1. 使用 1 升体积圆柱体，通过在 900 毫升的除离子水中稀释 100 毫升 PBS （x100） 来创建 1 升 PBS 库存解决方案。
    2. 将准备好的 PBS 库存解决方案 （步骤 3.2.1） 的 50 mL 传输到 100 mL 烧嘴，并添加磁搅拌棒。然后使用校准的 pH 仪表来监控 pH 的变化，用水性 1.0 M NaOH（以获得 pH > 7.0）或 1.0 M HCl（以 pH < 7.0 获得缓冲）来标记 PBS 缓冲区。
      注意:为了获取导致明确定义的滴定曲线的数据，我们建议在预期拐点的 0.5 ± 内以 0.1 pH 单位的增量生成 pH 缓冲器，超出预期拐点。
  3. 获取 PBS （pH 7.0） 中的模拟 16 - 25 和 1.0 M NaOH （pH 14.0） 解决方案中的摩尔吸收光谱。
    1. 使用干净干燥的石英库维特准备"空白"，然后使用 100 - 1000 μL 微皮带将 PBS 库存解决方案 （pH 7.0） 或水性 1.0 M NaOH 添加到库维特中 2.0 mL。
      注意:对于空白解决方案数据采集过程的完整性非常重要，以确保 cuvette 解决方案中没有气泡，并使用 Kim 擦拭彻底擦拭库维特的两侧，以防止因小木屋外部的灰尘或碎屑而产生的光散射。如果气泡持续存在，轻轻反复地敲击铺在坚硬表面的纸巾上的绒布。
    2. 使用紫外/Vis光谱光度计，将所选解决方案空白，范围为 200 - 800 nm。
    3. 进入第二个干净干燥的石英库维特添加 2.00 mL 的 PBS （pH 7.0） 或 1.0 M NaOH （pH 14）， 然后 10μL 的二苯酮模拟（16 - 25）股票解决方案 （见步骤 3.1） 与 5-50 μL 微皮。在小面包上放置一个盖子，除倒置小面包外，还摇动良好。
      注意:样品溶液数据采集过程的完整性非常重要，以确保库维特溶液中没有气泡，并彻底擦拭库维特的两侧，用 Kim 擦拭以防止因小木屋外部灰尘或碎屑而产生的光散射。如果气泡持续存在，轻轻反复地敲击铺在坚硬表面的纸巾上的绒布。
    4. 使用紫外/维斯光谱光度计，获得200-800纳米范围内的二苯酮模拟溶液的吸收光谱。
    5. 在同一库维特中，添加额外的 10 μL 的二苯酮模拟库存解决方案，并重复步骤 3.3.3 和 3.3.4。
    6. 重复步骤 3.3.5，直到在 cuvette 中添加了总共 50 μL 的二苯酮模拟库存解决方案，以便获得至少 5 个激发波长的数据点。重复步骤 3.3.1 - 3.3.6，直到在 PBS （pH 7.0） 和 1.0 M NaOH 中获得 16 - 25 的所有股票解决方案。
  4. 使用最合适的线性回归分析，在 PBS （pH 7.0） 和 1.0 M NaOH 中获取 16 - 25 的摩尔吸附值。
    1. 使用图形程序（如 GraphPad 棱镜 7），绘制测量的吸收（y 轴）与二苯酮模拟浓度 （x 轴）。为五个绘图点创建最适合的线性回归分析。应观察到线性关系，统计分析应显示 R2 值≥ 0.98。
    2. 在PBS（pH 7.0）和1.0 M NaOH中重复步骤3.4.1，用于模拟16-25。
    3. 使用最佳拟合线性曲线的推断坡度值计算 PBS （pH 7.0） 和 1.0 M NaOH 中 16 - 25 的摩尔吸附率。
  5. 使用紫外线/视觉光谱光度测量确定pK 值 16 - 25 研究
    1. 进入干净干燥的石英库维特，使用 100 - 1000 μL 微皮带在选定的 pH 级别（以步骤 3.2 制备）转移 1，900 μL 的 PBS 缓冲器。
      注意:我们在存储时注意到，白色沉淀物可以在一些缓冲器中形成。为了确保缓冲区是完全同质的，如果任何沉淀物是可见的，使用重力过滤立即在使用前去除任何沉淀物。请参阅步骤 3.3.1 后的说明。
    2. 使用紫外/Vis光谱光度计，将选定的 PBS 缓冲解决方案空白，范围为 200 - 800 nm。
    3. 进入第二个干净干燥的石英库维特，转移所选 PBS 缓冲区的 1，900 μL，然后使用 5-50 μL 微皮带添加 100 μL 选定的模拟库存解决方案。在小面包上放置一个盖子，除倒置小面包外，还摇动良好。
      注:请参阅步骤 3.3.3 之后的前一个注释。
    4. 使用紫外/维斯光谱光度计，获得200-800纳米范围内的二苯酮模拟吸收光谱。
    5. 在第 3.2 步生成的每个 PBS 缓冲区中，重复步骤 3.5.1 - 3.5.4，用于 16 - 25。
  6. 使用最合适的西格莫伊达尔曲线拟合功能确定16 - 25的pK值。
    1. 使用图形程序，在不同的 pH 级别上绘制测量的吸收与波长 （nm） 的 16 - 25 图。
    2. 选择 380-415 nm 之间的波长，其中在较低的 pH 水平（< 7.0） 吸收度较小（0-0.1 单位）和较大的 pH（> 12.0）吸收性要大得多（0.8-1.0 单位）。绘制所选波长与pH的吸收度。
    3. 使用西格莫伊德曲线功能，为每个模拟 16-25生成一个最合适的曲线。在曲线的半高度报告推断的pH值。这是报告的pK值 。

4. 量子产量获取和荧光研究

  1. 创建荧光研究股票解决方案的二苯酮类比16-18和20-25。
    1. 使用步骤 3.1 中创建的二苯酮模拟库存解决方案，使用 2 - 20 μL 微皮瓣将库存溶液的 10 μL 添加到 1 mL 体积烧瓶中，然后将 PBS （pH 7.0） 缓冲区添加到 1 mL 标记中，从而稀释库存解决方案。在体积烧瓶上放置一个盖子，通过倒置和摇动烧瓶很好地混合。这种稀释的库存溶液将用于生成荧光光谱，并称为荧光库存溶液。
    2. 重复步骤4.1.1模拟16-18和20-25。
  2. 获得不同浓度的荧光发射光谱，用于 模拟16-18 和 20-25。对于 除 18以外的所有模拟，在 pH 7 和 14 溶液中获取 5 个光谱，浓度为:19.96、39.84、59.64、79.37 和 99.01 nM。对于模拟18，在pH7溶液中获取5个光谱，浓度为:49.75、99.01、147.8、196.1和243.9纳米。在pH14的解决方案中，获取5个光谱的模拟18浓度:99.01，196.1，291.3，384.6，476.2纳米。
    1. 放入透明四面石英卷中，使用 100-1，000 μL 微皮带在三个 1，000 μL 增量中添加 3.00 mL PBS （pH 7.0） 或 1.0 NaOH。
      注:请参阅步骤 3.3.1 后的注释。
    2. 使用荧光计和荧光计软件程序氟度，获取选定解决方案的排放光谱，并将此标记为解决方案"空白"。
    3. 对于同一个 cuvette，使用 0.5-10μL 微皮佩特为选定的二苯酮模拟（第 4.1 部分）添加 6 μL 荧光库存溶液。将帽子放在小面包上，通过倒置和轻轻摇动小面包很好地混合。
      注:请参阅步骤 3.3.3 后的注释。
    4. 使用荧光计，使用最大腹肌 作为激发波长 λ，获取选定化合物溶液的发射光谱。兴奋强度测量在200 nm范围内，起点为15nm，超过激发波长（荧光强度返回基线通常需要200纳米范围）。
    5. 重复步骤 4.2.3 - 4.2.4，直到总共 30 μL 的荧光库存溶液添加到 cuvette 中。
    6. 重复步骤 4.2.1 - 4.2.5 模拟 16 - 25 在 PBS （pH 7.0） 和 1.0 M NaOH.
      注:为模拟 18 更改了cuvette浓度，并使用:2.0 mL的PBS，连续5个10μL增量荧光库存溶液，用于中性（质子 18）溶液和2.0 mL的1.0 M NaOH，并添加5个20微L的复合库存解决方案增量，用于基本（脱质 18）溶液。
  3. 使用威廉斯、A.T.等人的方法确定量子产量
    1. 使用电子表格软件程序（即 Microsoft Excel），导入数据（排放强度数据点），用于单个二聚二苯酮模拟（采用 PBS [pH 7.0] 或 1.0 M NaOH）在不同浓度级别的排放光谱。
    2. 从排放光谱导入数据点，用于"空白"解决方案（步骤 4.2.1 - 4.2.2），并从不同浓度级别获得的相应波长的排放强度数据点中减去"空白"排放强度数据点。
    3. 将"空白"校正的排放强度数据点传输到绘图程序中，如图形Pad棱镜 7，以及绘图发射与波长。计算在二苯酮模拟的不同浓度水平上获得的每一条曲线的曲线下的区域。
    4. 按照Williwi斯（A.T.等人）概述的技术，计算每种不同浓度水平的二苯酮模拟的外推吸收值。这是通过乘以步骤 4.2.3-4.2.5 中使用的双苯酮模拟的每个浓度计算的摩尔吸收值（从最佳拟合线性回归分析，见步骤 3.4）来实现的。
    5. 使用图形程序（如 GraphPad Prism 7）创建模拟的外推吸收（x 轴）图，以对应于最大排放值的排放波长，针对每个浓度曲线下的计算区域（第 4.3.4 步）。应观察到与 r2 ≥ 0.96 的线性关系。
    6. 执行类似于 3.1-3.4 和 4.1-4.3.5 的步骤，在 0.5 M H2SO4 （ΦF = 0.55）18和乙醇中的无烟烷 （ΦF = 0.27）18，19获取标准数据。
    7. 使用以下方程中从步骤 4.3.5 和 4.3.6 获得的推断坡度，获得 PBS （pH 7.0） 中的 16 - 25 和 1.0 M NaOH 的量子收益率值:
      Φx =Φ街（格拉德x/ 格拉德街） （η2x/ η2街）
      其中Φ st 表示标准的量子产量，Φx表示未知的量子产量 ，Grad 是最佳线性拟合的斜率，η是所用溶剂的折射指数（折射率使用乙醇的η = 1.36 计算，η = 1.35 代表 0.5 M H2SO4）。
    8. 报告PBS（pH 7.0）和1.0 M NaOH中 16-18 和 20-25 的量子产量，作为奎宁和无烟素获得的Φx 的平均值。

结果

克莱森-施密特凝结反应提供了使用协议部分描述的单锅程序（见第1步）访问二苯酮类比（16-25，图4）。模拟16-25全部由凝结丙酮9，溴化物酮10，或异丙酮11与1H-伊米达佐尔-2-碳水化合物（12），产生1 H-伊米达佐尔-5-卡博卡尔醛（13）， 1H- 皮拉佐尔-3-卡?...

讨论

克莱森-施密特凝结方法提供了一个相当强大的手段，通过相对操作简单的协议产生苯丙酮、二甲苯酮和二苯酮氟。虽然荧光二苯酮类比的合成是本研究的重点，但应当指出，类似的条件可以应用于访问其他双环甲基苯丙酮环系统，如二苯酮23、24、25和苯丙酮-富兰辅音26以及 3H-pyrazol-3-一-furan 辅音

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

Z.R.W.和N.B感谢NIH（2P20GM103440-14A1）的慷慨资助，以及荣杰大学和内华达大学，拉斯维加斯，他们协助获得 1H和 13CNMR。此外，我们要感谢国家安全委员会视觉媒体学生，阿诺德·普莱森西亚-弗洛雷斯，奥布里·雅各布斯和阿利斯泰尔·库珀在本手稿的电影摄影部分的拍摄和动画过程中的帮助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-oneCombi-Blocks [766-36-9]Yellow solid reagent
isoindolin-1-oneArkPharm [480-91-1]Off-white solid reagent
5-bromoisoindolin-1-oneCombi-Blocks [552330-86-6]Pink solid reagent
2-formylimidazoleCombi-Blocks [10111-08-7 ]Off-white solid reagent
Imidazole-4-carbaldehydeArkPharm [3034-50-2]Solid reagent
1-H-pyrazole-4-carbaldehydeOakwood Chemicals [35344-95-7]Solid reagent
1-H-pyrazole-5-carbaldehydeMatrix Scientific [3920-50-1]Solid reagent
Solid KOH PelletsBeanTown Chemicals[1310-58-3]White solid pellets
Siliflash Silica GelScilicycleR12030BFine white powder
Phosphate Buffered Saline (PBS) (x10)GrowcellsMRGF-6235Colorless translucent liquid
Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spectrophotometer and SoftwareBeckman CoulterN/ASpectroscopy Instrument and Software
Fluoromax-4 SpectrofluorometerHoriba ScientificN/ASpectroscopy Instrument
FluorEssence Fluoremetry Software V3.5Horiba ScientificN/ASpectroscopy Software
Finnpipette II Micropipette (sizes: 100-1,000, 20-200, and 0.5-10 µL)FischerbrandN/AEquipment
Wilmad-LabGlass Rotary Evaporator (Model: WG-EV311-V-PLUS)SP SciencewareN/AEquipment
DuoSeal Vacuum Pump (Model Number: 1405)WelchN/AEquipment
GraphPad Prism 4GraphPadN/AData Analysis Software
SympHony pH Meter (Model: Sb70P)VWRN/AEquipment

参考文献

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